Usando magnetometria para monitorar a incorporação celular e a biodegradação subsequente de nanopartículas de óxido de ferro quimicamente sintetizadas

Resumo

As nanopartículas de óxido de ferro são sintetizadas através de um procedimento de gel sol não diatéico e revestidas com moléculas curtas aniônicas ou polímeros. O uso de magnetometria para monitorar a incorporação e biotransformações de nanopartículas magnéticas dentro de células-tronco humanas é demonstrado usando um magnetômetro de amostra vibração (VSM).

Resumo

As nanopartículas magnéticas, feitas de óxido de ferro, apresentam um interesse peculiar para uma ampla gama de aplicações biomédicas para as quais são frequentemente internalizadas nas células e depois deixadas dentro. Um desafio é avaliar seu destino no ambiente intracelular com metodologias confiáveis e precisas. Aqui, introduzimos o uso do magnetômetro de amostra vibração (VSM) para quantificar precisamente a integridade das nanopartículas magnéticas dentro das células medindo seu momento magnético. As células-tronco são rotuladas pela primeira vez com dois tipos de nanopartículas magnéticas; as nanopartículas têm o mesmo núcleo produzido através de uma síntese de gel sol não diagênea rápida e eficiente e diferem em seu revestimento: a molécula de ácido cítrico comumente usada é comparada ao ácido poliacrílico. A formação de esferoides de células 3D é então alcançada através da centrifugação e o momento magnético desses esferoides é medido em diferentes momentos com o VSM. O momento obtido é uma impressão digital direta da integridade das nanopartículas, com valores decrescentes indicativos de uma degradação de nanopartículas. Para ambas as nanopartículas, o momento magnético diminui ao longo do tempo cultural revelando sua biodegradação. Um efeito protetor do revestimento de ácido poliacrílico também é mostrado, quando comparado ao ácido cítrico.

Introdução

Há um aumento do interesse nas características magnéticas das nanopartículas de óxido de ferro para uma ampla gama de aplicações biomédicas. Sua resposta à ressonância magnética torna-os agentes de contraste confiáveis para ressonância magnética (RM), uma vantagem na medicina regenerativa onde células rotuladas com nanopartículas magnéticas podem ser rastreadas in vivo após a implantação¹. Usando campos magnéticos, as células também podem ser guiadas à distância; dessa forma, os esferoides celulares^2,3, anéis⁴ou folhas⁵ podem ser projetados magneticamente e também remotamente estimulados⁶, um ativo no desenvolvimento de tecidos livres de andaimes. A gama de possibilidades para essas nanopartículas também inclui sistemas de entrega de medicamentos^7,8 e tratamento hipertérmico magnético e fotoinduzido para matar células cancerosas^9,10,11. Para todas essas aplicações, as nanopartículas são integradas no ambiente biológico por injeção intravenosa ou por internalização direta nas células e são então deixadas dentro, o que coloca em questão seu destino intracelular.

As análises in vivo transmitiram uma compreensão geral do destino das nanopartículas no organismo: após a injeção na corrente sanguínea, elas são capturadas principalmente pelos macrófagos do fígado (células kupffer), baço e medula óssea, são progressivamente degradadas, e se juntam à piscina de ferro do organismo^{12,13,14,15,16,17,18,19}. Observações qualitativas só são possíveis devido à circulação das nanopartículas em todo o organismo. Normalmente, a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) pode ser usada para observar diretamente as nanopartículas e a presença de ferro nos órgãos pode ser determinada através da dosagem. Mais recentemente, seu destino foi avaliado diretamente em uma piscina de células, ou seja, em circuito próximo sem fuga de ferro, permitindo uma medição quantitativa de suas biotransformações no nível celular^20,21,22. Tais medidas são possíveis através da análise das propriedades magnéticas das nanopartículas que estão fortemente ligadas à sua integridade estrutural. A magnetometria da amostra vibratória (VSM) é uma técnica onde a amostra é vibrada periodicamente de modo que a medição da bobina do fluxo induzido fornece o momento magnético da amostra no campo magnético aplicado. Tal detecção síncron sua permite uma medição rápida, que é um trunfo para determinar os momentos magnéticos de um grande número de amostras^20,21,22,23. A assinatura magnética macroscópica recuperada pela VSM dá então uma visão geral quantitativa de toda a amostra biológica diretamente correlacionada com o tamanho e estrutura das nanopartículas. Em particular, fornece o momento magnético na saturação (expresso em emu) das amostras, que é uma quantificação direta do número de nanopartículas magnéticas presentes na amostra, respectivamente para suas propriedades magnéticas específicas.

