Knockdown estável de genes codificando proteínas matrizes extracelulares na linha célula do mioblasto C2C12 usando pequeno-hairpin (sh)RNA

Resumo

Fornecemos um protocolo para derrubar genes que codificam proteínas de matriz extracelular (ECM) em mioblastos C2C12 usando rNA de pino pequeno (sh). Visando o ADAMTSL2 como exemplo, descrevemos os métodos para a validação da eficiência de knockdown no nível mRNA, proteína e celular durante o mioblasto C2C12 à diferenciação do miotubo.

Resumo

As proteínas de matriz extracelular (ECM) são cruciais para o desenvolvimento muscular esquelético e homeostase. A derrubada estável da codificação de genes para proteínas ECM em mioblastos C2C12 pode ser aplicada para estudar o papel dessas proteínas no desenvolvimento muscular esquelético. Aqui, descrevemos um protocolo para esgotar a proteína ECM ADAMTSL2 como exemplo, usando rna de pino pequeno (sh) em células C2C12. Após a transfecção de plasmídeos shRNA, as células estáveis foram selecionadas em lote usando puromicina. Descrevemos ainda a manutenção dessas linhas celulares e a análise penópeica via expressão mRNA, expressão proteica e diferenciação C2C12. As vantagens do método são a geração relativamente rápida de células de knockdown C2C12 estáveis e a diferenciação confiável das células C2C12 em miotubos multinucleados após o esgotamento do soro no meio da cultura celular. A diferenciação das células C2C12 pode ser monitorada por microscopia de campo brilhante e medindo os níveis de expressão de genes marcadores canônicos, como MioD, miogenina ou cadeia pesada de miosina (MyHC) indicando a progressão da diferenciação do mioblasto C2C12 em miotubos. Em contraste com a derrubada transitória de genes com RNA de pequeno interferção (si), genes que são expressos mais tarde durante a diferenciação do C2C12 ou durante o amadurecimento do miotubo podem ser alvo de forma mais eficiente, gerando células C2C12 que expressam shRNA. Limitações do método são uma variabilidade nas eficiências de knockdown, dependendo da shRNA específica que pode ser superada usando estratégias de nocaute genético baseadas no CRISPR/Cas9, bem como potenciais efeitos fora do alvo do shRNA que devem ser considerados.

Introdução

As proteínas de matriz extracelular (ECM) fornecem suporte estrutural para todos os tecidos, mediam a comunicação celular-célula e determinam o destino celular. A formação e remodelação dinâmica do ECM são, portanto, fundamentais para manter a homeostase tecidual e órgão^1,2. Variantes patológicas em vários genes codificando proteínas ECM dão origem a distúrbios musculoesqueléticos com fenótipos que vão desde distrofias musculares até construção pseudomouscular^3,4. Por exemplo, variantes patogênicas em ADAMTSL2 causam a desordem musculoesquelética extremamente rara que a geleofísica, que apresenta com construção pseudomuscular, ou seja, um aumento aparente na massa muscular esquelética⁵. Juntamente com dados de expressão genética em camundongos e humanos, isso sugere um papel para ADAMTSL2 no desenvolvimento muscular esquelético ou homeostase^6,7.

