In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para realizar manipulação genética no cérebro de furão embrionário usando na eletroporação uterónica. Este método permite o direcionamento de células progenitoras neurais no neocórtex in vivo.

Resumo

A manipulação da expressão genética in vivo durante o desenvolvimento embrionário é o método de escolha ao analisar o papel dos genes individuais durante o desenvolvimento dos mamíferos. No útero a eletroporação é uma técnica-chave para a manipulação da expressão genética no cérebro embrionário mamífero in vivo. Um protocolo para a eletroporação uterópica do neocórtex embrionário de furões, um pequeno carnívoro, é apresentado aqui. O furão está cada vez mais sendo usado como modelo para o desenvolvimento do neocórtex, pois seu neocórtex exibe uma série de características anatômicas, histológicas, celulares e moleculares que também estão presentes em primatas humanos e não humanos, mas ausentes em modelos de roedores, como rato ou rato. No útero a eletroporação foi realizada no dia embrionário (E) 33, um estágio de midneurogenesis no furão. No útero a eletroporação tem como alvo células progenitoras neurais que revestem os ventrículos laterais do cérebro. Durante a neurogênese, essas células progenitoras dão origem a todos os outros tipos de células neurais. Este trabalho mostra resultados e análises representativas no E37, no dia pós-natal (P) 1 e P16, correspondentes a 4, 9 e 24 dias após a eletroporação uterativa, respectivamente. Em estágios anteriores, a progênia das células-alvo consiste principalmente de vários subtipos progenitores neurais, enquanto em estágios posteriores a maioria das células rotuladas são neurônios pós-metóticos. Assim, na eletroporação uterópora permite o estudo do efeito da manipulação genética nas características celulares e moleculares de vários tipos de células neurais. Através de seu efeito em várias populações celulares, na eletroporação uterópica também pode ser usado para a manipulação de características histológicas e anatômicas do neocórtex furão. É importante ressaltar que todos esses efeitos são agudos e são realizados com uma especificidade espostetorial determinada pelo usuário.

Introdução

O neocórtex é a folha externa do cerebrum mamífero e a sede de funções cognitivas mais altas^1,,2,3,4,5. Para alcançar uma manipulação genética aguda no neocórtex mamífero in vivo durante o desenvolvimento embrionário, dois métodos diferentes foram explorados: infecção viral⁶ e na eletroporação^{uterónica 7}. Ambos os métodos permitem um direcionamento eficiente de células neocorticais, mas sofrem de algumas limitações. A maior vantagem da eletroporação uteiremida em relação à infecção viral é a capacidade de alcançar especificidade espacial dentro do neocórtex, que é alcançado pela regulação da direção do campo elétrico.

Desde que a eletroporação foi mostrada pela primeira vez para facilitar a entrada de DNA nas células in vitro^8,ela foi aplicada para entregar DNA em vários vertebrados in vivo. Na neurociência do desenvolvimento, a eletroporação utero do neocórtex do camundongo foi relatada pela primeira vez em 2001^9,10. Este método consiste em uma injeção da mistura de DNA no ventrículo lateral do cérebro embrionário e posterior aplicação do campo elétrico usando eletrodos de pinça, o que permite precisão espacial^7,,11. A eletroporação utero tem sido aplicada desde então para fornecer ácidos nucleicos a fim de manipular a expressão de genes endógenos ou emplacados no neocórtex do camundongo. Importantes progressos foram feitos recentemente, aplicando a metodologia de edição de genoma mediado por CRISPR/Cas9 via eletroporação utero no neocórtex do camundongo para realizar (1) interrupção genética nos neurônios pós-metóticos^12,,13 e células progenitoras neurais¹⁴, e (2) genoma¹⁵ e edição epigenome^16.

