Identificação de Armadilhas Extracelulares De Neutrófilos em Trombo Arterial Felino Embutido parafina usando Microscopia de Imunofluorescência

Resumo

Descrevemos um método para identificar armadilhas extracelulares (NETs) em trombo cardiogênico felino fixo e parafinado de parafina usando recuperação de antígeno induzido pelo calor e um protocolo de rotulagem de dupla imunorotulagem.

Resumo

Armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), compostas de DNA livre de células (cfDNA) e proteínas como histonas e elastase de neutrófilos (NE), são liberadas por neutrófilos em resposta a inflamações sistêmicas ou patógenos. Embora os NETs tenham sido mostrados anteriormente para aumentar a formação de coágulos e inibir a fibrinolise em humanos e cães, o papel dos NETs em gatos com tromboembolismo arterial cardiogênico (CATE), uma complicação de risco de vida secundária à cardiomiopatia hipertrófica , é desconhecido. Um método padronizado para identificar e quantificar os NETs em trombos arteriais cardiogênicos em gatos avançará nossa compreensão de seu papel patológico no CATE. Aqui, descrevemos uma técnica para identificar NETs em trombos fixados em formaldeído e parafina dentro da bifurcação aórtica, extraídos durante a necropsia. Após a deparafinação com xileno, as seções aórticas foram submetidas à recuperação indireta de antígenos induzidos pelo calor. As seções foram então bloqueadas, permeabilizadas e ex-vivo NETs foram identificadas por colocalização de DNA livre de células (cfDNA), histona citrubilada H3 (citH3) e elastase neutrófilo (NE) utilizando microscopia de imunofluorescência. Para otimizar a imunodetecção de NETs em trombos, a autofluorescência dos elementos teciduais foi limitada por meio de um processo de saciedade de autofluorescência antes da microscopia. Essa técnica pode ser uma ferramenta útil para estudar NETs e trombose em outras espécies e oferece novas percepções sobre a fisiopatologia dessa condição complexa.

Introdução

Gatos com cardiomiopatia hipertrófica correm o risco de complicações tromboembólicas com risco de vida^1,2. Apesar da alta morbidade e mortalidade associada ao tromboembolismo arterial cardiogênico felino (CATE), a fisiopatologia subjacente da CATE em gatos é mal compreendida. Existem também ferramentas diagnósticas e terapêuticas limitadas para tratar e identificar gatos em risco desta condição devastadora³.

Além de seu papel na imunidade inata, os neutrófilos têm mostrado desempenhar um papel na trombose, liberando armadilhas extracelulares de neutrófilos (NE), que são redes semelhantes à web de DNA livre de células (CFDNA) incrustadas com histones e proteínas granulares como elastase neutrófilo (NE) e mieloperoxidase. Os neutrófilos são submetidos à formação de NETs em resposta à inflamação sistêmica, encontro direto com patógenos e interação com plaquetas ativadas^4,5,6,7. Em cães, o DNA derivado de neutrófilos tem sido mostrado para inibir a lise do coágulo, enquanto as proteínas NET aceleram a formação de coágulos. A capacidade dos NETs de prender células circulantes e componentes de coagulação também é fundamental para suas propriedades trombogênicas^{8,,9,,10,,11,,12}.

Os NETs são detectados pela colocalização de proteínas neutrófilos extracelulares, histonas e cfDNA. Por isso, a identificação e quantificação de NETs em tecidos fixos por imunofluorescência de tecidos desparafinados é superior à hematoxilina tradicional e eosina (H&E) usando microscopia de campo brilhante^4,5. Vários estudos em humanos utilizando microscopia de imunofluorescência identificaram os NETs como componentes estruturais do trombo arterial coronário, trombos de derrame cerebral, atherothrombose e trombosve venoso^{13,14,15,16,17}. Até o momento, não foi descrito um método padronizado para detectar e quantificar OS TNS no trombo felino. Como a identificação de NETs no trombo arterial cardiogênico felino pode facilitar futuras pesquisas translacionais em NETs e trombose, descrevemos técnicas de identificação e avaliação de NET em trombos arterial sinuosa embutida em parafina em gatos.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram executados de acordo com as diretrizes do Comitê de Cuidado e Uso de Animais Institucionais da Universidade da Califórnia, Davis. Necropsias e biópsias de tecidos foram realizadas com o consentimento dos proprietários.

1. Fixação de tecidos, incorporação e secção

1. Dissecar a bifurcação aórtica, incluindo a aorta descendente, a artéria femoral e as artérias ilíacas comuns(Figura 1A),logo após a eutanásia humana ou a morte. Dissecar a fáscia(Figura 1B)antes de submergir completamente em formalina tamponada neutra por um mínimo de 24 h e não mais do que 48 h.
2. Para desidratar a amostra, primeiro mergulhe em formalina tamponada 10% aquecida a 37 °C por 1 h. Em seguida, submersão em concentrações crescentes de etanol aquecido a 37 °C (70%, 95%, 100%) 2x para 1h cada. Por fim, sem enxaguar, submersão 2x em 100% de tolueno aquecido a 37 °C por 1 h cada.
3. Adicione a parafina aquecida a 62 °C e deixe a parafina solidificar completamente durante a noite.
4. Seção 2-3 μm do tecido embutido parafina usando um microtome e coloque em lâminas de vidro positivamente carregadas. Armazene tecidos seccionados a -80 °C até análise suplementar.

