Indução da Modificação das Células Leptomenínias via Injeção Intracisternal

Resumo

Descrevemos uma injeção intracisternal que emprega uma agulha dobrada na ponta que pode ser estabilizada no crânio, eliminando assim o risco de dano ao parênquima subjacente. A abordagem pode ser usada para mapeamento do destino genético e manipulações de células leptomeningeais e para rastrear o movimento do fluido cefalorraquidiano.

Resumo

O protocolo aqui descrito descreve como injetar soluções com segurança e manualmente através da cisterna magna, eliminando o risco de danos ao parnchyma subjacente. Protocolos publicados anteriormente recomendam o uso de agulhas retas que devem ser reduzidas a um máximo de 1-2 mm da superfície dural. A queda repentina da resistência uma vez perfurada a membrana dural dificulta a manutenção da agulha em posição constante. Nosso método, em vez disso, emprega uma agulha dobrada na ponta que pode ser estabilizada contra o osso occipital do crânio, impedindo assim que a seringa penetre no tecido após perfuração da membrana dural. O procedimento é simples, reproduzível e não causa desconforto duradouro nos animais operados. Descrevemos a estratégia de injeção intracisternal no contexto do mapeamento do destino genético das células leptomenínias vasculares. A mesma técnica pode, além disso, ser utilizada para abordar uma ampla gama de questões de pesquisa, como sondar o papel das leptomeninges no neurodesenvolvimento e a disseminação da meningite bacteriana, através da ablação genética de genes putativamente implicados nesses fenômenos. Além disso, o procedimento pode ser combinado com um sistema de infusão automatizado para uma entrega constante e usado para rastrear o movimento do fluido cefalorraquidiano através da injeção de moléculas rotuladas fluorescentes.

Introdução

As células leptomeningeais são uma população de células semelhantes ao fibroblasto organizadas em uma camada fina sobrepondo o cérebro e expressando genes implicados na crosslinking de colágeno (por exemplo, Dcn e Lum),e no estabelecimento de uma barreira cérebro-meningeal (por exemplo, Cldn11)^1,2. As células leptomenínias estão implicadas em uma ampla gama de funções fisiológicas, desde o controle rigoroso sobre a drenagem do fluido cefalorraquidiano³ até a orientação de progenitores neurais no cérebro em desenvolvimento^4,5. Um estudo recente também propôs que as leptomeninges no recém-nascido podem abrigar células radiais semelhantes à glia que migram para o parênquima cerebral e se desenvolvem em neurônios corticais funcionais⁶.

As células leptomenínias estão localizadas próximas aos astrócitos superficiais e compartilham com elas, assim como outras astroglias parênquias, expressão de connexin-30 (Cx30)⁷. O procedimento cirúrgico descrito abaixo permite a rotulagem generalizada e específica dessas células meningeais através de uma entrega única de endoxifen na cisterna magna de camundongos transgênicos expressando condicionalmente tdTomato em células Cx30⁺ (ou seja, usando um sistema CreER-loxP para mapeamento do destino). O endoxifen é um metabólito ativo do Tamoxifen e induz a recombinação de células expressas por CreER da mesma forma que o Tamoxifen. É, no entanto, a solução recomendada para aplicação tópica porque se dissolve em 5-10% DMSO, em vez de altas concentrações de etanol. Além disso, o endoxifen não atravessa a barreira cérebro-meningeal, permitindo assim uma recombinação específica de células leptomeningeais, sem rotular a população cx30⁺ astroglial subjacente (ver Resultados Representativos).

A técnica aqui apresentada visa injetar manual e seguramente o composto no fluido cefalorraquidiano, via acesso direto à cisterna magna. Ao contrário de outros procedimentos mais invasivos que requerem craniotomia, esta abordagem permite infundir compostos sem causar danos ao crânio ou ao parequima cerebral. Assim, não está associada à indução de reações inflamatórias desencadeadas pela ativação de células glia parenquiais. Semelhante a outras estratégias de injeção descritas antes^{de 8,9,10}, a abordagem presente baseia-se na exposição cirúrgica da membrana dural atlanto-occipital que cobre a cisterna magna, após dissecção contundente dos músculos do pescoço sobreposto. No entanto, ao contrário de outros procedimentos, recomendamos o uso de uma agulha dobrada na ponta, que pode ser estabilizada contra o osso occipital durante a administração. Isso evitará que a agulha penetre muito fundo e prejudique o cerebelo subjacente e a medula.

Este procedimento cirúrgico é compatível com investigações de rastreamento de linhagem que visam mapear mudanças nas identidades celulares e rotas migratórias através de camadas parêmicas. Também pode ser adaptado a estudos de ablação genética que pretendem sondar o papel das células leptomeningeais na saúde e na doença, como sua contribuição para o desenvolvimento cortical⁵ ou a disseminação da meningite bacteriana^3,11. Finalmente, pode ser utilizado para rastrear o movimento do fluido cefalorraquidiano quando combinado com a entrega de rastreadores fluorescentes em animais do tipo selvagem.

