Montagem dirigida de proteínas semelhantes à elastina em estruturas supramoleculares definidas e encapsulamento de carga in vitro

Resumo

Na interface de solventes orgânicos e aquosos, proteínas anfífilas sob medida se reúnem em estruturas supramoleculares complexas, como vesículas, fibras e coacervates desencadeadas por parâmetros ambientais. Os protocolos de montagem descritos produzem compartimentos baseados em membrana sérica (PMBCs) com propriedades ajustáveis, permitindo o encapsulamento de várias cargas.

Resumo

Blocos de construção protecários sob medida são candidatos versáteis para a montagem de estruturas supramoleculares, como células mínimas, veículos de entrega de drogas e andaimes enzimáticos. Devido à sua biocompatibilidade e sintonia no nível genético, as proteínas semelhantes à Elastina (ELP) são blocos de construção ideais para aplicações biotecnológicas e biomédicas. No entanto, a montagem de estruturas supramoleculares baseadas em proteínas com propriedades fisioquímicas distintas e bom potencial de encapsulamento permanece desafiadora.

Aqui fornecemos dois protocolos eficientes para a auto-montagem guiada de ELPs anfífilos em arquiteturas de proteínasupramolecular, tais como coacervates esféricos, fibras e vesículas estáveis. Os protocolos de montagem apresentados geram compartimentos à base de membrana siproteica (PMBCs) baseados em ELPs com propriedades físico-químicas adaptáveis. Os PMBCs demonstram o comportamento de separação de fase e revelam a fusão de membranadependente do método e são capazes de encapsular moléculas de carga fluorescentes quimicamente diversas. Os PMBCs resultantes têm um alto potencial de aplicação como uma plataforma de formulação e entrega de medicamentos, células artificiais e espaço de reação compartimentado.

Introdução

A montagem de estruturas supramoleculares para aplicações biotecnológicas está se tornando cada vez mais importante^1,2,3,4,5. Para a montagem de arquiteturas funcionais como coacervates, vesículas e fibras com propriedades físico-químicas desejadas é importante entender e controlar as propriedades físico-químicas e conformacionais dos componentes. Devido à precisão molecular das moléculas encontradas na natureza, os blocos de construção para estruturas supramoleculares são cada vez mais baseados em lipídios, ácidos nucleicos ou proteínas. Em comparação com polímeros sintéticos, blocos de construção proteináceos permitem um controle preciso sobre estruturas supramoleculares emergentes⁶ no nível genético. A seqüência de aminoácidos primários (aa) dos blocos individuais de construção de proteínas codifica intrinsecamente as informações para o seu potencial de montagem desde o nível molecular até o nível macroscópico, bem como a forma tridimensional e as propriedades físicas da estrutura supramolecular final⁷.