Foi demonstrado que o processamento intracelular de nanopartículas magnéticas está fortemente ligado às suas características estruturais²⁰. Esses recursos podem ser controlados através de protocolos de síntese ideais. Cada protocolo apresenta vantagens e limitações. As nanopartículas de óxido de ferro são comumente sintetizadas em soluções aquosas por meio da coprecipitação dos íons de ferro²⁴. Para superar as limitações da polidispersidade do tamanho das nanopartículas, outros métodos de síntese, como métodos de sol-gel mediados por poliol, foram desenvolvidos²⁵. Abordagens não diatéacas por decomposição térmica leva à produção de nanopartículas de óxido de ferro muito bem calibradas²⁶. No entanto, o uso de grandes quantidades de surfactantes como oleylamina ou ácido oleico complica sua funcionalização e transferência de água para aplicações biomédicas. Por essa razão, sintetizamos tais nanopartículas magnéticas através de uma rota de gel sol não diatéramos que leva à alta cristalina, pureza e reprodutibilidade²⁷. Este protocolo produz nanopartículas de tamanho bem controlada que podem ser ajustadas através da variação de temperatura²⁸. No entanto, a rota sol-gel não aquosa assistida por micro-ondas tem um limite de tamanho superior das nanopartículas obtidas de cerca de 12 nm. Este procedimento não seria adaptado para aplicações usando partículas ferromagnéticas à temperatura ambiente. Além da síntese do núcleo, outra característica principal a ser considerada é o revestimento. Deitado na superfície da nanopartícula, o revestimento age como uma molécula de ancoragem, ajudando a internalização direcionada das nanopartículas, ou pode proteger a nanopartícula da degradação. Uma vez que o álcool benzílico age como uma fonte de oxigênio e um ligante ao mesmo tempo, nanopartículas nuas são produzidas sem a necessidade de surfactantes adicionais ou ligantes. As nanopartículas são facilmente funcionalizadas após a síntese sem um processo de troca de surfactantes.

Nesse caso, são avaliados dois tipos de nanopartículas que possuem o mesmo núcleo e diferem no revestimento. O núcleo é sintetizado usando uma técnica baseada em micro-ondas rápida e altamente eficiente. Os dois revestimentos comparados consistem em ácido cítrico, um dos mais utilizados como agente de revestimento em aplicações biomédicas^29,30e ácido poliacrílico (PAA), um revestimento polimérico com alto número de funções de quesquente. As medidas de magnetometria VSM são então usadas primeiro para quantificar a absorção de nanopartículas pelas células e, em seguida, como uma avaliação direta da integridade estrutural da nanopartícula após a internalização em células-tronco. Os resultados demonstram que a concentração de incubação impacta a absorção de nanopartículas e que o revestimento influencia sua degradação, com o grande número de moléculas de ancoragem de PAA protegendo o núcleo da degradação.

Protocolo

1. Síntese de nanopartículas magnéticas

1. Síntese do núcleo – assistida por micro-ondas
   1. Dissolver 400 mg de acetilado de ferro (>99,9%) em 10 mL de álcool benzílico (BA, 99,8%) dentro de um frasco de vidro monowave de 30 mL.
   2. Aumente a temperatura da suspensão de 25 a 250 °C em 20 minutos (a uma taxa de 11,25 °C/min) e mantenha-a em 250 °C por 30 min usando um reator de micro-ondas.
   3. Transfira as nanopartículas resultantes suspensas em álcool benzílico para um frasco de vidro e separe as nanopartículas usando um ímã de neodímio por 30 minutos.
   4. Lave o precipitado no frasco de vidro anterior de 100 mL com 10 mL de diclorometano, hidróxido de sódio de 1 M, etanol, pH 7 água (três vezes) usando um ímã de neodímio por 5 min cada passo para pelotizar nanopartículas e remover o supernatante.
   5. Ajuste a suspensão da nanopartícula em água para pH 2 usando ácido clorídrico de 1 M e, em seguida, centrífuga em filtros ultracentrifugal de 100 kDa a 2.200 x g por 10 min.
   6. Remova o filtrado, adicione 12 mL de ácido clorídrico de^{10 a 2} M à solução de nanopartículas e centrífuga em filtros ultracentrifugal de 100 kDa a 2.200 x g por 10 minutos (três vezes). Em seguida, diluir a solução de nanopartículas dentro de 10 mL de 10^-2 M de ácido clorídrico antes de revestir.
2. Revestimento
   1. Diluir 175 mg de ácido cítrico e ácido poliacrílico na água em pH 2 em um frasco de vidro de 100 mL e ajustar o pH para 2 com uma solução de ácido clorídrico de 1 M.
   2. Adicione as nanopartículas de 10 mL dispersão aquosa à solução de molécula de revestimento, correspondendo a uma razão de massa de 5 entre a molécula de revestimento e as nanopartículas. Agitar por 2 h sob agitação magnética à temperatura ambiente.
   3. Após a reação, ajuste o pH para 7 com hidróxido de sódio de 1 M.
   4. Centrifugar a solução de nanopartículas 3 vezes com água deionizada (DI) em filtros ultracentrifugal de 100 kDa a 2.200 x g por 10 min; remover o filtrado e diluir a solução de nanopartículas em 12 mL de água DI.