Protocolo

Os procedimentos cirúrgicos apresentados foram aprovados pela Estocolmo Norra Djurförsöksetiska Nämnd e realizados de acordo com as especificações fornecidas pelo instituto de pesquisa (Instituto Karolinska, Suécia).

NOTA: A injeção intracisternal pode ser adaptada de forma flexível para múltiplos fins de pesquisa. Apresentamos abaixo um procedimento desenvolvido para rotular eficientemente as células leptomeningeais para mapeamento do destino com base na injeção de endoxifen em uma linha de rato transgênica que transporta R26R-tdTomato¹² e CreER, este último sob o promotor Cx30¹³. A rotulagem dessa população de células pode ser obtida através da injeção de construtos virais utilizando o mesmo procedimento descrito abaixo. Finalmente, esta abordagem pode ser empregada para rastrear o fluxo de fluido cefalorraquidiano, por infusão de rastreadores fluorescentes.

1. Preparação do Sistema de Injeção

NOTA: Recomendamos a realização do procedimento em uma sala cirúrgica adequada e em condições assépticas. As ferramentas cirúrgicas podem ser esterilizadas usando calor (autoclave, esterilizador de fibra de vidro) ou higienizadas usando um desinfetante químico de alto nível se forem sensíveis ao calor. Enxágüe os instrumentos antes de usar ao empregar desinfecção química ou permita-os esfriar quando higienizados com calor.

1. Com fórceps, dobre a agulha da seringa de injeção a 30° a 3 mm da ponta.
   NOTA: Use seringas Hamilton com uma agulha chanfrada de 30 G.
2. Prepare 1 mg/mL de solução endoxifen, diluída em 10% DMSO e encha a seringa com a agulha dobrada.
   NOTA: Administrar 5 μL do composto para garantir a exposição generalizada de células meningeais no camundongo C57Bl/6j adulto (ca. 25-30 g), embora experimentos piloto que testem diferentes concentrações e volumes de injeção possam ser necessários no tratamento de animais de diferentes idades e cepas.
3. Ajuste o suporte da cabeça do mouse de modo que o pedaço da boca esteja a aproximadamente 30° da superfície da mesa cirúrgica.
   NOTA: Um quadro estereotático com fixação de três pontos (ou seja, orelhas e boca) também pode ser usado para este procedimento. Neste caso, porém, o animal só será fixado com o pedaço da boca, enquanto as barras de ouvido podem ser estendidas sob os membros dianteiros do animal e ser usadas para apoiar o corpo do animal durante o procedimento.

2. Indução da Anestesia

1. Para anestésicos injetáveis, utilize concentrações e modos de administração recomendados pela unidade veterinária da instituição local.
2. Para anestésicos inalacionais, como isoflurano, prepare a unidade de administração de acordo com as especificações do fabricante.
3. Com isoflurano, definir a concentração do composto em 4% para indução de anestesia.
4. Entregar ar a uma taxa de 400 mL/min.
5. Deixe a unidade de anestesia encher a câmara com o anestésico por alguns minutos e coloque o mouse na câmara depois.
   NOTA: Para os presentes experimentos, usamos camundongos transgênicos adultos (>2 meses e aproximadamente 30 g) masculinos e femininos que transportam Cx30-CreER e R26R-tdTomato, e criados em um fundo C57Bl/6j.
6. Monitore o animal durante a indução da anestesia. O padrão de respiração deve diminuir quando o mouse estiver sob anestesia total.
7. Retire o animal da câmara e verifique se há supressão do reflexo da pata apertando delicadamente as patas traseiras.
   NOTA: O reflexo ainda pode estar presente, mas atrasou alguns segundos. Se esse for o caso, coloque o animal de volta na câmara até que a supressão completa do reflexo da pata tenha sido alcançada.
8. Administrar analgésico (por exemplo, Carprofeno, 5 mg/kg através de injeção subcutânea) para auxiliar o tratamento da dor pós-operatória.

3. Posicionamento do Animal para o Procedimento

1. Fixar a cabeça do animal no porta-cabeças. Para melhorar a acessibilidade à cisterna magna, posicione o corpo do animal a aproximadamente 30° da superfície da mesa e da cabeça intitulada para baixo, para estabelecer um ângulo de 120° com o resto do corpo e estender a parte de trás do pescoço para facilitar o acesso à cisterna magna(Figura 1A).
2. Adicione toalhas de papel por baixo do animal para apoiar seu corpo durante todo o procedimento.
3. Segure a entrega de anestesia através do bocal e reduza a concentração de isoflurano para 2,5% e a entrega de ar para 200 ml/min.
4. Aplique pomada oftálmica.

4. Exposição da Cisterna Magna

1. Raspe a parte de trás do pescoço do animal e higienize a área com 70% de etanol e Betadine.
2. Utilizando uma tesoura cirúrgica, realize uma incisão midline (cerca de 7 mm de comprimento) começando no nível do osso occipital e estendendo-o posteriormente.
3. Separe suavemente os músculos conjuntivos superficiais e os músculos do pescoço puxando lateralmente da linha média com pinças de ponta finas. Isso exporá a membrana dural sobrepondo a cisterna magna, em forma de triângulo invertido.
4. Use lanças de absorção estéreis ou cotonetes de algodão para controlar qualquer sangramento resultante.
5. Posicione um pequeno separador cirúrgico para manter os músculos do pescoço puxados para fora e possibilitar a visualização da cisterna magna durante todo o procedimento.