O protocolo que descrevemos aqui foi desenvolvido para estudar o mecanismo pelo qual o ADAMTSL2 modula o desenvolvimento muscular esquelético e/ou homeostase em um ambiente de cultura celular. Derrubamos o ADAMTSL2 na linha de células mioblastos C2C12 murina. Os mioblastos C2C12 e sua diferenciação em miotubos é um modelo de cultura celular bem descrito e amplamente utilizado para diferenciação muscular esquelética e bioengenharia muscular esquelética^8,9. As células C2C12 passam por etapas distintas de diferenciação após a retirada do soro, resultando na formação de miotubos multinucleados após 3-10 dias na cultura. Essas etapas de diferenciação podem ser monitoradas de forma confiável medindo níveis de mRNA de genes marcadores distintos, como MyoD, miogenina ou cadeia pesada de miosina (MyHC). Uma vantagem de gerar knockdowns genéticos estáveis em células C2C12 é que genes que são expressos em estágios posteriores da diferenciação C2C12 podem ser direcionados de forma mais eficiente, em comparação com o knockdown transitório alcançado pelo RNA de pequeno interferência (si), que normalmente dura 5-7 dias após a transfecção, e é influenciado pela eficiência da transfecção. Uma segunda vantagem do protocolo como descrito aqui é a geração relativamente rápida de lotes de células de knockdown C2C12 usando seleção de puromicina. Alternativas, como o nocaute genético mediado crispr/cas9 ou o isolamento de precursores primários das células musculares esqueléticas de camundongos deficientes humanos ou genes-alvo são tecnicamente mais desafiadores ou requerem a disponibilidade de biópsias musculares do paciente ou camundongos deficientes de genes alvo, respectivamente. No entanto, semelhante a outras abordagens baseadas na cultura celular, há limitações no uso de células C2C12 como modelo para diferenciação de células musculares esqueléticas, como a natureza bidimensional (2D) da cultura celular configurada e a falta do microambiente in vivo que é fundamental para manter células musculares esqueléticas indiferenciadas¹⁰.

Protocolo

1. Preparando o DNA shRNA Plasmid de Escherichia coli

1. Geração de colônias bacterianas clonais carregando os plasmídeos shRNA
   1. Obtenha estoques de glicerol de E. coli carregando plasmídeos shRNA específicos para alvos e um plasmídeo de controle de fontes comerciais (Tabela de Materiais).
      NOTA: Foram utilizados três plasmídeos diferentes de shRNA, visando diferentes regiões da murina Adamtsl2 mRNA. Um shRNA foi selecionado para atingir a região 3'-untranslated (3'UTR) de Adamtsl2 para facilitar experimentos de resgate com plasmídeos de expressão codificando recombinante full-length ADAMTSL2 ou domínios de proteína ADAMTSL2 individuais. Além disso, um plasmídeo shRNA mexido foi incluído como um controle negativo. Detalhes das sequências shRNA são fornecidos na Figura 1A.
   2. Descongele o estoque de glicerol bacteriano shRNA à temperatura ambiente (RT). Transfira 10 μL de estoque de glicerol bacteriano em uma placa de agar Luria-Bertani (LB) suplementada com 100 μg/mL ampicillin (LB-Amp).
      NOTA: As placas LB-Amp são preparadas por autoclaving 1 L de lb médio (para 1 L: 10 g de triptone, 5 g de extrato de levedura, 10 g de NaCl, ajustar pH a 7.0) juntamente com 12 g de ágar. Deixe o meio esfriar até ~50 °C e adicione ampicillin (solução de estoque: 50 mg/mL em água estéril) a uma concentração final de μg/mL (LB-Amp agar). Despeje imediatamente ~20 mL de ágar LB-Amp em uma placa de Petri de 10 cm e deixe o ágar solidificar antes do uso. 1 L de agar LB-Amp é tipicamente suficiente para derramar cerca de 40 pratos petri de 10 cm. As placas de petri contendo agar LB-Amp estão estáveis por pelo menos um mês se armazenadas seladas a 4 °C no escuro.
   3. Espalhe bactérias com espátula drygalski estéril ou qualquer outro método apropriado para alcançar colônias bacterianas únicas. Incubar placas bacterianas de cabeça para baixo durante a noite a 37 °C.
2. Preparação plasmática
   1. Na manhã seguinte, remova a placa de Petri com as colônias bacterianas individuais e armazene a 4 °C para evitar o crescimento excessivo das colônias bacterianas e a formação de colônias de satélites. Selar a placa de Petri se for armazenada durante a noite ou mais.
   2. À tarde, adicione 5 mL de meio LB-Amp em um tubo de cultura bacteriana de polipropileno. Selecione uma única colônia bacteriana da placa de Petri cultivada durante a noite com uma ponta de pipette e inocular lb-amp meio, ejetando a ponta pipette no tubo de cultura bacteriana contendo o meio LB-Amp.
   3. Incubar a cultura bacteriana durante a noite em um shaker a 250 rpm a 37 °C com a tampa vagamente presa para permitir a aeração.
   4. Tire o tubo de cultura bacteriana na manhã seguinte e mantenha-se a 4 °C para evitar o crescimento excessivo bacteriano. À tarde, resuspenda bactérias por vórtice e transfira 1 mL da cultura bacteriana durante a noite em 50 mL de meio LB-Amp em um frasco conical de 250 mL. Incubar durante a noite em um shaker a 250 rpm a 37 °C.
   5. Na manhã seguinte, transfira bactérias para um tubo de centrífuga descartável de 50 mL e bactérias centrífugas a 6.000 x g na RT por 15 min. Remova o meio e continue com a etapa 1.2.6.
      NOTA: Se o DNA plasmídeo não puder ser isolado imediatamente, remova o meio LB-Amp após a etapa de centrífuga e armazene a pelota de bactérias a -20 °C.
   6. Siga as instruções para o kit de preparação plasmática (escala midi) para extrair o DNA plasmídeo da bactéria. Avalie a qualidade do DNA plasmático medindo a razão A₂₆₀/A₂₈₀ usando um espectrofotômetro.
      NOTA: Uma proporção A₂₆₀/A₂₈₀ de >1.8 é desejável, indicando alta pureza da preparação do DNA plasmídeo. Uma proporção A₂₆₀/A₂₈₀ mais baixa sugere contaminação com proteína ou remoção insuficiente de reagentes de extração. Podem ser necessárias medidas adicionais de purificação plasmídea.

