Modelando metástases cerebrais através de injeção intracraniana e ressonância magnética

Resumo

A modelagem da metástase cerebral intracraniana é complicada pela incapacidade de monitorar o tamanho do tumor e a resposta ao tratamento com métodos precisos e oportunos. A metodologia apresentada casais injeção de tumor intracraniano com análise de ressonância magnética, que, quando combinada, cultiva injeções precisas e consistentes, monitoramento animal aprimorado e medições precisas de volume de tumor.

Resumo

A disseminação metastática do câncer é uma consequência infeliz da progressão da doença, subtipos agressivos do câncer e/ou diagnóstico tardio. Metástases cerebrais são particularmente devastadoras, difíceis de tratar e conferem um prognóstico ruim. Embora a incidência precisa de metástases cerebrais nos Estados Unidos permaneça difícil de estimar, é provável que aumente à medida que as terapias extracranais continuam a se tornar mais eficazes no tratamento do câncer. Assim, é necessário identificar e desenvolver novas abordagens terapêuticas para tratar a metástase neste local. Para isso, a injeção intracraniana de células cancerosas tornou-se um método bem estabelecido para modelar a metástase cerebral. Anteriormente, a incapacidade de medir diretamente o crescimento do tumor tem sido um empecilho técnico para este modelo; no entanto, o aumento da disponibilidade e da qualidade das pequenas modalidades de imagem animal, como a ressonância magnética (RM), estão melhorando consideravelmente a capacidade de monitorar o crescimento do tumor ao longo do tempo e inferir alterações no cérebro durante o período experimental. Aqui, a injeção intracraniana de células tumorais mamárias de murina em camundongos imunocompetuntes seguidos de ressonância magnética é demonstrada. A abordagem de injeção apresentada utiliza anestesia isoflurane e uma configuração estereotática com uma broca automatizada e injeção de agulha controlada digitalmente para melhorar a precisão e reduzir o erro técnico. A ressonância magnética é medida ao longo do tempo usando um instrumento 9.4 Tesla no Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. As medidas de volume do tumor são demonstradas em cada ponto de tempo através do uso do ImageJ. No geral, essa abordagem de injeção intracraniana permite injeção precisa, monitoramento diário e medições precisas de volume de tumor, que combinaram muito a utilidade deste sistema modelo para testar novas hipóteses sobre os condutores de metástases cerebrais.

Introdução

Metástases cerebrais são 10 vezes mais comuns do que tumores do sistema nervoso central adulto¹, e têm sido relatados em quase todos os tipos de tumores sólidos com câncer de pulmão, câncer de mama e melanoma apresentando a maior incidência². Independentemente do local do tumor primário, o desenvolvimento da metástase cerebral leva a um prognóstico ruim frequentemente associado ao declínio cognitivo, dores de cabeça persistentes, convulsões, mudanças comportamentais e/ou de personalidade^1,,3,,4,5. Em termos de câncer de mama, houve muitos avanços na prevenção e tratamento da doença. No entanto, 30% das mulheres diagnosticadas com câncer de mama continuarão a desenvolver metástases, e das com doença em estágio IV, aproximadamente 7% (SEER 2010-2013) têm metástase cerebral^6,7. As opções atuais de tratamento para metástase cerebral envolvem ressecção cirúrgica, radiocirurgia estereotática e/ou radioterapia cerebral completa. No entanto, mesmo com essa terapia agressiva, a sobrevida mediana desses pacientes é de 8 a 11 meses^7,8,,9. Essas estatísticas sombrias apoiam fortemente a necessidade de identificação e implementação de novas e eficazes estratégias terapêuticas. Assim, como acontece com todos os cânceres que se metástases no cérebro, é essencial modelar adequadamente a metástase cerebral associada ao câncer de mama (BCBM) em laboratório para garantir avanços significativos no campo.