Métodos relatados para a montagem de diferentes estruturas supramoleculares geralmente envolvem proteínas anfífilas, como proteínas sensíveis à temperatura semelhantes à elastina (ELP)^5,8,9, oleosina recombinante¹⁰e anfífilos de proteína artificial¹¹. Métodos acionados de temperatura levaram à montagem de micelas^4,10,12Fibras¹³Folhas¹⁴e vesículas^9,15,16. Métodos envolvendo solventes orgânicos têm sido aplicados para a formação de vesículas dinâmicas à base de proteínas^8,11,14. Até agora, protocolos aplicados para a formação de vesículas muitas vezes não têm controle de montagem sobre conjuntos de tamanho de micrômetros^16,17ou têm rendimento de montagem limitado⁵. Além disso, algumas vesículas baseadas em ELP relataram ter prejudicado o potencial de encapsulamento¹²ou estabilidade limitada ao longo do tempo⁹. Abordando essas desvantagens, os protocolos apresentados permitem a automontagem de estruturas supramoleculares de micromedidor e submicrometro com propriedades fisioquímicas distintas, bom potencial de encapsulamento e estabilidade de longo prazo. Os ELPs anfífilos sob medida se reúnem em estruturas supramoleculares, abrangendo a faixa desde coacervates esféricos e feixes de fibras torcidas altamente ordenados até vesículas unilamelares, dependendo do protocolo aplicado e das condições ambientais associadas. Grandes compartimentos à base de membrana sicular (PMBC) revelam todos os principais fenótipos, como fusão de membranas e comportamento de separação de fase análogo a lipossomos. Os PMBCs encapsulam eficientemente moléculas de carga fluorescentes quimicamente diversas que podem ser monitoradas usando microscopia de epifluorescência simples. Os domínios repetitivos de ELP utilizados neste estudo são blocos de construção atraentes para arquiteturas supramoleculares baseadas em proteínas¹⁸. A unidade de repetição do pentapeptídeo ELP (VPGVG) é conhecida por tolerar diferentes aa além de prolina na quarta posição (valina, V), preservando suas propriedades estruturais e funcionais¹⁹. O desenho de ELPs anfífilos contendo domínios hidrofílicos e hidrofóbicos distintos foi realizado pela inserção de resíduos aa convidados (X) na repetição vpgxg com hidrofobicidade distinta, polaridade e carga²⁰. Domínios anfífilos de ELP quando equipados com fenilalanina hidrofóbica (F) ou isoleucina (I) enquanto o domínio hidrofílico continha ácido glutamico carregado (E) ou arginina (R) como resíduos convidados. Uma lista de construções anfífilas elegíveis e seqüências aa correspondentes podem ser encontradas nas informações e referências suplementares^8,21. Todos os blocos de construção onde equipados com pequenos corantes fluorescentes ou proteínas fluorescentes para visualização via microscopia de fluorescência. mEGFP e outras proteínas fluorescentes foram futilizadas n-terminalmente aos domínios hidrofílicos dos anfífilos ELP . Corantes orgânicos foram conjugados através da cepa livre de cobre promovida cicloadição alquina-azida (SPAAC) a um aminoácido não natural introduzido co-tradução (UAA). A incorporação co-translacional do UAApara-azidophenylanina (pAzF)²²permite a modificação n-terminal do domínio eLP hidrofílico. Desta forma, o corante fluorescente verde BDP-FL-PEG₄-DBCO (BDP) ou qualquer pequena molécula fluorescente com um ciclooctyne tenso pode ser usado como sonda fluorescente. A incorporação bem sucedida do pAzF da UAA e a cicloadição do tintura via SPAAC podem ser facilmente confirmadas via LC-MS/MS devido à ionização eficiente dos peptídeos tripés correspondentes⁸. Este pequeno corante orgânico foi aplicado para ampliar a escolha do solvente para protocolos de montagem, uma vez que as proteínas fluorescentes são incompatíveis com a maioria dos solventes orgânicos. Os dois protocolos de montagem mais eficientes para estruturas supramoleculares desenvolvidas em nosso laboratório são descritos abaixo. O método de inchaço THF só é compatível com o ELP anfífila modificado de tintura orgânica. Em contraste, o método de extrusão de 1-butanol (BuOH) é compatível com muitas proteínas como sonda fluorescente, por exemplo, mEGFP, uma vez que o método descrito preserva totalmente a fluorescência dessas proteínas de fusão. Além disso, o encapsulamento de pequenas moléculas e comportamento de fusão vesicular funciona melhor empregando o método de extrusão BuOH.

Protocolo

1. Projeto e clonagem de proteínas anfífilas semelhantes à elastina (ELPs)

1. Clonar e projetar as construções como descrito em outros lugares^8,20. Plasmids estão disponíveis mediante solicitação.