2. Culturing e Transfecção de C2C12 Células e Seleção de Puromicin

1. Cultura celular C2C12
   1. Descongele as células C2C12 (Tabela de Materiais) rapidamente em um banho de água de 37 °C e despeje células em tubo de centrífuga descartável estéril contendo 8 mL do meio de Águia modificado de Dulbecco (DMEM) complementado com 100 unidades de penicilina e antibióticos de estreptomicina (DMEM livre de soro) em uma capa de cultura celular. Células centrífugas por 3 min a 160 x g na RT.
   2. Supernatant aspirado e resuspender a pelota celular em 10 mL de DMEM sem soro complementado com soro bovino 10% fetal (FBS) (DMEM completo). Transferir células para 10 cm de cultura de tecido tratados pratos plásticos tratados. Incubam células em uma incubadora umidificada a 37 °C em uma atmosfera de CO₂ de 5%.
   3. No dia seguinte, substitua o meio por DMEM completo fresco.
   4. Expanda as células C2C12 de passagem baixa em pratos de 3-4 10 cm. Quando as células C2C12 atingem de 50 a 60% de confluência, aspiram as células Média e Enxágüe C2C12 com 10 mL de salino tampão de fosfato (PBS).
   5. Adicione 1 mL de 0,25% de trypsin-EDTA e incuba raste por 2 min no RT. Monitore o desprendimento celular um microscópio e amplie o tempo de incubação, se necessário, até que a maioria das células sejam separadas.
      NOTA: Tocar cuidadosamente o prato pode ajudar a desalojar as células.
   6. Quando a maioria das células são separadas, adicione 10 mL de DMEM completo ao prato, pipeta o volume para cima e para baixo várias vezes, e transferir suspensão celular para um tubo de centrífuga descartável estéril de 15 mL. Células centrífugas por 3 min a 160 x g no RT. Aspirar supernatant e resuspender a pelota celular em 2 mL de meio congelante (10% sulfoxide de dimetila [DMSO]/90% FBS).
   7. Transfira duas alíquotas de 1 mL por prato de 10 cm em crioviais. Incubar em um recipiente de congelamento de células cheio de isopropanol RT por pelo menos 24 h em um freezer de -80 °C resultando em uma taxa de congelamento de cerca de -1 °C por min para evitar a formação de cristais de gelo. Armazene células para uso a longo prazo na fase vapor de nitrogênio líquido.
      NOTA: O fornecedor recomenda o uso de células C2C12 até a passagem número 15. As experiências dos autores também mostraram que as células de menor número de passagem apresentaram diferenciação mais consistente e rápida em miotubos. É essencial manter células C2C12 em baixa densidade celular (<50% confluência) para evitar o início prematuro da diferenciação. Diferenciar ou diferenciar células C2C12 não pode ser revertida para o estado original do mioblasto e deve ser descartada.
2. Preparando células C2C12 para transfecção
   1. Células C2C12 indiferenciadas de cultura em um prato de 10 cm até atingirem 50-60% de confluência. Aspirado ao meio, enxágue células C2C12 com 10 mL de PBS, e adicione 1 mL de 0,25% de trypsin-EDTA. Incubar por 2 min na RT, monitorar o desprendimento celular um microscópio e estender o tempo de incubação, se necessário, até que a maioria das células sejam separadas.
      NOTA: Tocar cuidadosamente o prato pode ajudar a desalojar as células.
   2. Quando a maioria das células forem separadas, adicione 10 mL de DMEM completo ao prato e transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga descartável estéril de 15 mL. Células centrífugas por 3 min a 160 x g no RT. Aspirar supernatant e resuspender a pelota celular em 4 mL de DMEM completo.