Logo após o primeiro relato em camundongos, na eletroporação uterónica foi aplicado ao neocórtex de rato embrionário^17,18. Os não roedores permaneceram um desafio até que a primeira eletroporação uterópica de furões, um pequeno carnívoro, foi relatada em 2012^19,20. Desde então, no útero a eletroporação de furões tem sido aplicada para estudar os mecanismos de desenvolvimento do neocórtex rotulando progenitores neurais e neurônios^20,21,22,,23, manipulando a expressão de genes endógenos, incluindo o uso da tecnologia CRISPR/Cas9²⁴, e fornecendo genes ectópicos^21,22,,25, incluindo genes humanos-específicos²⁶. Além disso, a eletroporação utero de furões tem sido usada para abordar características do desenvolvimento do neocórtex humano em condições patológicas^27,28.

No contexto do desenvolvimento do neocórtex, as vantagens de usar furões como organismo modelo em comparação com camundongos se devem ao fato de que os furões melhor recapitulam uma série de características humanas. No nível anatômico, os furões exibem um padrão característico de dobramento cortical, que também está presente no ser humano e na maioria dos outros primatas, mas está completamente ausente em camundongos ou ratos^{4,,29,,30,,31}. No nível histológico, os furões têm duas zonas germinals subventriculares distintas, conhecidas como zonas subventriculares internas e externas (ISVZ e OSVZ,^{respectivamente) 32,33}, separadas pela camada interna de fibra²³. Essas características também são compartilhadas com primatas, incluindo humanos, mas não com camundongos³⁴. O ISVZ e o OSVZ em furões e humanos são povoados com abundantes células progenitoras neurais, enquanto a zona subventricular (SVZ) de camundongos contém apenas progenitores neurais esparsos^{21,,32,,35,,36}. A nível celular, os furões apresentam uma alta proporção de um subtipo de progenitores neurais referidos como glia radial basal ou externa (bRG ou oRG, respectivamente), que são considerados instrumentais para a expansão evolutiva do neocórtex mamífero^34,,37,38. bRG são, portanto, altamente abundantes no neocórtex do furão humano e embrionário fetal, mas são muito raros no neocórtex do camundongo embrionário^35,36. Além disso, o furão bRG apresenta heterogeneidade morfológica semelhante à do bRG humano, muito superior ao do mouse bRG²¹. Finalmente, em nível molecular, o desenvolvimento do neocórtex furão mostra padrões de expressão genética altamente semelhantes aos do neocórtex humano fetal, que presume-se controlar o desenvolvimento da dobra cortical, entre outras coisas³⁹.

As características biológicas e moleculares das características biológicas e moleculares do furão bRG tornam-nas altamente proliferativas, semelhantes à bRG humana. Isso resulta em um aumento da produção de neurônios e desenvolvimento de um neocórtex expandido e altamente complexo³⁴. Essas características tornam os furões excelentes organismos modelo para estudar características humanas do desenvolvimento de neocórtex que não podem ser modelados em camundongos^26,40. Para aproveitar ao máximo o furão como organismo modelo, foi desenvolvido o método apresentado. Consiste na eletroporação uterópica de embriões furões furões E33 com um plasmídeo expressando GFP (pGFP) sob o controle de um promotor onipresente, CAG. Os embriões eletroporados podem então ser analisados embrionáriamente ou postalmente. Para reduzir o número de animais sacrificados, os furões fêmeas (jills) são esterilizados pela histerectomia e doados para adoção como animais de estimação. Se os embriões-alvo forem colhidos em estágios embrionários, uma segunda cirurgia é realizada e os embriões são removidos por cesariana, enquanto os jills são histerectomizados. Se os embriões-alvo forem analisados em estágios pós-natal, os jills são histerectomizados após os filhotes serem desmamados ou sacrificados. Por isso, também é apresentado um protocolo para a histerectomia dos jills.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com a Legislação Alemã de Bem-Estar Animal após aprovação da Landesdirektion Sachsen (licenças TVV 2/2015 e TVV 21/2017).