Até o momento, os pesquisadores utilizaram uma variedade de metodologias para estudar mecanismos de metástase no cérebro, cada uma com distintas vantagens e limitações^10,11. Métodos experimentais de metástase, como veia da cauda e injeção intracardiac, espalham células tumorais por todo o corpo e podem resultar em imensa carga tumoral em outros locais metastáticos, dependendo das células injetadas. Esses resultados são então confundidos se especificamente estudar metástase para o cérebro. O método de injeção da artéria intracarotóide é vantajoso, pois visa especificamente a semeadura cerebral de células tumorais, mas é limitado, pois pode ser tecnicamente difícil de executar. A ressecção do tumor primário ortotópico é frequentemente considerada o modelo mais clinicamente relevante de metástase, pois recapitula toda a cascata metastática. No entanto, essa abordagem envolve períodos de espera prolongados para que a metástase espontânea ocorra com taxas dramaticamente menores de metástase cerebral em comparação com outros locais metastáticos, como o linfonodo, o pulmão e o fígado. Muitas vezes, os animais devem ser removidos de estudos devido à carga tumoral nesses outros locais metastáticos antes do desenvolvimento da metástase cerebral. Outros métodos que envolvem linhas de células trópicos cerebrais são eficazes na metástase do cérebro; no entanto, esses modelos são limitados na forma de que levam tempo para se desenvolver e muitas vezes perdem seu tropismo com a propagação. Diante dessas limitações, os pesquisadores têm usado rotineiramente o método de injeção intracraniana para modelar metástase cancerígena no cérebro^{11,,12,,13,14} com metodologias variadas^{15,,16,,17,,18,,19}. Reconhece-se que essa abordagem tem limitações similares, o mais importante na medida em que não permite a investigação de etapas metastáticas precoces, incluindo a intravasão do tumor primário, a penetração através da barreira cerebral do sangue e o estabelecimento dentro do cérebro. No entanto, permite que os pesquisadores testem (1) quais fatores derivados do tumor mediam o crescimento dentro do cérebro (por exemplo, manipulação genética de um fator oncogênico em células tumorais), (2) como mudanças no microambiente metastático alteram o crescimento do câncer neste local (por exemplo, comparação entre camundongos transgênicos com componentes estrômicos alterados) e (3) eficácia de novas estratégias terapêuticas sobre o crescimento de lesões estabelecidas.

Dada a utilidade potencial do modelo de injeção intracraniana, é absolutamente necessário reduzir o erro técnico durante a injeção e monitorar precisamente o crescimento do tumor ao longo do tempo. O método descrito aqui envolve a dosagem contínua de anestesia de gás inalado, e a implantação direta de células tumorais no parenchyma cerebral usando uma broca estereotática e suporte de injeção. A administração do anestésico a gás permite ajustar a profundidade e o comprimento da anestesia, bem como garantir uma recuperação rápida e suave. Um sistema de injeção de broca e agulha controlado digitalmente aumenta a precisão do local de injeção e reduz o erro técnico frequentemente incorrido por métodos de perfuração e injeção de mão livre. O uso de ressonância magnética (RM) aumenta ainda mais a precisão no monitoramento do crescimento do tumor, volume do tumor, resposta tecidual, necrose tumoral e resposta ao tratamento. A ressonância magnética é a modalidade de imagem escolhida para tecidos moles^20,21. Esta técnica de imagem não usa radiação ionizante e é preferida em relação à Tomografia Computadorizada (TC), especialmente para múltiplas sessões de imagem durante o curso de um estudo. A ressonância magnética tem uma gama muito maior de contraste de tecido mole disponível, em seguida, tomografia computadorizada ou ultrassom (USG) e apresenta anatomia em maior detalhe. É mais sensível e específico para anormalidades dentro do próprio cérebro. A ressonância magnética pode ser realizada em qualquer plano de imagem sem ter que mover fisicamente o sujeito, como é o caso em imagens ópticas 2D USG ou 2D. É importante mencionar que o crânio não atenua o sinal de ressonância magnética como em outras modalidades de imagem. A ressonância magnética permite a avaliação de estruturas que podem ser obscurecidas por artefatos do osso em TC ou USG. Uma vantagem adicional é que existem muitos agentes de contraste disponíveis para ressonância magnética, o que aumenta o limite de detecção de lesões, com toxicidade relativamente baixa ou efeitos colaterais. É importante ressaltar que a ressonância magnética permite o monitoramento em tempo real ao contrário da avaliação histológica no momento da necropsia, que é limitada na decifração do volume do tumor. Outras modalidades de imagem, como a bioluminescente, são de fato eficazes para detecção e monitoramento precoce de tumores ao longo do tempo; no entanto, este método requer manipulação genética (por exemplo, marcação luciferase/GFP) de linhas celulares e não permite medições volumétricas. A ressonância magnética é ainda mais vantajosa, pois espelha o monitoramento do paciente e a análise volumosa das imagens de RM é conhecida por estar fortemente correlacionada com o tamanho do tumor histológico na necropsia²². O monitoramento serial com a triagem de ressonância magnética também aumenta o monitoramento clínico dos prejuízos neurológicos, caso surjam.