   3. Combine 10 μL de suspensão celular com 10 μL de azul trypan em um tubo de reação de 1,5 mL, misture canalizando para cima e para baixo e cuidadosamente mexendo o tubo de reação e transfira as células para um slide de contagem. Determine o número/mL da célula usando um contador de celular automatizado.
   4. Diluir células C2C12 para 50.000 células/mL e sementes 100.000 células (2 mL) por poço em uma placa de 6 poços para alcançar cerca de 40-50% de confluência após a incubação durante a noite. Incubam células em uma incubadora umidificada a 37 °C em uma atmosfera de CO₂ de 5%.
3. Transfecção de células C2C12 com o plasmídeo shRNA utilizando polietilenina (PEI) e seleção de puromicina
   1. Preparação da solução de ações pei
      1. Dissolva 16 mg de PEI em 50 mL de água destilada estéril (concentração de solução de estoque: 0,32 mg/mL) em uma garrafa de 50 mL com uma tampa de parafuso. Incubar a solução a 65 °C para 1 h e vórtice a solução vigorosamente várias vezes durante o período de incubação para dissolver completamente o PEI.
      2. Ajuste para pH 8 adicionando 15 μL de 1N HCl por 50 mL.
         ATENÇÃO: O HCl é corrosivo. O HCl concentrado deve ser manuseado o capô da fumaça. Os investigadores devem usar equipamentos de proteção pessoal apropriados.
      3. Congele a solução PEI em -80 °C por 1 h com uma tampa frouxamente presa e descongele rapidamente a 37 °C em um banho de água para aumentar ainda mais a solubilidade. Repita o ciclo de degelo congelante 3x.
      4. Armazene a solução de estoque PEI em alíquotas de 0,5 mL para uso único a -20 °C.
   2. Transfecção de células C2C12
      1. Combine 25,5 μL (DNA plasmídeo de 8,5 μL/μg) da solução de estoque PEI com 100 μL de 25 mM NaCl em um tubo de reação de 1,5 mL e incubar por 5 min a 37 °C. Combine 3 μg do DNA plasmídeo com 100 μL de 25 mM NaCl e incubar por 5 min a 37 °C.
      2. Combine todo o volume de reagente PEI diluído com o plasmídeo diluído e misture, encando suavemente para cima e para baixo. Incubar por 25 min a 37 °C.
      3. Durante o tempo de incubação, altere o meio das células C2C12 destinadas à transfecção para DMEM sem FBS ou antibióticos.
      4. Adicione a mistura de transfecção PEI/DNA às células C2C12, queda por gota e misture constantemente movendo cuidadosamente o prato de cultura celular. Incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C em uma atmosfera de CO₂ de 5%. Depois das 6h, mude o meio para o DMEM completo.
   3. Seleção de puromitina
      1. 24 h após a transfecção, altere médio para meio de seleção (DMEM completo mais 5 μg/mL puromycin). Continue a seleção de puromicina até que sejam obtidas células C2C12 resistentes à puromicina, que normalmente leva de 10 a 14 dias.
      2. Expanda as células C2C12 resistentes à puromicina em baixa densidade celular (<50-60% confluência), ou seja, para manter o estado indiferenciado e criopreservação de 6-10 frascos para experimentos futuros descritos nas etapas 2.1.4-2.1.7.
         NOTA: Mantenha células C2C12 resistentes à puromicina na presença de 5 μg/mL puromicina para cultura celular de rotina e expansão. No entanto, a puromicina foi omitida nos experimentos de diferenciação.