2. Cultura e rotulagem magnética de células-tronco

1. Cultura células-tronco mesenquimais humanas (MSC) em meio de crescimento completo de células-tronco mesenquimais (MSCGM) a 37 °C e 5% DE CO₂. Quando as células estiverem com 90% de confluência, adicione 10 mL de trypsin-EDTA pré-aquecido a 37°C por frasco de 150 cm² e deixe por 2-3 minutos para desacoplar as células.
   1. Para saber quando as células são separadas, observe-as com um microscópio de campo brilhante. Resuspenque as células separadas no MSCGM e divida-as em quatro frascos de 150 cm². Amplie as células desta forma até a passagem 4 a 5.
2. Prepare a solução de nanopartículas magnéticas para rotulagem celular: disperse a concentração escolhida de nanopartículas de óxido de ferro no meio do Instituto Memorial roswell park livre de soro (RMPI-1640) sem glutamina. O RPMI é usado para incubação de nanopartículas (e as etapas de lavagem relacionadas), pois tem uma resistência iônica menor do que o DMEM e melhor evita eventos de agregação de nanopartículas.
3. Quando as células estiverem na passagem 4 ou 5 e 90% confluentes, remova o meio MSCGM, enxague as células com RPMI livre de soro (sem glutamina) e adicione 10 mL de solução de nanopartículas de óxido de ferro por frasco de cultura de 150 cm^2, que é o volume mínimo necessário para cobrir todas as células.
4. Incubar a 37 °C e 5% de CO₂ por 30 min e depois descartar a solução de nanopartículas. Lave uma vez com RPMI-1640 livre de soro (sem glutamina) e incubar com o Médio Águia Modificado (DMEM) de Dulbecco complementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina (25 mL por frasco de 150 cm²⁾ durante a noite a 37 °C e 5% de CO₂ para permitir uma internalização completa das nanopartículas.

3. Formação de células-tronco-esferóides

1. Prepare-se recentemente o meio de cultura celular-esferóide composto de DMEM alta glicose com L-glutamina suplementada com ácido L-ascórbico 2-fosfato, 0,1 μM dexametasona, 1 mM piruvato de sódio, 0,35 mM L-proline e 1% suplemento de cultura universal contendo insulina, transferrina humana e ácido selenous (ITS-Premix).
2. Retire os MSCs magnéticos adicionando 10 mL de 0,05% trypsin-EDTA pré-aquecido a 37 °C por 150 cm² frasco por 2-3 minutos. Quando as células forem separadas, inative imediatamente a trippsina adicionando 1/3 do volume de DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% penicilina-estreptomicina pré-aquecida a 37 °C.
3. Centrifugar as células dissociadas a 260 x g por 5 min, aspirar a mídia e suspender as células em um pequeno volume (menos de 1 mL por frasco de 150 cm²) de meio de cultura esferoide celular, como ter 200.000 células em cerca de 50 μL de meio. Conte o número da célula usando um hemócito e ajuste o volume se necessário.
4. Adicione 1 mL de cultura esféide celular recém-preparada em um tubo de centrífuga cônica estéril de 15 mL e adicione o volume de solução resuspended correspondente a 200.000 células.
5. Centrifugar essas células magneticamente rotuladas a 180 x g por 3 min, como formar uma pelota celular na parte inferior do tubo e manter o supernasce, que é o meio de cultura celular.
6. Abra ligeiramente os tubos para permitir a troca de ar e incubar a 37 °C com 5% de CO₂ por até 21 dias, tempo de cultura ao longo do qual as células formam uma estrutura 3D coesa que resulta em um esferoide totalmente formado. Troque o meio duas vezes por semana.
7. Em determinados dias, lave os esferoides duas vezes com tampão de cacodilato feito de 0,2 M de cacodilato diluído em água desmineralizada e fixe-os usando 2% glutaraldeído em 0,1 M tampão de cacodilato diluído em água destilada por 30 min à temperatura ambiente. Armazene os esferoides fixos em PBS até ser usado para medição VSM ou imagem TEM. Essa etapa de fixação interrompe todos os processos biológicos e permite a conservação a longo prazo.