2. Expressão proteica, purificação e preparação

1. Expressão de F20E20-mEGFP e F20E20-mCherry
   1. Inocular a cultura de expressão principal da pré-cultura da noite para o_{dia 600} de 0,3. Incubar a 37 °C, 200 rpm em meio estéril de 400 mL LB suplementado com antibióticos apropriados em um frasco de 2 L.
   2. Preparar a solução de estoque iPTG (1 M) para indução da cultura de expressão em água ultrapura.
   3. Quando o OD₆₀₀ 0.5-0.8 for atingido, adicione o IPTG à cultura de expressão a uma concentração final de 1 mM e reduza a temperatura de incubação para 20 °C. Deixe a expressão a 20 °C por aproximadamente 20 h a 200 rpm.
2. Expressão de ELP anfífila contendo UAA pAzF
   1. Inocular a cultura de expressão principal da pré-cultura e. coli durante a noite contendo os dois plasmídeos pEVOL pAzF e, por exemplo, pET28-NMBL-(TAG)R40F20-his a um OD₆₀₀ de 0,3 (ver informações suplementares para seqüências de aminoácidos). Incubar a 37 °C, 200 rpm em meio estéril de 400 mL LB suplementado com kanamicina e cloro-junfenicol em um frasco de 2 L.
   2. Prepare a solução de estoque de 100 mM pAzF em água ultrapura. Para 10 mL de solução de estoque pAzF, pesar 206,2 mg pAzF e resuspendê-lo em 8 mL de água ultrapura. Para dissolver o pAzF levante o pH da solução com 3 M NaOH e misture vigorosamente. Quando o pAzF for dissolvido, abaixe cuidadosamente o pH para 10,5 e adicione água ultrapura a um volume final de 10 mL. Use um filtro estéril (0,22 μm) e alíquota a solução em tubos de reação de 2 mL.
   3. Prepare 1 M solução de estoque IPTG em água ultrapura e 20% de solução de estoque de arabinose em água ultrapura.
   4. Quando o OD₆₀₀ 0.5-0.8 for atingido, adicione pAzF à cultura de expressão a uma concentração final de 2 mM. Incubar cultura por 10 min, 37 °C, 200 rpm para permitir a absorção de pAzF.
   5. Induzir a expressão da proteína alvo e expressão da sintetetase tRNA/t-RNA necessária através da adição simultânea de IPTG (1 mM) e arabinose (2%) e reduzir a temperatura de incubação para 20 °C.
   6. Deixe a expressão a 20 °C por aproximadamente 20 h a 200 rpm. Cultura de expressão de colheita por centrifugação a 4 °C, 4000 x g, 40 min.
3. Lse celular e purificação de proteínas
   1. Resuspender a pelota E. coli no tampão de lysis (10 mL por litro de cultura; 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 4 M urea, 0,25% Triton X-100) contendo lysozyme (0,1 mg/mL) e PMSF (0,1 mM). Incubar por 30 min no gelo e congelar e descongelar duas vezes depois submergindo a amostra em nitrogênio líquido.
   2. Sonice a suspensão (30%, 15 vezes, 30 s: 10 s break) e limpe o lysate via centrifugação (4 °C, 10.000 x g por 40 min).
   3. Purificar proteínas usando cromatografia de afinidade (por exemplo, em uma coluna de níquel de 1 mL usando um sistema FPLC conectado a um coletor de frações; ver Tabela de Materiais). Eluir a proteína com tampão de elução (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 4 M ureia, 250-500 mM imidazol) e armazenar a 4 °C até posterior processamento.
   4. Analise a eficiência de purificação via SDS-PAGE.

3. Modificação de tintura de ELPs via SPAAC

1. Estimar aproximadamente a concentração da solução ELP.  Uma absorção_{de 280} para avaliação de concentração não é valiosa, uma vez que a seqüência pAzF-R40F20 não tem aminoácidos absorvendo na faixa UV. Portanto, um anfífilo ELP anteriormente liofilizado e ponderado pode ser usado como referência para comparação de banda sds PAGE. Através da comparação da intesidade de valor cinza somado das bandas sds page de soluções ELP com concentrações conhecidas e sua amostra a concentração aproximada de sua amostra pode ser estimada.
2. Adicionar 1 μL de corante fluorescente BDP-FL-PEG4-DBCO (solução de estoque de 10 mM; concentração final de 20 μM) a 500 μL de solução ELP (~20 μM). Incubar a reação por cerca de 10 h a 15 °C, enquanto treme e protege da luz.
3. Para maior uso, diálise a reação para remover o BDP excessivo.
   1. Equilibre uma membrana de diálise (por exemplo, corte de 12 kDa) em água ultrapura por 10 minutos. Corte a membrana de diálise no tamanho correto a ser colocada sobre a abertura de um tubo de reação contendo a solução ELP clicada. Para fixar a membrana de diálise na abertura, coloque uma tampa de tubo de reação com o núcleo perfurado na abertura, fechando assim o tubo.
   2. Coloque o tubo de reação de cabeça para baixo no tampão escolhido. Troque o buffer (2-5 L) duas vezes após a diálise por pelo menos 3 h cada vez. Remova quaisquer bolhas de ar presas entre a membrana de diálise e o tampão para garantir a diálise bem sucedida.