No geral, o método apresentado de injeção de tumor intracraniano estereotático seguido de ressonância magnética serial nos permite produzir resultados confiáveis, previsíveis e mensuráveis para estudar mecanismos de metástase cerebral no câncer.

Protocolo

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Estadual de Ohio (P.I. Gina Sizemore; Protocolo #2007A0120). Todas as políticas de cirurgia de sobrevivência de roedores são seguidas, incluindo o uso de técnicas estéreis, suprimentos, instrumentos, bem como remoção de peles e preparação estéril do local da incisão.

1. Injeção intracraniana de células cancerígenas de mama

NOTA: O método aqui descrito utilizou a linha de células tumorais mamárias DB7 de murina derivada de um tumor MMTV-PyMT primário²³. Estudos anteriores estabeleceram a injeção intracraniana de células DB7 como modelo de BCBM com histologia que imita a da doença humana¹². É importante ressaltar que os camundongos FVB/N imuno-competentes são usados para este modelo, pois as células DB7 foram derivadas desta cepa de camundongos. Por se trata de um modelo de câncer de mama, camundongos adultos são usados para esses estudos.

1. Prepare células.
   1. Em um capô estéril, aspirar mídia a partir de placas de cultura celular usando técnicas padrão.
   2. Lave células com 1x DPBS e tentepsinizar usando o protocolo do fabricante.
   3. Adicione um volume apropriado de mídia contendo FBS para parar a reação de trippsina e determinar a concentração de células usando um hemótmetro ou método preferencial.
   4. Células de pelota a 300 x g para 4 min a 4 °C.
   5. Aspirar mídia, lavar com 1x DPBS, re-girar a 300 x g para 4 min a 4 °C.
   6. Células resuspend em 1x DPBS para uma concentração adequada, aproximadamente 50.000 células por volume injetável de 2 μL.
      NOTA: O número do celular depende da agressividade da linha e precisa ser determinado pelo investigador. Utilizamos rotineiramente 2 μL, mas o uso de volumes <6 μL é relatado^{15,16,17,,18,19}. Volumes baixos são cruciais para manter a precisão.
   7. Coloque células resuspended no gelo até injetar para manter a viabilidade.
2. Preparem ratos para a cirurgia.
   1. Para ratos com pele: retire a pele do crânio, seja por creme depilatório/loção ou por barbear. Faça isso dentro de 24-48 h antes da cirurgia, pois realizar este passo muito perto da cirurgia pode interferir na qualidade da pele e na força da sutura.
      NOTA: Camundongos FVB/N femininos pesando aproximadamente 25 g foram utilizados devido ao estudo do câncer de mama metastático, doença predominantemente feminina.
   2. Administrar analgésicos conforme determinado pelo IACUC e veterinário assistente: uma injeção subcutânea de Buprenorphine SR-LAB (dose de 0,05-0,1 mg/kg, Estoque de buprenorfina: 0,5 mg/mL para uma dosagem de 0,0025-0,088 mL) pelo menos 24 h antes da cirurgia para fornecer até 72 h de analgesia, que pode ser repetida 48-72 h após a primeira dose, se necessário. Também administre NSAIDs (20% ibuprofeno em água potável, por exemplo, 1 mg/5 mL) pelo menos 24-48 h antes da cirurgia e continue por 2-7 dias após a cirurgia para fornecer um mínimo de 72 h analgesia pós-operatória.
      NOTA: Na Universidade Estadual de Ohio, o Buprenorphine SR-LAB é administrado pela equipe veterinária de recursos animais do Laboratório Universitário, por ser uma substância controlada.
3. Prepare unidades estereotáticas para cirurgia.
   1. Ligue todas as máquinas de anestesia, escalas Vernier digitais e injetores digitais.
      NOTA: Todas as ferramentas cirúrgicas devem ser adequadamente limpas e esterilizadas antes da cirurgia.
   2. Utilize máquinas anestésicas com fixação de câmara de indução em um gabinete de segurança biológica (Figura 1A).
   3. Certifique-se de que todos os tubos das máquinas de anestesia estejam conectados aos quadros estereotáticos(Figura 1B, inset 1C) e os grampos nos tubos estão abertos para todas as unidades que estão sendo utilizadas. Feche os grampos nos tubos que vão para quadros estereotáticos que não serão usados para cirurgia.
   4. Defina máquinas de anestesia para o fabricante recomendado taxa de fluxo de cone do nariz com base no peso do mouse (por exemplo, 25 g peso animal: taxa de fluxo do cone do nariz 34 mL/min).
      NOTA: O suporte da cabeça incluído nesta configuração estereotática é recomendado apenas para ratos adultos. Certifique-se de que as recomendações do fabricante incluídas com a configuração estereotática sejam seguidas.
