Pré-concentração baseada em papel e isolamento de microvesículos e exosóis

Resumo

Apresentado é um protocolo para fabricar um dispositivo baseado em papel para o enriquecimento efetivo e isolamento de microvesículos e exosóis.

Resumo

Microvesículos e exosóis são pequenas vesículas membranous liberadas para o ambiente extracelular e circuladas por todo o corpo. Por conterem várias biomoléculas derivadas de células parentais, como DNA, mRNA, miRNA, proteínas e lipídios, seu enriquecimento e isolamento são passos críticos para sua exploração como potenciais biomarcadores para aplicações clínicas. No entanto, métodos convencionais de isolamento (por exemplo, ultracentrifugação) causam perdas e danos significativos a microvesculas e exosóis. Esses métodos também requerem múltiplas etapas repetitivas de ultracentrifugação, carregamento e desolação de reagentes. Este artigo descreve um método detalhado para fabricar um dispositivo baseado em papel origami (Exo-PAD) projetado para o enriquecimento efetivo e isolamento de microvesículos e exosóis de forma simples. O design único do Exo-PAD, composto por camadas multi-dobradas semelhantes a acordeões com áreas de amostra convergentes, é integrado à técnica de polarização da concentração de íons, permitindo assim o enriquecimento de cinco vezes dos microvesículos e exosóis em camadas específicas. Além disso, os microvesículos enriquecidos e exosóis são isolados simplesmente desdobrando o Exo-PAD.

Introdução

Microvesículos e exosóis são pequenas vesículas de membrana medindo 0,2−1 μm e 30-200 nm, respectivamente. Eles são secretados no ambiente extracelular por vários tipos diferentes de células^1,,2,,3,,4,5. Eles contêm informações de células parentais na forma de subconjuntos de DNA, mRNA, miRNA, proteínas e lipídios, e circulam por todo o corpo através de vários fluidos corporais, como soro, plasma, urina, fluido cefalorraquidiano, fluido amniótico e saliva^6,,7,,8,,9. Assim, técnicas de isolamento eficiente de microvesículos e exosóis de fluidos biológicos podem proporcionar amplas oportunidades nas áreas do diagnóstico, prognóstico e monitoramento em tempo real da doença, bem como no desenvolvimento de novas terapêuticas.

No entanto, o método de isolamento convencional para microvesículos e exosóis baseados na ultracentrifugação é extremamente demorado e causa perda e contaminação significativas da amostra. Isso porque envolve várias etapas de tubulação e carregamento e descarte de vários reagentes com ultracentrifugação repetida^{5,6,,10,,11,12}. Além disso, o alto estresse de corte induzido pela ultracentrifugação (~100.000 x g) pode causar a lise física de microvesículos e exosóis, gerando baixas taxas de recuperação (5-23%)^6,13,14. Portanto, uma técnica de isolamento altamente eficiente e discreta para microvesculas e exosóis deve ser desenvolvida para reduzir danos e perdas, alcançando assim taxas de recuperação mais elevadas.

Um dispositivo à base de papel origami (Exo-PAD) foi desenvolvido para um isolamento mais simples, suave e altamente eficiente de microvesículos e exosóis⁶. O design do Exo-PAD é um papel multi-dobrado com áreas de amostra conectadas em série que gradualmente diminuem de diâmetro. A técnica de polarização da concentração de íons (ICP), que é um fenômeno nano-eletrocinético que pré-concentra biomoléculas carregadas, foi integrada a este design único. O uso do Exo-PAD resultou em enriquecimento cinco vezes maior dos microvesículos e exosóis em camadas específicas e seu isolamento simplesmente desdobrando o dispositivo. Este artigo descreve o Exo-PAD em detalhes, desde a fabricação e operação geral do dispositivo até a análise de seu uso, para ilustrar o método e mostrar resultados representativos⁶.

Protocolo

1. Fabricação de dispositivos

1. Defina a região a ser impressa em papel usando software de impressora(Tabela de Materiais).
   NOTA: O desenho possui 12 camadas padrão de cera nas quais os diâmetros das áreas de amostra circular gradualmente diminuem de 5 mm a 2 mm(Figura 1A).
2. Imprima cera hidrofóbica nas regiões designadas em ambos os lados do papel de celulose(Tabela de Materiais)utilizando uma impressora de cera comercial(Tabela de Materiais)(Figura 1B).
3. Coloque o papel impresso em cera em um forno de laboratório para 80 s a 120 °C.
   NOTA: Esta etapa permite que a cera atinja o interior do papel, obtendo um refluxo térmico da cera impressa. Com este protocolo de incubação, a resolução do padrão é ~2 mm. Assim, tenha cuidado para não imprimir padrões inferiores a 2 mm. Caso contrário, os padrões serão bloqueados pela cera.
4. Corte o papel impresso em cera com um cortador para fazer dispositivos individuais(Figura 1C).
5. Queda de 5 μL e 2 μL de membrana permeselétrica (por exemplo, Nafion; Tabela de Materiais) sobre as áreas amostrais nas camadas mais à esquerda e à direita, respectivamente (Figura 1D).
6. Coloque as camadas revestidas com a membrana permseleção em uma placa quente a 70 °C por 30 minutos para evaporar o solvente de membrana permseletiva.
7. Sele a superfície mais externa da camada revestida voltada para a solução tampão com fita sensível à pressão, deixando um pequeno orifício.
8. Dobre o dispositivo individual impresso (ou seja, Exo-PAD) para frente e para trás ao longo das linhas brancas.
   NOTA: Ao dobrar o dispositivo, todas as áreas de amostra tornam-se convergentemente conectadas(Figura 1E). Este projeto convergente concentra as linhas de campo elétrico quando a tensão é aplicada para ICP, alcançando uma pré-concentração mais intensiva dos microvesculos e exosóis.