1. Preparação para eletroporação uterativa

1. Prepare a mistura de DNA. Neste protocolo é utilizada uma concentração final de 1 μg/μL de pGFP. Dissolva o DNA em PBS e complemente com 0,1% Fast Green para facilitar a visualização. Uma vez preparado, misture a mistura de DNA por pipetting para cima e para baixo várias vezes ou por toques de dedos. Armazene em temperatura ambiente até usar.
   NOTA: Para coeletrões, a mistura de DNA é preparada para conter uma concentração final de 1 μg/μL de codificação plasmida de um gene de interesse juntamente com 0,5 μg/μL de pGFP diluído em PBS.
2. Prepare a mesa de cirurgia com todas as ferramentas e instrumentos necessários.
3. Puxe capilares de vidro usando o puxador de micropipette. Ajuste o diâmetro da ponta capilar cortando a parte distal do capilar usando fórceps como descrito anteriormente⁴¹.

2. Preparação de furões para cirurgia

1. Mantenha as jills grávidas com embriões no E33 em jejum por pelo menos 3h antes da cirurgia para reduzir o risco de vômito.
2. Antes da cirurgia, esterilize todas as ferramentas autoclavando. Realizar a cirurgia em uma sala especialmente designada em condições assépticas para eliminar possíveis fontes de contaminação.
3. Coloque a jill grávida na caixa de narcose com 4% de isoflurane.
4. Quando anestesiado, coloque o furão sobre a mesa de operação com uma almofada de calor e conecte a máscara de narcose com um fluxo constante de 2 a 3% de isoflurane no nariz. Para garantir o nível adequado de anestesia, verifique se há falta dos seguintes reflexos:
   1. O reflexo palpebral tocando a pele periocular
   2. O reflexo flexor beliscando a pele entre o^2º e o 3º^,ou^3º e^4º dedo dos dois membros traseiros
   3. Se o reflexo palpebral estiver ausente e o reflexo flexor for claramente reduzido, verifique se o reflexo da dor belisca um dedo do pé de cada membro traseiro.
      NOTA: Certifique-se de ter um estetoscópio à mão para monitorar a frequência cardíaca e o ritmo, se necessário.
5. Injete o furão subcutâneamente com analgésico (0,1 mL de metamizol, 50 mg/kg de peso corporal), antibiótico (0,1 mL/kg de peso corporal de 20 mg/kg de amoxicilina + ácido clavulanic) e glicose (10 mL de solução de glicose de 5%).
6. Coloque uma solução de pomada nos olhos para evitar a desidratação dos olhos durante o procedimento cirúrgico.
7. Raspe a barriga do furão usando uma máquina de barbear.
8. Limpe a pele com água e sabão, desinfete a barriga com 70% de esfoliante de etanol, desinfete 2x com iodo e deixe secar.