3. Análise phenotipica da diferenciação c2C12

NOTA: Os métodos descritos abaixo podem ser facilmente adaptados para análise penotilípica geral da diferenciação do mioblasto C2C12 em miotubos, variando os anticorpos específicos usados na mancha ocidental ou os primers específicos do gene usados na polímerase quantitativa análise de reação em cadeia (qPCR).

1. Protocolo de diferenciação C2C12 e microscopia de campo brilhante
   1. Sementes 150.000 células/bem em uma placa de 12 poços. Células estáveis C2C12 resistentes à puromicina em uma placa de 12 poços em meio de seleção em uma incubadora umidificada a 37 °C em uma atmosfera de CO₂ de 5%. Células C2C12 culturais em DMEM completo até atingirem ~95% de confluência.
   2. Para induzir a diferenciação das células C2C12, substitua o DMEM completo por DMEM sem soro (dia 0 de diferenciação). Mude o meio a cada dois dias e siga a formação do miotubo C2C12 usando um microscópio de campo brilhante invertido com câmera.
      NOTA: Muitos protocolos usam 2% de soro de cavalo para diferenciar células C2C12 em miotubos. Nas mãos dos autores, remover o soro teve um efeito semelhante. A insulina é descrita como um aditivo ao meio de cultura celular para acelerar a diferenciação de C2C12. No entanto, no protocolo atual, as células C2C12 se diferenciavam de forma confiável em miotubos dentro de 3 a 5 dias após a privação de soro e a adição de insulina ser considerada desnecessária.
2. Imunostainamento da cadeia pesada de miosina (MyHC) para visualizar miotubos
   1. Sementes 50.000 células C2C12 resistentes à puromicina por câmara em um deslizamento de 8 poços em 500 μL de DMEM completo. Células culturais até atingirem 95% de confluência em DMEM completo (cerca de 24 h).
   2. Para induzir a diferenciação, mude de DMEM completo para 500 μL de DMEM soro livre de soro (dia 0 de diferenciação). No ponto de tempo desejado, aspirar as células médias e enxágüe 3x com 0,5 mL de PBS.
      NOTA: Realize todas as etapas seguintes na RT.
   3. Fixar células com 0,2 mL de 4% paraformaldeído (PFA) diluído na PBS por 15 min. Células enxágüe com 0,5 mL de PBS 3x para 5 min cada.
      ATENÇÃO: PfA é perigoso. Tome as precauções apropriadas e descarte a solução paraformaldeído como resíduos perigosos.
   4. Apagar PFA com 0,2 mL de 0,5 M de glicina na PBS para 5 min. Células enxágüe com 0,5 mL de PBS 3x por 5 min cada.
   5. Células incubadas com 0,2 mL de 0,1% surfactante/detergente não iônico(Tabela de Materiais) na PBS por 10 min para permeabilizar a membrana celular. Bloqueie com 0,2 mL de 5% de albumina de soro bovino na PBS para 1h. Células enxágüe com 0,5 mL de PBS 3x por 5 min cada.
   6. Incubar células com 0,2 mL de anticorpo MyHC (1:200 em PBS) para 2 h. Células de enxágüe com 0,5 mL de PBS 3x para 5 min cada.
   7. Células incubadas com 0,2 mL de células secundárias conjugadas de cabra-anti-rato (1:200 na PBS). Enxágüe células com 0,5 mL de PBS 3x por 5 min cada.
   8. Após a remoção quantitativa do PBS, adicione uma gota de meio de montagem contendo 4′,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) por câmara. Deslizamento de cobertura e cura meio de montagem de acordo com as instruções do fabricante. Selar com esmalte.
   9. Observe as células C2C12 usando um microscópio de fluorescência usando o conjunto de filtro apropriado.