2. Enriquecimento e foco espacial de microvesículos e exosóis pela polarização da concentração de íons

1. Carregar 15 μL da amostra de microvesculas e exosóculos (~3 x 10¹¹ partículas/mL em 0,1x salina tamponada de fosfato [PBS] com 0,05% Tween 20) nas áreas convergentes da amostra por pipetação e esperar alguns segundos para garantir a motação completa de todas as áreas amostrais(Figura 1F).
2. Coloque duas câmaras de acrílico em ambas as extremidades do Exo-PAD e aperte o Exo-PAD com segurança com pequenos clipes de aglutinante para evitar desdobramentos(Figura 1G).
3. Encha as câmaras com 110 μL de PBS 0,1x e insira dois eletrodos Ag/AgCl(Figura 1H).
4. Aplique 30 V nos eletrodos por 20 min utilizando um sistema de medição de fonte de tensão corrente(Tabela de Materiais).
   NOTA: A tensão aplicada gera o fenômeno ICP e, portanto, pré-concentra os microvesculos e exosóis nas camadas 8 e 9 do Exo-PAD.

3. Isolamento dos microvesículos enriquecidos e exosóis

1. Separe o Exo-PAD dobrado das câmaras acrílicas e desdobre o dispositivo para isolar os microvesculas enriquecidas e exosóis das outras camadas(Figura 1I).
2. Esmurra as áreas amostrais nas camadas 8 e 9, onde os microvesículos e exosóis são enriquecidos, para análise a jusante(Figura 1J).

4. Análise de microscopia eletrônica de varredura

1. Fixar os microvesículos enriquecidos e exosóculos imergindo as áreas perfuradas em 2,5% glutaraldeído em 0,1 M tampão de cacodilato de sódio por 1h e em 1% de tetroxida de ósmio em 0,1 M de cacodilato de sódio por 1 h.
   ATENÇÃO: O tetroxida de ósmio é químico altamente venenoso e perigoso. Como o tetroxida de ósmio pode penetrar plásticos, ele deve ser armazenado em vidro. Qualquer manuseio de tetroxida de ósmio deve ser realizado em um capô de fumaça química com luvas de nitrito duplo.
2. Desidratar os microvesculos fixos e exosóis com notas ascendentes de 200 etanol de prova (ou seja, 50%, 70%, 90% e 100%) por 30 min cada.
3. Seque quimicamente a amostra imergindo-a em hexametiletiladisilazane em um desiccador por 30 minutos.
   ATENÇÃO: Hexametiletiladisilazane é um produto químico inflamável e sensível à umidade. Deve ser armazenado em uma área seca e bem ventilada longe das fontes de ignição.
4. Cubra os microvesículos completamente secos e exosóis com ouro/paládio (~20 nm) através de imagens de microscopia eletrônica de varredura (SEM).

5. Análise de rastreamento de nanopartículas

1. Esmurre as áreas amostrais nas camadas 6, 8 e 10 usando um soco de biópsia após 20 minutos de operação do dispositivo.
2. Mergulhe cada área perfurada em solução tampão (0,1x PBS com 0,01% Tween 20).
3. Vórtice por 10 min e centrífuga por 30 s a 6.000 rpm para resuspensar os microvesículos enriquecidos e exosóis.
4. Remova as áreas perfuradas da solução e meça a concentração de microvesculas e exosóis por um instrumento de análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)(Tabela de Materiais).

Resultados

O tempo de operação deve ser otimizado para alcançar o rendimento máximo de recuperação dos microvesículos enriquecidos e exosóis. O tempo insuficiente não permite migração suficiente dos microvesículos e exosóis, o que diminui o enriquecimento, enquanto o tempo excessivo deteriora o foco espacial e, portanto, dispersa os microvesículos e exosóis. Assim, através da etapa de otimização do tempo, pode ser identificado o fator máximo de pré-concentração de microvesículos e exosóis e o local final ond...

Discussão

Embora o Exo-PAD tenha sido utilizado com sucesso para o enriquecimento e isolamento de microvesculas e exosóis, vários pontos críticos devem ser cuidadosamente considerados: 1) o tempo de incubação do forno e a temperatura durante a preparação do dispositivo, 2) tempo de processamento, 3) aplicação de tensão com números de camadas variados e diâmetros da área da amostra, e 4) aplicabilidade às amostras clínicas.

O tempo de incubação e a temperatura dado no protocolo são cond...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ag/AgCl electrodes	A-M Systems, Inc.	531500	0.15" diameter
Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate	Thermo Fisher Scientific	A13101	BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)
Carbonate-Bicarbonate Buffer	Sigma-Aldrich	C3041-50CAP	Carbonate buffer
CorelDraw software (Coral Co., Canada)	Corel Corporation		Printer software to define wax printing region
ColorQube 8870	Xerox Corporation		Wax printer
Chromatography paper grade 1	Whatman	3001-861	Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm
Fluorescent-labeled exosome standards	HansaBioMed Life Sciences, Ltd.	HBM-F-PEP-100	Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)
Keithley 2410 current/voltage source-meter	Keithley Instruments, Inc.		Current–voltage source measurement system
Nafion perfluorinated resin solution	Sigma-Aldrich	31175-20-9	Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water
NanoSight LM10	NanoSight Technology		Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine
Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4)	Thermo Fisher Scientific	10010001