3. Na eletroporação uterópica de furões

1. Certifique-se de que a área cirúrgica é estéril: coloque ferramentas cirúrgicas estéreis em tecidos estéreis e troque de casaco e luvas.
2. Coloque uma cortina cirúrgica estéril no animal.
3. Usando um bisturi, abra cirurgicamente a barriga na linea alba com um corte de ~5 cm de comprimento.
4. Corte a camada muscular usando uma tesoura.
5. Coloque os cotonetes de gaze ao redor do local da incisão e molhe-os com PBS. Os cotonetes absorverão o PBS adicional que será adicionado durante a cirurgia.
   NOTA: Mantenha o suporte de calor e PBS durante toda a cirurgia.
6. Exponha o útero do furão e coloque-o nos cotonetes de gaze.
7. Carregue um capilar de vidro com a solução de injeção usando uma pipeta com uma ponta de carregamento longa. Certifique-se de que o volume de carregamento esteja aproximadamente entre 5-20 μL, dependendo do número de embriões e do número de condições experimentais diferentes. O volume médio injetado por embrião é de 3 a 5 μL. Conecte o capilar de vidro carregado a um suporte e conecte o outro lado do suporte a um tubo e a um bocal.
8. Inspecione o primeiro embrião e encontre a cabeça.
9. Coloque a fonte de luz de fibra óptica ao lado da cabeça do embrião para facilitar a visualização.
   NOTA: As paredes uterinas do furão são muito escuras, e é difícil ver através delas a menos que a luz esteja brilhando diretamente sobre elas.
10. Realize uma única injeção intraventricular no ventrículo de um dos hemisférios cerebrais e mantenha o outro hemisfério intacto para servir como controle interno. O ventrículo em si não é facilmente distinto pelo olho, por isso sua localização é estimada com base na localização da íris pigmentada, que é visível. A injeção intraventricular é feita pegando o suporte preso ao capilar de vidro e penetrando na pele, crânio e tecido cerebral com a ponta do capilar de vidro.
    NOTA: Certifique-se de não danificar a placenta, que é mais escura que placentas murinas.
    1. Quando a ponta do capilar de vidro estiver no ventrículo, injete aproximadamente 3-5 μL da solução de injeção por tubos bucais usando o porta-voz conectado ao suporte capilar de vidro. Como a solução injetada contém 0,1% de Verde Rápido, o ventrículo injetado agora ficará verde escuro, e será visível como uma estrutura em forma de rim.
11. Coloque os eletrodos da pinça no útero acima da cabeça do embrião para que o polo positivo seja colocado acima da área que será alvo e o polo negativo abaixo da área injetada.
12. Defina as seguintes condições de eletroporação no eletroporador: Comprimento do pulso = 50 ms; Tensão de pulso = 100 V; Intervalo de pulso = 1 s; Número de pulsos = 5. Em seguida, pressione o botão "Pulse" no eletroporador.
13. Solte rapidamente várias gotas de 1x PBS quente no embrião eletroporado.
14. Repita o procedimento para todos os embriões. Mantenha o útero constantemente molhado com PBS quente.
    NOTA: Se os primeiros embriões voltados para a vagina não são facilmente acessíveis, é melhor não eletroporá-los.
15. Quando todos os embriões estiverem eletroporados, coloque o útero de volta na cavidade peritoneal.
16. Sutura a camada muscular com o peritônio usando uma sutura 4-0.
17. Suturar a pele usando a mesma espessura e pulverizar a ferida com spray de alumínio.
18. Coloque o animal em uma gaiola e mantenha aquecido com uma fonte de calor. Monitore cuidadosamente o animal até que ele acorde.

4. Cuidados pós-operatórios e moradia de animais-alvo

1. Durante 3 dias após a cirurgia, certifique-se de que os animais estejam passando pelos seguintes cuidados pós-operatórios: 20 mg/kg de amoxicilina (antibiótico) 1x por dia; 25 mg/kg metamizol (analgésico) 3x diariamente.
2. Certifique-se de que os furões estejam alojados individualmente.
3. Certifique-se de que os furões são examinados por um veterinário pelo menos 1x por dia.
4. Certifique-se de que os furões sejam perturbados o mínimo possível durante a entrega.
5. Depois que os filhotes forem desmamados ou sacrificados, preparem os jills para histerectomia.

5. Histerectomia de furões

NOTA: Uma histerectomia é realizada para reduzir o número de animais sacrificados para que os animais esterilizados possam ser doados para adoção como animais de estimação. O procedimento pré-cirúrgico para histerectomia é o mesmo da etapa 2.

1. Raspe e esterilize a barriga do furão conforme descrito nas etapas 3.1 e 3.2.
2. Abra cirurgicamente a barriga na linhaa alba. Corte a camada muscular. Levante a camada muscular e proteja o intestino com um dedo enquanto abre totalmente a camada muscular.
3. Coloque os cotonetes de gaze ao redor do local da incisão e molhe-os com PBS estéril. Exponha o útero furão e os ovários e coloque-os nos cotonetes de gaze.
4. Inicie a histerectomia de um lado ligando a arteria ovarica e vena ovarica cranial ao mesovar. Coloque um grampo em cada lado da ligadura e realize outra ligadura craniana nos grampos. Coloque o terceiro grampo nas extremidades da ligadura para salvá-los. Repita do outro lado.
5. Corte entre os grampos e desprende o cornua uteri da mesenteria de ambos os lados.
6. Ligate a arteria uterina em ambos os lados uterinos caudal para ostium uteri. Em seguida, ligar a vagina e consertar a ligadura. Coloque o grampo nas extremidades das ligaduras para salvá-los. Coloque dois grampos cranianos na ligadura. Corte entre os grampos e desprende o útero da vagina. Remova o útero e os ovários e elimine-os. Raspe a membrana mucosa residual da bunda do útero.
7. Retire todos os grampos restantes e encurte as extremidades da ligadura. Certifique-se de controlar o sangramento depois que os grampos tiverem sido removidos.
8. Sutura a camada muscular e a pele como descrito nas etapas 3.16 e 3.17. Siga o protocolo pós-operatório como nas etapas 3.18 e 4.1-4.3. Mantenha os animais na unidade animal por pelo menos 2 semanas com visitas veterinárias regulares. Depois que os animais forem totalmente recuperados, eles podem ser doados para adoção.