3. Avaliando a eficiência do knockdown por reação quantitativa da cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR)
   1. Células C2C12 de cultura em condições de diferenciação em 12 placas de poço, conforme descrito na seção 3.1.
   2. No ponto de tempo desejado,remova o meio de diferenciação, enxague as células uma vez com 1 mL de PBS e adicione 0,5 mL de reagente de extração de RNA(Tabela de Materiais) por poço. Lise as células, canalizando cuidadosamente para cima e para baixo e transfira o lysato celular para um tubo de reação estéril de 1,5 mL. Isole o RNA seguindo cuidadosamente o protocolo do fabricante.
      ATENÇÃO: O reagente de extração de RNA contém fenol. Deve ser usado um capô de fumaça. Recolher os resíduos de reagente de extração de RNA e descartar como resíduos perigosos. Os investigadores devem usar equipamentos de proteção pessoal apropriados.
   3. Dissolva a pelota rna final em 20 μL de pirocarbonato diethyl (DEPC)-tratada. Determine a quantidade e a qualidade da preparação do RNA usando um espectrômetro e determine a razão_{A 260/A280} como medida de qualidade.
      NOTA: Um rendimento típico de 1 poço de uma placa de 12 poços é de 5-7 μg de RNA total com uma razão A₂₆₀/A₂₈₀ de 1,8-2.
   4. Para digerir DNA genômico copurificado residual, diluir 1 μg de RNA em um volume total de 8 μL de água tratada com DEPC em um tubo PCR. Adicione 1 μL de tampão de reação de 10x e 1 μL de DNase I (1 unidade/μL)(Tabela de Materiais)e incubar por 15 min na RT. Adicionar 1 μL de solução de parada (25 mM EDTA) e incubar a 70 °C por 10 min.
   5. Para gerar cDNA, misture 10 μL de RNA tratado de DNase com 10 μL de mistura master de transcrição reversa de 2x, contendo a transcrição reversa, primers aleatórios, mistura de dNTP de 4 mM (1 mM cada de dATP, dTTP, dGTP e dCTP), e buffer de reação transcritose reversa. Incubar a reação em um termociclo usando o programa conforme recomendado pelo fabricante. Diluir cDNA com água em uma proporção de 1:5.
   6. Para preparar a reação qRT-PCR, misture 5 μL do mix mestre qPCR verde SYBR com 0,5 μL de primers dianteiros e reversos específicos de genes (estoque: 10 μM), respectivamente, e 2 μL de água tratada com DEPC por reação. Pipette qPCR reação em um poço de uma placa qRT-PCR de 96 poços e adicionar 2 μL de cDNA diluído. Configure três réplicas técnicas para cada replicação biológica e inclua um gene de limpeza como Gapdh ou Hprt1.
   7. Amplificar o produto PCR com um termociclo qRT-PCR utilizando o seguinte programa: 50 °C para 2 min (uracil-DNA glicosilase [UDG]), 95 °C para 2 min (ativação de polimererase de DNA dual-lock), 40 ciclos de 95 °C para 15 s, 60 °C para 30 s e 72 °C para 1 min.
   8. Quantifique os resultados qRT-PCR usando o método DDCt normalizando para um gene de limpeza, como Gapdh ou Hprt1.
4. Avaliando a eficiência do knockdown por manchas ocidentais
   1. Sementes 300.000 células C2C12 resistentes à puromicina por poço em uma placa de 6 poços para análise de manchas ocidentais. Após 24 h, mude o DMEM médio para soro livre de soro para iniciar a diferenciação (dia 0 de diferenciação).
   2. No ponto de tempo desejado, colete dois 1 mL de meio condicionado sem soro em um tubo de reação de 1,5 mL e centrífuga por 5 min a 500 x g no RT para remover células separadas e detritos celulares.