4. Protocolo de inchaço thf

1. Diálise solução ELP homogênea contra fosfato ou tampão tris (10 mM) com pH estável 7.5 para remover sais e compostos remanescentes de sua purificação de tag.
2. Prepare o liofilizador e esfrie até a temperatura inicial para a secagem congelante.
3. Alice a solução de proteína dialisada em tubos de reação de 1,5 mL (50-500 μL por tubo) e congele o choque em nitrogênio líquido. Para evitar a mistura indesejada de diferentes soluções proteicas durante a secagem congelante, tampas com um pequeno orifício podem ser colocadas em cima do tubo de reação para selá-lo parcialmente.
4. Retire as amostras de proteína congelada do nitrogênio líquido e coloque-as imediatamente no liofilizador para começar a secar o congelamento. A secagem congelante é concluída quando a amostra está completamente seca (aproximadamente 24-48 h). Posteriormente, ventilar ELPs anfífilas liofilizados ventiladas com N₂seco, em seguida, feche imediatamente as tampas do tubo de reação para evitar o contato com a umidade do ar.
5. Adicione THF puro às amostras liofilizadas (ELP, 5-10 μM) e coloque a solução em um sônico de banho de água contendo água gelada por 15 minutos para permitir o inchaço do ELP em THF.
6. Pré-aqueça um termociclador a 30-60 °C para formação de vesículas ou até 90 °C para formação de fibras e prepare novos tubos de reação contendo água ultrapura ou tampão (50 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 50 mM NaCl, pH 5-13). Coacervates esféricos se reúnem predominantemente a 20 °C dentro de pH 9-13. A formação de vesículas é favorecida a 50-60 °C entre pH 7 e 9. A formação de fibras é predominantemente induzida acima de 60 °C entre pH 5 e 12.
7. Após a etapa de sonorização, coloque a solução ELP/THF, bem como a solução de água ultrapura ou tampão preparada no termociclador e aqueça até a temperatura desejada por 5 minutos. Quando a temperatura for atingida, a solução ELP/THF pré-aquecida deve ser cuidadosamente estratificada em cima da solução de água ultrapura ou tampão pré-aquecida. Uma separação clara das duas fases com uma interface distinta deve ser visível.
8. Coloque a mistura no termociclador novamente e incubar por 20 min para permitir a formação de vesícula ou fibra na interface. Posteriormente, deixe as amostras esfriarem até a temperatura ambiente por 10 min antes da análise via microscopia de fluorescência ou diálise.
9. Solução de diálise contendo as estruturas supramoleculares contra água ultrapura ou tampão (50 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 50 mM NaCl, pH 7-10).

5. Protocolo de extrusão buoh

1. Prepare uma solução ELP de 1-50 μM em água ultrapura ou tampão (50 mM PB pH 7.5, 100 mM NaCl, pode conter até 4 M urea). A concentração da solução anfífila ELP F20R20-mEGFP e F20R20-mCherry pode ser determinada utilizando-se os coeficientes de extinção molar (F20R20-mEGFP A₂₈₀ = 22015 M^-1 cm^-1 e F20R20-mCherry A₂₈₀ = 34380 M^-1 cm^-1) (ver informações suplementares para sequências aa).
2. Adicione 10%-20% (v/v) 1-butanol e misture imediatamente a solução encanando para cima e para baixo ou desenhando-a através de uma seringa várias vezes. Pode ser aplicada uma pipeta comum de 100 μL ou uma seringa Hamilton equipada com uma agulha de 0,25 x 25 mm. A turbidez da solução durante a mistura deve aumentar, indicando a formação de vesículas. 1-octanol 5%-15% (v/v) também pode ser usado para extrusão de vesícula em vez de 1-butanol.
3. Para obter uma distribuição de tamanho estreito, extrude vesículas usando uma mini extrusora através de uma membrana com um tamanho de poro de 1 μm à temperatura ambiente. O tamanho da membrana usado para extrusão determina o corte de tamanho superior das vesículas.
4. Diálise as vesículas conforme descrito acima (passo 3.3) para remover o residual 1-butanol.

6. Encapsulamento de tintura com o protocolo de extrusão BuOH

1. Misture aproximadamente 40 μL solução ELP em 10 mM Tris-HCl, pH 8 com 1 μL Dextran Texas Red (0,0025 mg/mL concentração final).
2. Adicione 10 μL de BuOH à solução e extruda 5-10 vezes através de uma seringa equipada com uma agulha de 0,25 x 25 mm.

7. Análise de estruturas supramoleculares utilizando microscopia de fluorescência

1. Coloque um anel de reforço em uma lâmina de vidro e pressione firmemente o lado adesivo ao vidro.
2. Adicione 5 μL da amostra ao interior do anel de reforço e coloque um deslizamento de tampa em cima.
3. Sele a amostra com esmalte nas bordas do deslizamento de cobertura para evitar a evaporação da amostra durante a análise.
4. Realizar microscopia de fluorescência como descrito anteriormente⁸.