   5. Certifique-se de que o anestésico apropriado (por exemplo, isoflurane) pré-preenchido na seringa esteja ligado à máquina de anestesia(Figura 1B).
      NOTA: O excesso de escorvamento da seringa pode fazer com que muita anestesia seja entregue aos camundongos durante a cirurgia e resulte em uma overdose anestésico.
   6. Prepare as brocas torcendo a trava do estágio, inserindo um adaptador de broca e uma broca de 1 mm em cada broca e bloqueie a broca apertando manualmente o bloqueio de brocas.
   7. Anexar brocas nos quadros estereotáticos(Figura 1C).
   8. Limpas seringas Hamilton com 5 lavagens alternadas de 1x DPBS, depois 70% de etanol, e mais uma vez em 1x DPBS. Coloque de lado até que o animal esteja preparado para injeção.
   9. Defina o injetor digital para entregar a uma taxa de 0,4 μL/min e uma meta de 2 μL. Essa taxa e volume permitem a introdução lenta de células tumorais no cérebro, o que reduz a pressão e os danos associados.
4. Coloque ratos em quadros estereotáticos.
   1. Camundongos anestesiado (por exemplo, isoflurane) usando a referida câmara de indução.
   2. Mantenha camundongos durante todo o procedimento em um plano anestésico profundo. A % anestesia administrada pela máquina depende de uma série de fatores, incluindo: taxa de fluxo, grau de estimulação e temperatura corporal. Monitore os camundongos com frequência durante todo o procedimento de profundidade da anestesia avaliando para respirações rítmicas (animal não está ofegante); falta de reflexo palpebral (vibração das pálpebras quando estimulado com aplicador de ponta de algodão); e falta de beliscão do dedo do dedo (retirada de membro sobre o estímulo nocivo de beliscar os dedos dos dedos).
      NOTA: Diferentes cepas de camundongos terão uma resposta diferente à anestesia.
   3. Depois que os ratos estiverem em um plano anestésico apropriado e profundo, transfira os ratos para a unidade estereotática. Use uma almofada de aquecimento enquanto o mouse estiver na máquina estereotática para manter a temperatura corporal e um plano anestésico apropriado.
      NOTA: Para alcançar o perfil baixo, usamos aquecedores de mão ativados por ar colocados dentro de uma caixa de ponta de pipeta invertida (caixa de elevação do mouse na Figura 1D).
   4. Abra a boca do rato e coloque os dentes no cocho da boca localizada na peça do nariz na moldura estereotática(Figura 2A). Deslize o cone do nariz sobre o nariz/boca do mouse(Figura 2B).
      1. Coloque ratos com a cabeça nivelada até a barra de boca. Abra suavemente a boca com a extremidade cega de um aplicador de ponta de algodão e deslize no lugar. Certifique-se de que o cone do nariz está totalmente sobre o nariz do rato ou a anestesia não será entregue corretamente. O cone do nariz não se envolverá com o nariz se os dentes não estiverem sentados dentro deste sulco (Inset Figure 2A).
   5. Usando um cotonete estéril, coloque lubrificante nos olhos de cada um dos olhos do rato. A aplicação do lubrificante ocular mitiga a secagem da córnea e reduz a chance de danos na córnea e complicações pós-operatórias relacionadas ao trauma da córnea.
   6. Estabilize o crânio do mouse deprimindo a barra de ouvido esquerda contra o canthus medial da orelha esquerda, trancando-o no lugar usando o parafuso no quadro estereotático. Em seguida, deslize a barra de ouvido direita contra o canthus medial da orelha direita e aperte firmemente no quadro estereotático(Figura 2B).
      NOTA: Certifique-se de que a cabeça do mouse está nivelada e reta ao colocar as barras de ouvido. Se a cabeça estiver torta ou inclinada, a injeção estará no lugar incorreto do cérebro. As barras de ouvido devem ser apertadas SOMENTE até que o crânio seja imobilizado após a estimulação com sondagem manual moderada.
5. Faça uma janela de calvarial.
   1. Prepare e limpe o couro cabeludo com 3x alternando passa cada uma de uma solução betadina e 70% de etanol. Devido à proximidade do local cirúrgico aos olhos, use a solução betadina sobre o esfoliante cirúrgico.
   2. Utilizando um bisturi estéril, faça uma incisão de 3 mm através da pele ao longo do aspecto mediano central do crânio (seguindo a linha de sutura sagital). O sangramento na incisão deve ser mínimo. Caso ocorra, aplique pressão consistente e firme no local do sangramento com um aplicador de ponta de algodão estéril por >30 segundos.