2. Deparafinação, reidratação e recuperação de antígenos induzidos pelo calor

1. Para realizar a deparafinação e a reidratação de seções em lâminas de vidro, coloque lâminas de vidro em racks e processe na seguinte ordem:
   1. Mergulhe completamente em 100% de xileno por 3 min. Repita esta etapa 2x. Não enxágue entre as etapas.
   2. Submergir completamente em concentrações decrescentes de etanol (100%, 95%, 70%) à temperatura ambiente (RT), 3x para 3 min cada. Não enxágue entre as etapas.
   3. Mergulhe completamente em água desionizada por 2 min. Repita.
2. Coloque as seções em salina tamponada tris com 0,1 % tween (TBST, pH = 7,6) para 2-3 min.
3. Encha o reservatório com água desionizada aquecida a 100 °C. Deixe a câmara a vapor equilibrar por 20 min.
   NOTA: A recuperação de antígenos induzida pelo calor é melhor realizada com aquecimento indireto gerado por um vapor com uma configuração de temperatura predefinida, como um vapor de alimentos.
4. Aqueça a solução de recuperação de antígenos comercialmente disponível contendo Tris e EDTA (pH = 9) a 95-97 °C em uma placa quente controlada pela temperatura com agitação constante. Certifique-se de que não ferva.
   NOTA: A solução deve ficar nublada assim que estiver aquecida.
5. Despeje a solução de recuperação de antígeno aquecido em um recipiente de slides e coloque o recipiente na câmara do vapor. Permita que a solução de recuperação de antígenos equilibre a temperatura do vapor por 3-4 min. Certifique-se de que a temperatura da câmara é de ~95 °C.
6. Mergulhe as lâminas completamente na solução de recuperação de antígenos aquecidos e continue a aplicação de aquecimento externo através do vapor por 20 min.
7. Remova o recipiente de slides do vapor e permita que os slides e a solução de recuperação de antígenos esfriem até RT. Armazene a solução de recuperação de antígeno diluído a 4 °C e reutilize até 2x, se necessário.
8. Lave os slides 3x com TBST por 5 min.

3. Saqueação de imunorotulagem e autofluorescência

NOTA: A Tabela 1 detalha a composição dos buffers de bloqueio utilizados nas etapas seguintes.

1. Incubar seções no Buffer de bloqueio 1 por 2 h em RT balanço suave (30-50 rpm). Selar com filme de parafina para evitar secagem.
2. Sem lavar, aplique imediatamente 100 μL de anticorpo de histona policlonal policlonal de coelho diluído H3 (citH3) (0,03 mg/mL diluído no tampão de bloqueio 1) diretamente no slide.
3. Coloque um deslizamento de cobertura (24 mm x 40 mm x 0,13-0,17 mm) em cada seção para permitir a distribuição uniforme da mistura de anticorpos.
4. Incubar por 12-16 h a 4 °C com balanço suave (30-50 rpm). Vedação com filme de parafilme para evitar secagem.
5. Lave 3x com TBST por 5 min.
6. Aplique 100 μL de anticorpo anti-coelho de cabra conjugado com alexa fluor 488 (diluído a uma concentração final de 0,04 mg/mL ou 1:50 no Buffer de Bloqueio 1) conforme descrito na etapa 3.3. Incubar por 1 h em RT balanço suave (30-50 rpm). Proteja os slides da luz.
7. Lave com TBST 3x por 5 min.
8. Incubar seções no Buffer de bloqueio 2 durante a noite a 4 °C balanço suave (30-50 rpm). Proteja-se da luz.
9. Lave com TBST 3x por 5 min.
10. Bloquear seções no Buffer de Bloqueio 3 conforme descrito na etapa 3.3 em RT por 2 h balanço suave (30-50 rpm).
11. Incubar seções com anticorpo anti-ne anti-humano do coelho policlonal biotinylado (concentração final = 0,2 μg/mL no Buffer de Bloqueio 3) a 4 °C por 12-16 h conforme descrito nos passos 3.2-3.4.
12. Lave com TBST 3x por 5 min.
13. Incubar com Alexa Fluor 594 streptavidin conjugado (diluir a 1:100 ou 0,02 mg/mL no Buffer de Bloqueio 3) conforme descrito nas etapas 3.2-3.3 por 1 h no RT. Proteja-se da luz e lacre com parafina para evitar a secagem.
14. Lave com TBST 1x por 5 min.
15. Aplique 100 μL de mistura de solução de saciedade de autofluorescência diretamente nas seções por 1 min, conforme instruído pelo fabricante.
16. Lave imediatamente os slides com TBST 6x por 10 min.
17. Cubra cada slide com 100 μL de DAPI de 300 nM por 5 min no escuro.
18. Lave com TBST por 3 min. Repita isso por um total de 5x.
19. Aplique uma gota (~50 μL) de meio de montagem antifade, parte do kit de saciedade de autofluorescência, diretamente sobre o escorregador de vidro ao redor da seção. Coloque um deslizamento de cobertura (24 mm x 40 mm x 0,13-0,17 mm) suavemente sobre a seção sem criar bolhas.
20. Permitir que as amostras se curem durante a noite no escuro a 4 °C até que o meio de montagem tenha endurecido para análise microscópica com lentes de imersão.