Resultados

Desenvolvimento de protocolos para produção de vesículas
A Figura 1 descreve os dois métodos diferentes de preparação da vesícula. O método de inchaço THF no lado esquerdo é composto de três passos sucessivos e resulta em diferentes conjuntos supramoleculares do ELP, dependendo da temperatura. Na Figura 1A imagens de microscopia de epifluorescência mostram vesículas montadas a partir de BDP-R20F20 e e...

Discussão

Uma falha ao seguir os protocolos descritos para a montagem de estruturas supramoleculares definidas leva principalmente à formação de agregados inespecíficos(Figura 2, IV) ou a anfífilos ELP-anfifilos homogeneamente distribuídos. As etapas críticas do protocolo são discutidas abaixo:

Para o alto rendimento de expressão do ELP anfífilo, uma temperatura relativamente baixa de 20°C é ótima. Para a purificação bem-sucedida da eLP anfífila, foi comprov...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 µm and 0.2 µm Steril Filter	VWR
1,4-Dithiothreitol	Merck
1-butanol. >99.5% p.a.	Roth
2log DNA ladder	NEB
2-Mercaptoethanol	Roth
50 mL Falcon tubes	VWR
79249 Alkyne Mega Stokes dye	Sigma Aldrich
Acetic acid glacial	VWR
Acetonitrile, anhydrous, 99.8%	Sigma-Aldrich
Ampicillin sodium-salt, 99%	Roth
BDP-FL-PEG4-DBCO	Jena Bioscience
Biofuge	Heraeus
Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm)	Thermo Scientific
Brillant Blue G250 (Coomassie)	Roth
BspQI	NEB
Camera DS Qi1	Nikon
Centrifuge 5417r	Eppendorf
Centrifuge 5810r	Eppendorf
CF-400-Cu square mesh copper grid	EMS
Chloramphenicol	Roth
CompactStar CS 4	VWR
Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral	Life Technologies
Digital sonifier	Branson
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Applichem
Dnase I	Applichem
EarI	NEB
EcoRI-HF	NEB
Environmental shaker incubator ES-20	Biosan
Ethanol absolute	Roth
Ethidium bromide solution	Roth
Filter supports	Avanti
Glass plates	Bio-Rad
Glycerol Proteomics Grade	Amresco
Glycin	Applichem
H4-Azido-Phe-OH	Bachhem
Heat plate MR HeiTec	Heidolph
HindIII	NEB
HisTrap FF crude column	GE Life Sciences		Nickel column
Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a.	Merck
Illuminator ix 20	INTAS
Illuminator LAS-4000	Fujifilm
Imidazole	Merck
Immersions oil for microscopy	Merck
Incubators shakers Unimax 1010	Heidolph
Inkubator 1000	Heidolph
IPTG, >99%	Roth
Kanamycinsulfate	Roth
L(+)-Arabinose	Roth
Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE	Sartorius
LB-Medium	Roth
Lyophilizer Alpha 2-4 LSC	Christ
Lysozyme, 20000 U/mg	Roth
Microscope CM 100	Philips
Microscope Eclipse TS 100	Nikon
Microscopy cover glasses (15 x 15 mm)	VWR
Microscopy slides	VWR
Microwave	Studio
Mini-Extruder Set	Avanti Polar Lipids
NaCl, >99.5%, p.a.	Roth
Natriumhydroxid pellets	Roth
Ni-NTA Agarose, PerfectPro	5 Prime
Nucleopore Track-Etch Membrane	Avanti
PH meter 766 calimatic	Knick
Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF)	Roth
Polypropylene Columns (1 mL)	Qiagen
PowerPac basic	BioRad
Propanol-2-ol	Emplura
Protein ladder 10-250 kDa	NEB
Recirculating cooler F12	Julabo
Reinforcement rings	Herma
SacI HF	NEB
SDS Pellets	Roth
Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4	VWR
Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate	VWR
T4 DNA Ligase	NEB
TEMED	Roth
TexasRed Dextran-Conjugate	MolecularProbes
Thermomix comfort	Eppendorf
THF, >99.5% p.a.	Acros
Triton X 100	Roth
Trypton/Pepton from Casein	Roth
Ultrasonic cleaner	VWR
Urea p.a.	Roth
Vacuum pump 2.5	Vacuubrand
XbaI	NEB
XhoI	NEB
ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V)	Roth