   3. Identifique e oriente a broca perpendicular ao bregma (Figura 2C),certificando-se de redefinir a escala vernier digital para zero.
   4. Mova a broca 2 mm lateral para a sutura sagital e 1 mm anterior para a sutura coronal(Figura 2C). Para a reprodutibilidade, certifique-se de que a localização à esquerda ou à direita da linha de sutura sagital permanece consistente para todos os animais.
   5. Vire a broca para sua velocidade mais alta. Certifique-se de que a pele seja afastada da broca para evitar danos teciduais causados pela broca giratória e inicie cuidadosamente a broca no crânio. Faça um furo de aproximadamente 0,5 mm de profundidade através da calvária, resultando na janela calvária. Tenha cuidado para não baixar a broca muito longe ou ela perfurará o cérebro. A queda de soro fisiológico estéril no local da broca enquanto a broca está em movimento pode compensar qualquer calor gerado pela máquina que possa causar danos térmicos ao tecido circundante.
   6. Uma vez que a janela calvária seja feita, levante cuidadosamente a broca e remova-a do quadro estereotático.
   7. Limpe as brocas usando 70% de etanol e reserve se for usado novamente. Se não, remova brocas e submerse em 70% de etanol.
6. Injetando células cancerígenas no cérebro
   1. Conecte a unidade injetor automática ao aparelho estereotático(Figura 1D).
   2. Puxe para cima >2 μL de células completamente resuspended em 1x DPBS em uma seringa Hamilton limpa. Certifique-se de resuspend as células imediatamente antes de encher a seringa para reduzir a formação de aglomerados e garantir um chorume celular homogêneo. O ideal é puxar para cima 6-8μL de volume celular para garantir que não haja bolsões de ar/bolhas.
   3. Coloque a seringa Hamilton sobre o aparelho injetor e coloque a agulha para injeção, distribuindo uma pequena quantidade de volume em uma cortina estéril descartável para garantir que o injetor esteja funcionando corretamente. Limpe a seringa com 70% de etanol com aplicador de ponta de algodão(Figura 1D, inset). Isso remove as células tumorais do cano externo do eixo da agulha, reduzindo o risco de semeadura de células tumorais ao longo do trato de injeção.
   4. Alinhe a ponta da agulha ao centro da janela calvária, quase tocando o cerebrum exposto.
   5. Redefinir a escala vernier digital para zero.
   6. Insira lentamente a agulha a uma profundidade de 3 mm no cérebro e deixe a agulha permanecer no cérebro por pelo menos 60 segundos antes de prosseguir. Esse período de tempo permite que o parênquim cerebral se conforme ao redor da agulha, o que reduz a pressão nas costas e a possível expulsão das células tumorais ao longo do trato da agulha.
   7. Selecione Executar na tela do injetor para iniciar a entrega de células ao local de injeção. Levará aproximadamente 5 minutos para injetar esse volume. O tempo prolongado para esta etapa é reduzir os danos secundários causados pela força de injeção no parenchyma cerebral.
   8. Uma vez terminado o protocolo de injeção, permita que a agulha descanse no cérebro por pelo menos 3 minutos, novamente permitindo que o parênquim cerebral se aclimata à injeção.
   9. Depois de pelo menos 3 minutos, levante a agulha do cérebro a uma taxa de 0,75 mm/min. Faça isso de forma extremamente lenta e consistente para reduzir a pressão traseira e o rastreamento do tumor no trato da agulha.
   10. Uma vez que a agulha tenha saído do cérebro, remova cuidadosamente a seringa hamilton do injetor e limpe como descrito na etapa 1.2.8.
   11. Aplique cera óssea quente na janela do calvário usando um cotonete estéril. A cera óssea age como uma barreira física para manter o tumor dentro do crânio.
   12. Feche a incisão (por exemplo, suturas dissolvíveis 5-0 PDS em um simples padrão interrompido ou clipes de sutura, o que for mais confortável para o cirurgião).
   13. Pare a administração da anestesia e remova o rato do aparelho desbloqueando e deslizando para fora das barras de ouvido, deslizando o cone do nariz para fora do rato e desengajando os dentes da barra da boca.
   14. Coloque o mouse em uma gaiola limpa que está em um conjunto mais quente de 37 °C para recuperação. Monitore os camundongos durante a recuperação, que normalmente ocorre de 10 a 15 minutos após a anestesia ter sido interrompida.
   15. Após a recuperação do mouse, monitore os critérios de remoção antecipada conforme determinado pelo IACUC da instituição anfitriã.