4. Identificação de armadilha extracelular de neutrófilo

NOTA: O protocolo a seguir utiliza um microscópio de epifluorescência invertido com uma câmera CCD digital 1.280 x 960 (ver Tabela de Materiais).

1. Para localizar trombos, escaneie cranicamente ao longo do comprimento da aorta, bifurcação aórtica e cada artéria femoral usando microscopia de contraste de fase com um objetivo de 10x. Um trombo é um conglomerado de tecidos contendo glóbulos vermelhos, glóbulos brancos e plaquetas adjacentes ao endotélio em contraste de fase e microscopia de campo brilhante(Figura 2A, Figura 2B).
2. Primeiro examine as seções para NETs usando o canal DAPI (excitação = 357/44 nm) com objetivos de 10x e 20x(Figura 2C). Note que o CFDNA aparece como DNA descondensado que não está dentro dos limites do citoplasma de uma célula quando visto em contraste de fase ou microscopia de campo brilhante.
3. Identificar ne extracelular e citH3 nos canais Vermelhos do Texas (excitação = 585/29 nm, emissão = 628/32 nm) e canal de proteína fluorescente verde (excitação = 470/22 nm, emissão = 525/50 nm), respectivamente com objetivos de 10, 20 e 40x.
4. Avalie e analise OS NETs dentro de um thrombus usando software disponível, como o Image J (NIH). A formação net é identificada com base na colocalização do cfDNA, citH3 extracelular e NE como descrito anteriormente¹⁸. Manter tempo de exposição consistente e ganhos de cada canal ao longo da aquisição de imagens para evitar saturação na intensidade dos pixels.
5. Mapeie cada trombo com base em sua proximidade com a aorta descendente dividindo-a em três zonas iguais, com a Zona 1 mais próxima da aorta, a Zona 3 mais distante da aorta, e a Zona 2 entre as Zonas 1 e 3). Com o operador cego para a condição médica de cada sujeito, tome pelo menos dez campos aleatórios em cada zona. Caracterizar a distribuição de NETs em trombos, por meio da média do número de campos com NETs em cada região ou calculando a área média de ocupação de NET por região.

Resultados

Usando este protocolo para deparafinação, recuperação de antígenos induzidos pelo calor e dupla imunorotulagem de trombos embutidos em parafina, identificamos NETs em CATE felino pela primeira vez. O trombo dentro da bifurcação aórtica foi localizado por microscopia de fluorescência e microscopia de campo brilhante utilizando a coloração padrão de H&E e microscopia de contraste de fase. Na microscopia de campo brilhante, o trombo arterial felino consistia de glóbulos vermelhos, leucócitos, fibrina e plaquet...

Discussão

Descrevemos um protocolo para identificar NETs em trombos arteriais cardiogênicos felinos fixos usando um protocolo de imunorotulagem dupla e microscopia de imunofluorescência. Embora apenas trombos arterials cardiogênicos estivessem manchados, em teoria este protocolo poderia ser usado para outros tipos de trombos e em outras espécies veterinárias. A identificação de NETs dentro do trombo arterial felino sugere que os NETs podem desempenhar um papel na trombose em gatos.

A detecção d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)	Life Technologies Corporation	D1306
Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate	ThermoFisher Scientific	Catalog # S11227
Anti-citrullinated histone H3 antibody	Abcam	Ab5103
EVOS FL Cell Imaging System	ThermoFisher Scientific	AMEFC4300
EVOS Imaging System Objective 10x	ThermoFisher Scientific	AMEP4681	NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm
EVOS Imaging System Objective 20x	ThermoFisher Scientific	AMEP4682	NA 0.40, WD 6.8 mm
EVOS Imaging System Objective 40x	ThermoFisher Scientific	AMEP4699	NA 0.75, WD 0.72 mm
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody	ThermoFisher Scientific	Catalog # A32723
Goat serum	Jackson Immuno Research Labs	Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121
Neutrophil elastase antibody	Bioss Antibodies	Bs-6982R-Biotin	Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated
NP40	Pierce	Product # 28324. Lot # EJ64292
Positive charged microscope slides	Thomas Scientific	Manufacturer No. 1354W-72
Rabbit serum	Life Technology	Catalog # 10510
Target Retrieval Solution	Agilent Dako	S2367	TRIS/EDTA, pH 9 (10x)
TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit	Vector Laboratories	SP-8400