4. Quantificação de nanopartículas magnéticas na solução e em celulose usando um magnetômetro de amostra vibratória (VSM)

1. Coloque um determinado volume de solução de nanopartícula magnética (máximo de 10 μL) ou um único esferoide celular no suporte de amostra especificamente projetado para caber no VSM.
2. Insira a amostra no VSM e escaneie para deslocamento da amostra. Coloque a amostra na posição correspondente ao máximo de magnetização.
3. Realize a primeira medição em um campo magnético baixo (entre -1500 Oe e +1500 Oe) com uma taxa de 20 Oe/s.
4. Realize uma segunda medição em um campo magnético alto (entre -30 000 Oe e +30 000 Oe) com uma taxa de 200 Oe/s.

5. Análise de Microscopia eletrônica de transmissão (TEM)

1. Para as soluções de nanopartículas, deposite 10 μL da solução aquosa em uma rede de cobre revestida de carbono e deixe-a secar à temperatura ambiente.
2. Para as nanopartículas internalizadas nas células, contraste os esferoides de células fixas com Extrato de Chá Oolong (OTE) a 0,5% diluídos em tampão de cacodilato de 0,1 M, pós-correção com 1% de tetroxida de ósmio contendo 1,5% de cianoferato de potássio e depois desidratado em banhos de etanol de grau, incluído em Epon. Corte ultras seções de 70 nm e deposite-as em grades de cooper.
3. Faça imagens usando um microscópio eletrônico a 80 kV com uma ampliação de 1k para a observação de células inteiras a 40k para a observação de compartimentos endossomais.

Resultados

Utilizando a síntese assistida por micro-ondas, nanopartículas magnéticas com um monodisperse 8,8 ± tamanho do núcleo de 2,5 nm são produzidas e revestidas com citrato ou PAA(Figura 1A). As células-tronco são então incubadas com essas nanopartículas dispersas em meio de cultura em uma determinada concentração por 30 minutos, resultando em sua endocitose e confinamento dentro dos endosários celulares(Figura 1B). As células-tronco magnéticas são en...

Discussão

Usando uma síntese rápida e eficiente baseada em micro-ondas, as nanopartículas magnéticas podem ser facilmente sintetizadas, com tamanho controlado e ainda revestidas com moléculas dadas. Um passo crítico é estocar o sal de ferro e o álcool benzílico sob vácuo para manter uma pequena dispersão de tamanho. O álcool benzílico atua tanto como solvente quanto ligante ao mesmo tempo permitindo obter diretamente óxido de ferro descalço sem a necessidade de ligantes adicionais. Após a transferência de nanopart...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
Benzyl alcohol for synthesis	Sigma Aldrich	8.22259
Dexamethasone	Sigma	D4902	Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C
Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR	VWR Chemicals	23367
DMEM with Glutamax I	Life Technologies	31966-021	No sodium pyruvate, no HEPES
Ethanol absolute	VWR	20821.310
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10270-106
Formalin solution 10% neutral buffered	Sigma	HT5012
Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution	Alfa Aesar	35640
Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%)	Sigma Aldrich	517003
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)	Corning	354352
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma	A8960	Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water
L-Proline	Sigma	P5607	Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C
Mesenchymal Stem Cell (MSC)	Lonza	PT-2501
Monowave glass vial	Anton Paar	82723_us
Microwave reactor	Anton Paar	Monowave 300
MSCGM BulletKit medium	Lonza	PT-3001	For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium
PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2	Life Technologies	14190-094
Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL)	Life Technologies	15140-122
Poly(acrylic acid, sodium salt)	Sigma Aldrich	416010	MW = 1200 g/mol
RPMI medium 1640, no Glutamine	Life Technologies	31870-025	No sodium pyruvate, no HEPES
Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution	Alfa Aesar	35629
Sodium pyruvate solution 100mM	Sigma	S8636
Sterile conical centrifuge tube	Falcon	352097	15 mL tubes
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300054
Tri-sodium citrate	VWR	33615.268	Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C
Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis	Sigma Aldrich	10396430
Ultra centrifugal filter	Amicon	AC S510024