2. Ressonância magnética

1. Administre o agente de contraste baseado em Gadolinium (100 μL/20 g mouse de peso corporal de 0,1 M MultiHance) em camundongos por injeção intraperitoneal padrão²⁴ 10-20 minutos antes da imagem. Em seguida, anestesiar usando uma câmara de indução com um anestésico inalado (por exemplo, isoflurane) misturado com 95% O₂ e 5% DE CO₂ (ou seja, gás de ar da sala fornecido).
2. Coloque o mouse em um suporte aquecido para manter a temperatura corporal. Fixar a cabeça com pinças de ouvido e uma barra de mordida, e coloque o suporte no ímã de 9,4 T equipado com uma bobina de superfície cerebral do rato. Mantenha a anestesia durante o tempo de imagem, um estudo normalmente leva cerca de 20 minutos por rato. Monitore a frequência respiratória e a frequência cardíaca (~70 bpm) durante todo o procedimento usando um travesseiro pneumático e um pequeno sistema de monitoramento animal.
3. Obtenha uma imagem localizadora e, em seguida, imagem do cérebro do rato usando uma sequência RARE ponderada T2 (TR = 3500-4228 ms, TE=12 ms, FATOR RARO = 8, FOV=2,0 x 2,0 cm, tamanho da matriz = 256 x 256, 1 mm ou 0,5 mm de espessura de fatia, NA=2-4, 15-30 fatias contíguas) e pós-contraste baseado em Gadolinium Sequência RARA T1 ponderada (TR = 1200 ms, TE=7,5 ms, Fator RARO = 4 , FOV=2,0 x 2,0 cm, tamanho da matriz = 256 x 256, 1 mm ou 0,5 mm de espessura de fatia, NA=2-4, 15-30 fatias contíguas).
4. Após a imagem, coloque o rato em uma gaiola em um conjunto mais quente de 37 °C para recuperação.