      NOTA: Este passo só é necessário se forem investigadas proteínas ECM ou outras proteínas secretadas em meio sedide. Se a proteína de interesse for localizada no citoplasma ou estiver vinculada à membrana, aspirar o meio de cultura celular e prosseguir com as etapas de lise celular (3.4.7-3,4,12). A lise celular deve ser realizada paralelamente à precipitação proteica do meio condicionado sem soro para minimizar a degradação proteolítica e outras consequências não intencionais do armazenamento prolongado da camada celular.
   3. Após a centrífuga, transfira 1 mL de meio condicionado em um novo tubo de reação de 1,5 mL e precipitar proteínas adicionando 0,391 mL de uma mistura de ácido tricotoáceo (TCA) e surfactante/detergente não iônico. Brevemente vórtice a mistura e incubar por 10 min no gelo.
      NOTA: Prepare a mistura de precipitação proteica diretamente antes do uso combinando 0,252 mL de 55% TCA e 0,139 mL de 1% surfactante/detergente não iônico por mL de médio e vórtice condicionado brevemente. A solução se torna turva.
      ATENÇÃO: O TCA é corrosivo e deve ser tratado adequadamente.
   4. Pelotas as proteínas precipitadas em >16.000 x g por 10 min a 4 °C. Descarte o supernatante.
      ATENÇÃO: O supernatante contém TCA e deve ser coletado separadamente e descartado como material perigoso.
   5. Lave a pelota de proteína 3x com acetona gelada e centrífuga cada vez em >16.000 x g por 10 min a 4 °C.
   6. Seque o ar da pelota de proteína por 3-4 min na RT e dissolva-se em 50 μL de 1x sódio do sulfato de poliacrilamida eletroforreise gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) tampão amostral (50 mM Tris pH 6.8, 2% SDS, glicerol de 6% e 0,004% bromophenol azul, complementado com 5 β% mercaptoetanol). Ferva a amostra de 5 min a 95 °C e use para manchas ocidentais para detectar a proteína-alvo desejada usando procedimentos padrão.
      ATENÇÃO: o β-Mercaptoetanol é odoroso e tóxico e deve ser manuseado em um capô de fumaça.
   7. Para proteínas intracelulares e ligadas à membrana, enxágue a camada celular uma vez com 2 mL de PBS.
   8. Adicione 1 mL de PBS e desalojando células raspando-as do poço usando um raspador de celular. Colete células em um tubo de reação de 1,5 mL e centrífuga em 3.420 x g por 3 min a 4 °C. Lave a pelota de célula 3x com 1 mL de PBS e centrífuga a 3.420 x g por 3 min a 4 °C cada vez.
   9. Para seder as células, resuspender a pelota celular em 0,2 mL de tampão de lise (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM Na₂EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP40, 1% dedesoxilárica de sódio, 2,5 mM pirofosfato de sódio, 1 mM β-glicêfosphate e 1 mM ortovanadate de sódio) complementado com 1x edta inibidor inibidor de protease reagente e incubato por 30 min no gelo.
   10. Ultrassônico para 15 s no gelo com uma configuração de saída de potência de 10 em uma frequência operacional de 23 kHz.
   11. Remova os detritos das células por centrífuga em 13.680 x g por 20 min a 4 °C. Colete supernatant em um novo tubo de reação de 1,5 mL e determine a concentração de proteínausando um ensaio comercial de Bradford ou qualquer outro método adequado.
   12. Para cada amostra, misture 100 μg de proteína com 5x sds-PAGE tampão de amostra em um volume total de 60 μL e ferva por 5 min a 95 °C. Analisar amostras por procedimentos padrão de coagulação ocidental para a presença da proteína-alvo desejada.