Resultados

Na eletroporação uterino de furões na E33 resultou na segmentação das células progenitoras neurais que revestem a superfície ventricular do neocórtex embrionário (Figura 1). Essas células são chamadas de progenitoras apical e são altamente proliferativas, dando origem a todos os outros tipos de células durante o desenvolvimento. Após a divisão assimétrica, os progenitores apical geraram outro progenitor apical e uma célula mais diferenciada, tipicamente um progenitor basal (...

Discussão

No útero a eletroporação no furão é uma técnica importante, com vantagens e desvantagens em relação a outros métodos. Existem etapas e limitações críticas para este método, bem como possíveis modificações e aplicações futuras para ter em mente.

Desde o pioneirismo de Victor Borrell e colegas sobre manipulação genética do neocórtex do furão pós-natal via eletroporação ou injeção viral^35,42,

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1ml syringe	BD	309628	Electroporation
4-0 Vicryl suture	Ethicon	V392ZG	Surgery
Aluminium spray	cp-pharma	98017	Surgery
Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU)	WDT	6301	Surgery
Cappilary holder	WPI	MPH6S12	Electroporation
Dexpanthenol Ointment solution	Bayer	6029009.00.00	Surgery
Drape sheet 45x75cm	Hartmann	2513052	Surgery
Electrode Tweezer, platinum plated 5mm	BTX	45-0489	Electroporation
Electroporator	BTX	ECM830	Electroporation
Fast Green	Sigma	F7258-25G	Electroporation
Ferret Mustela putorius furo	Marshall	NA	Experimental organism
Fiber optic light source	Olympus	KL1500LCD	Electroporation
Forceps	Allgaier instrumente	08-033-130	Surgery
Forceps 3C-SA	Rubis Tech	3C-SA	Surgery
Forceps 55	Dumostar	11295-51	Surgery
Forceps 5-SA	Rubis Tech	5-SA	Surgery
Gauze swabs large	Hartmann	401723	Surgery
Gauze swabs small	Hartmann	401721	Surgery
GFAP antibody	Dako	Z0334	Antibody
GFP antibody	Aves labs	GFP1020	Antibody
Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length)	Sutter Instrument	BF120-69-10	Electroporation
Glucose	Bela-pharm	K4011-02	Surgery
Heat pad	Hans Dinslage	Sanitas SHK18	Surgery
Iodine (Betadine solution 100 mg/ml)	Meda	997437	Surgery
Isofluran	CP	21311	Surgery
Loading tips 20µl	Eppendorf	#5242 956.003	Electroporation
Metamizol	WDT	99012	Surgery
Metzenbaum dissecting scissors	Aesculap	BC600R	Surgery
Micropipette puller	Sutter Instrument	Model P-97	Electroporation
pCAGGS-GFP	NA	NA	From Kalebic et al., eLife, 2018
PCNA antibody	Millipore	CBL407	Antibody
pH3 antibody	Abcam	ab10543	Antibody
Scalpel	Aesculap	294200104	Surgery
Shaver	Braun	EP100	Surgery
Sox2 antibody	R+D Systems	AF2018	Antibody
Surgical clamp 13cm	WDT	27080	Surgery
Surgical double spoon (Williger)	WDT	27232	Surgery
Surgical drape	WDT	28800	Surgery
Surgical scissors small	FST	14090-09	Surgery
Suturing needle holder	Aesculap	BM149R	Surgery
Tbr2 antibody	Abcam	ab23345	Antibody
Transfer pipette 3ml	Fischer scientific	13439108	Surgery
Water bath	Julabo	TW2	Surgery