3. Medidas volumétricas do tumor

1. Obtenção do volume total do tumor
   1. Abra o arquivo de dados MRI DICOM no ImageJ, um software de processamento de imagens disponível como download gratuito através dos Institutos Nacionais de Saúde (https://imagej.nih.gov/ij/)²⁵.
      NOTA: ImageJ permite a visualização de arquivos DICOM, que são necessários para utilizar as dimensões de pixel incorporado para cálculos de volume de tumor (ver Imagem, Propriedades onde "unidade de comprimento" pode ser definida conforme desejado (por exemplo, mm)).
   2. Use a ferramenta Se seleções à mão livre para desenhar um contorno em torno do tumor. Realize essas seleções em uma sala escura para aumentar a visibilidade. Não ajuste o brilho/contraste para manter a consistência entre as sessões.
   3. Na guia Analisar, selecione Medir para obter a área da região selecionada. Se a unidade de milímetros for escolhida na etapa 3.1.1., a área será dada em milímetros cúbicos. Se desejar, incorpore a Seleção à Mão Livre selecionando ctrl+D. Alterar a cor de saída indo para Editar | Opções | Cor. Converta a imagem em uma imagem RGB (Imagem | Tipo | Cor RGB) antes de salvar como um arquivo .tif.
   4. Proceda com a medição de todas as fatias contendo tumores para um mouse individual e copie valores em um programa de software de análise de dados apropriado (por exemplo, Microsoft Excel ou GraphPad Prism).
   5. Soma as áreas de cada fatia para obter o volume total do tumor. Certifique-se de corrigir a área com base na espessura da fatia (área/espessura).
   6. Etapas completas 3.1.1.-3.1.5. até que todos os camundongos tenham um volume total de tumores. Dada a natureza um tanto subjetiva de delinear os tumores, é ideal se a mesma metodologia for repetida várias vezes e mediada para reduzir o erro técnico.
   7. Para definir barras de escala, abra o arquivo de dados DICOM e vá para Analisar | Ferramentas | Barra de Escala. Uma vez que as dimensões já estão incorporadas no arquivo DICOM, basta escolher o comprimento/largura desejado. Secreta para uma imagem RGB (Imagem | Tipo | Cor RGB) antes de salvar como um arquivo .tif.

Resultados

A Figura 3 supera a quantificação do volume do tumor para um único rato em dois pontos de tempo (dia 7 e dia 10) pós-injeção de células tumorais mamárias murinas. Para este experimento, 50.000 células DB7 foram injetadas, e o cérebro do animal foi avaliado por ressonância magnética. Para cada varredura, foram capturadas 30 fatias (espessura de 0,5 mm). A avaliação das 30 fatias por exame revelou que no dia 7 pós-injeção, 5 fatias apresentaram carga tumoral

Discussão

A utilização da injeção intracraniana seguida de monitoramento serial com ressonância magnética fornece a capacidade única de visualizar o crescimento do tumor com precisão de volume de tumor ao longo do tempo. A aplicação da análise de imagem digital permite a interpretação das lesões cerebrais para volume de tumor, hemorragia, necrose e resposta ao tratamento.

Como em qualquer procedimento, existem passos-chave que devem ser seguidos para o sucesso. Em primeiro lugar, a configu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Materials
Betadine	Purdue Products	19-027132	Povidone-iodine, 7.5%
Bone Wax	Surgical Specialities	903	Sterile and malleable beeswax and isopropyl palmitate
Buponorphine SR-Lab	ZooPharm	N/A	Long acting injectable analgesic 5 mL (0.5 mg/mL) polymetric formulation
Cotton tip applicators	Puritan	25-806 10WC	Sterile long stemmed cotton tip applicators
Eye Ointment	Puralube	17033-211-38	Lubricating petrolatum and mineral oil based ophthalmic ointment
Handwarmers	Hothands	HH2	Air-activated heat packs
Ibuprofen	Up & Up	094-01-0245	100mg per 5mL in liquid suspension
Isoflurane	Henry Schein INC	1182097	Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer
Scalpels	Integra Miltex	4-410	#10 disposable scalpel blade
Skin Glue	Vetbond	1469SB	Skin safe wounds adhesive
Sterile Dressing	TIDI Products	25-517	Individually packed sterile drapes
Suture	Covidien	SP5686G	45cm swedged 5-0 monofilament polypropylene suture
Stereotaxic Unit
High Speed Drill (Foredom)	Kopf	Model 1474	Max of 38,000 RPM
Mouse Gas Anesthesia Head Holder	Kopf	Model 923-B	Mouth bar with teeth hole and nosecone
Non-Rupture Ear Bars	Kopf	Model 922	Ear bars suitable for mouse applications
Stereotaxic Instrument	Kopf	Model 940	Base plate, frame and linear scale assembly with digital readout monitor
Injector
Injector Needle and syringe	Hamilton	80366	26 gauge needle, 51 mm needle length and 10 μL volume syringe
Legato 130A automated Syringe Pump	KD Scientific	P/N: 788130	Programmable touch screen base with automated injector
Anesthesia Machine
SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer	Kent Scientific	SS-01	Digital anesthesia machine
SomnoSuite Starter Kit for mice	Kent Scientific	SOMNO-MSEKIT	Includes induction chamber, 2x anesthesia syringes, 18" tubing, plastic nosecone, 2x waste aneshesia gas canisters