5. Injeção Intracisternal

1. Para ter acesso à cisterna magna, identifique a extremidade caudal do osso occipital e insira a agulha que antes estava dobrada imediatamente por baixo.
   NOTA: Haverá uma queda repentina na resistência à medida que a membrana dural for perfurada. No entanto, a ponta da agulha só penetrará ligeiramente sob a superfície meningeal, graças à sua forma enganchando.
2. Uma vez perfurada a dura dura, permita que a ponta dobrada da agulha penetre sob a superfície dural puxando suavemente a seringa para cima e paralelamente ao corpo do animal, a fim de "enganchar" a agulha no crânio (ver Figura 1B). Isso garantirá uma melhor estabilidade e evitará que a agulha penetre mais fundo, evitando assim o risco de danificar o cerebelo subjacente ou a medula.
3. Injete o composto lentamente para evitar interferência suspito do fluxo natural do fluido cefalorraquidiano.
   NOTA: Dependendo do propósito do experimento, a taxa de infusão pode variar. Se for necessária uma taxa de infusão lenta e constante (por exemplo, ao usar o procedimento para rastrear o movimento do fluido cefalorraquidiano), pode ser aconselhável usar um sistema de microinfusão automatizado em combinação com a seringa.
4. Após a injeção, deixe a agulha descansar no local por 1 min e remova-a cuidadosamente. Use fórceps de ponta fina para ajudar a retração da agulha de sua posição enganchando.
   NOTA: O uso de uma agulha fina (por exemplo, 30 G) não leva a danos substanciais da membrana meningeal, e consequente saída do fluido cefalorraquidiano. Se forem necessários tamanhos maiores de agulha, recomendamos parar o vazamento de fluido, aplicando pressão no local da injeção usando uma ponta de algodão estéril.

6. Concluir o Procedimento e os Cuidados Pós-Operatórios

1. Remova o separador e deixe que os músculos voltem à sua posição original sobrepondo a membrana dural.
2. Feche a incisão cutânea usando algumas gotas de adesivo cianoacrilato.
   NOTA: Alternativamente, utilize suturas absorvíveis (por exemplo, 5-0 suturas de vicril) e feche a incisão cutânea com pontos interrompidos.
3. Aplique anestésico local (por exemplo, 100 μL de 5% de lidocaína) no local da incisão.
4. Retire o animal do suporte e coloque em uma gaiola limpa posicionada sobre uma almofada de aquecimento. Monitore o animal até que ele recupere a consciência.
   NOTA: Não se espera que o procedimento cause dor ou angústia duradoura no animal. No entanto, o camundongo deve ser monitorado de perto durante os primeiros dias pós-operatórios e medidas de alívio da dor podem ser realizadas sempre que necessário, e de acordo com as recomendações fornecidas pela unidade veterinária de sua instituição.

Resultados

A injeção intracisternal de endoxidos em camundongos transgênicos que expressam CreER sob o promotor Cx30¹³ e um repórter fluorescente induível permite uma recombinação específica de células leptomenínias sem rotular a superfície de expressão cx30 e os astrócitos parêmicos no córtex(Figura 1). Para ter acesso à cisterna magna, o animal anestesiado é posicionado com seu corpo e sua cabeça em um ângulo de aproximadamen...

Discussão

O protocolo aqui descrito apresenta um procedimento simples e reprodutível para rotular células leptomeningeais para mapeamento do destino. Utilizamos injeção intracisternal de endoxifen, um metabólito ativo de Tamoxifen, para induzir a expressão do repórter fluorescente tdTomato em Cx30-CreER; Ratos R26R-tdTomato^12,13.

Em comparação com outros protocolos usados para obter acesso ao fluido cefalorraquidiano através da cistern...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia unit	Univentor 410	8323102	Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder
Anesthesia (Isoflurane)	Baxter Medical AB	000890
Betadine	Sigma-Aldrich	PVP1
Carprofen	Orion Pharma AB	014920	Commercial name Rymadil
Cyanoacrylate glue	Carl Roth	0258.1	Use silk 5-0 sutures, in alternative
Medbond Tissue Glue	Stoelting	50479
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
Endoxifen	Sigma-Aldrich	E8284
Ethanol 70%	Histolab	01370
Hamilton syringe (30 G beveled needle)	Hamilton	80300
Lidocaine	Aspen Nordic	520455
Mouse head holder	Narishige International	SGM-4	With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame
Scissors	Fine Science Tools	15009-08
Shaver	Aesculap	GT420
Sterile absorption spears	Fine Science Tools	18105-01	Sterile cotton swabs are also a good option
Surgical separator	World Precision Instrument	501897
Tweezers	Dumont	11251-35
Viscotears	Bausch&Lomb Nordic AB	541760