Resultados

A seleção de C2C12 resistente à puromicina pode ser alcançada em 10-14 dias após a transfecção devido à eliminação eficiente de células não resistentes, ou seja, não transfecdas(Figura 1B). Normalmente, mais de 80% das células se desprendem da cultura celular e essas células são removidas durante a manutenção de células rotineiras. As células C2C12 resistentes à puromicina expressando o controle (mexido) shRNA mantêm a morfologia celular alongada em for...

Discussão

Descrevemos aqui um protocolo para o knockdown estável das proteínas ECM em mioblastos C2C12 e para análise fenotipico da diferenciação dos mioblastos C2C12 em miotubos. Vários fatores determinam o resultado do experimento e precisam ser considerados com cuidado. Manter células C2C12 na fase proliferante é um passo fundamental para manter as células C2C12 no estado precursor do mioblasto. Manter a capacidade das células C2C12 de diferenciar consistentemente em miotubos depende i) do número de passagem das cél...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Fisher Chemical	191784
Agar	Fisher Bioreagents	BP1423
Ampicillin	Fisher Bioreagents	BP1760-5
Automated cell counter Countesse II	Invitrogen	A27977
Bradford Reagent	Thermo Scientific	P4205987
C2C12 cells	ATCC	CRL-1772
Chamber slides	Invitrogen	C10283
Chloroform	Fisher Chemical	183172
DMEM	GIBCO	11965-092
DMSO	Fisher Bioreagents	BP231-100
DNase I (Amplification Grade)	Invitrogen	18068015
Fetal bovine serum	VWR	97068-085
GAPDH	EMD Millipore	MAB374
Glycine	VWR Life Sciences	19C2656013
Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW)	Li-Cor	C90130-02
Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red)	Jackson Immune Research	133389
HCl	Fisher Chemical	A144S
Incubator (Shaker)	Denville Scientific Corporation	1704N205BC105
Mercaptoethanol	Amresco, VWR Life Sciences	2707C122
Midiprep plasmid extraction kit	Qiagen	12643
Myosin 4 (myosin heavy chain)	Invitrogen	14-6503-82
Mounting medium	Invitrogen	2086310
NaCl	VWR Life Sciences	241
non-ionic surfactant/detergent	VWR Life Sciences	18D1856500
Paraformaldehyde	MP	199983
PBS	Fisher Bioreagents	BP399-4
PEI	Polysciences	23966-1
Penicillin/streptomycin antibiotics	GIBCO	15140-122
Petridishes	Corning	353003
Polypropylene tubes	Fisherbrand	149569C
Protease inhibitor cocktail tablets	Roche	33576300
Puromycin	Fisher Scientific	BP2956100
PCR (Real Time)	Applied Biosystems	4359284
Reaction tubes	Eppendorf	22364111
Reverse Transcription Master Mix	Applied Biosystems	4368814
RIPA buffer	Thermo Scientific	TK274910
sh control plasmid	Sigma-Aldrich	07201820MN
sh 3086 plasmid	Sigma-Aldrich	TRCN0000092578
sh 972 plasmid	Sigma-Aldrich	TRCN0000092579
sh 1977 plasmid	Sigma-Aldrich	TRCN0000092582
Spectrophotometer (Nanodrop)	Thermo Scientific	NanoDrop One C
SYBR Green Reagent Master Mix	Applied Biosystems	743566
Trichloroacetic acid	Acros Organics	30145369
Trizol reagent	Ambion	254707
Trypan blue	GIBCO	15250-061
Tryptone	Fisher Bioreagents	BP1421
Trypsin EDTA 0.25%	Gibco-Life Technology Corporation	2085459
Water (DEPC treated and nuclease free)	Fisher Bioreagents	186163
Western blotting apparatus	Biorad	Mini Protean Tetra Cell
Yeast extract	Fisher Bioreagents	BP1422