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Resumo

Este artigo fornece protocolos para o projeto e auto-montagem de nanoestruturas de oligômeros de ácido nucleírico de peptídeos modificados gama em misturas de solventes orgânicos.

Resumo

As estratégias atuais em nanotecnologia de DNA e RNA permitem a auto-montagem de uma variedade de nanoestruturas de ácido nucleico em mídia aquosa ou substancialmente hidratada. Neste artigo, descrevemos protocolos detalhados que permitem a construção de arquiteturas de nanofibra em misturas de solventes orgânicos através da auto-montagem de telhas de nucleículos de peptídeos exclusivamente endereçadas, de fio único e gama modificadas (γPNA). Cada telha de fio único (SST) é um oligômero γPNA de 12 bases composto por dois domínios modulares concatenados de 6 bases cada. Cada domínio pode se ligar a um domínio mutuamente gratuito presente em vertentes vizinhas usando complementaridade programada para formar nanofibras que podem crescer até mícrons de comprimento. O motivo SST é feito de 9 oligômeros totais para permitir a formação de nanofibras de 3 hélices. Em contraste com nanoestruturas análogas de DNA, que formam estruturas monodispersas de diâmetro, esses sistemas γPNA formam nanofibras que se agrupam ao longo de suas larguras durante a auto-montagem em misturas orgânicas de solventes. Os protocolos de automontagem descritos aqui, portanto, também incluem um surfactante convencional, Sulfato de Dodecil de Sódio (SDS), para reduzir os efeitos de agrupamento.

Introdução

Construção bem sucedida de numerosas nanoestruturas complexas1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 em mídia aquosa ou substancialmente hidratada feita utilizando ácidos nucleicos de ocorrência natural, tais como DNA1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 e RNA11,12 foi mostrado em trabalhos anteriores. No entanto, os ácidos nucleicos de ocorrência natural sofrem alterações conformais helical duplex ou têm estabilizações térmicas reduzidas nas misturas de solventes orgânicos13,14.

Anteriormente, nosso laboratório relatou um método para a construção de nanofibras de 3 hélices usando mímicas de ácido nucleico sintético modificadas de posição gama chamadas ácidos nucleíricos gama-peptídeos (γPNA)15 (Figura 1A). A necessidade de tal desenvolvimento e aplicações potenciais do ácido nucleico sintético imita pna tem sido discutida no campo16,17. Temos mostrado, através de uma adaptação da estratégia de azulejos mono-encalhados (SST) apresentada para nanoestruturas de DNA18,19,20, que 9 oligômeros γPNA sequencialmente distintos podem ser projetados para formar nanofibras de 3 hélices em misturas de solventes orgânicos aprotic polares selecionados, como DMSO e DMF. Os oligômeros γPNA foram ordenados comercialmente com modificações de (R)-dietileno glicol (mini-PEG) em três posições de γ (1, 4 e 8 posições-base) ao longo de cada oligômero de 12 bases com base em métodos publicados por Sahu et al. 21 Essas modificações gama causam a pré-organização helicoidal associada à maior afinidade de ligação e estabilidade térmica de γPNA em relação ao PNA não modificado.

Este artigo é uma adaptação do nosso trabalho relatado no qual investigamos os efeitos da solução solvente e substituição com DNA na formação de nanoestruturas baseadas em γPNA15. O objetivo deste artigo é fornecer descrições detalhadas do projeto, bem como protocolos detalhados para métodos adaptados a solventes que foram desenvolvidos para a auto-montagem e caracterização da nanofibra γPNA. Assim, introduzimos pela primeira vez a estratégia modular SST, uma plataforma geral para o design de nanoestrutura usando o ácido nucleico sintético imitar PNA.

O tom helicoidal para duplexes PNA foi relatado como sendo de 18 bases por turno em comparação com duplexes de DNA, que passam por uma curva por 10,5 bases(Figura 1B). Portanto, o comprimento de domínio dos SSTs γPNA demonstrados foi definido em 6 bases para acomodar um terço de uma curva completa ou 120° de rotação para permitir a interação entre três helices triangularmente dispostas. Além disso, ao contrário dos motivos SST anteriores, cada SST contém apenas 2 domínios, criando efetivamente uma estrutura de fita 1-dimensional que envolve para formar um feixe de três hélices(Figura 1C). Cada oligômero γPNA de 12 bases é modificado gama nas posições 1, 4 e 8 para garantir uma distribuição uniformemente espaçada de grupos mini-PEG em todo o motivo SST global. Além disso, dentro do motivo, existem dois tipos de oligômeros: fios "contíguos" que existem em uma única hélice e fios "crossover" de hélice(Figura 1D). Além disso, os oligômeros P8 e P6 são rotulados com Cy3 fluorescente (estrela verde) e biotina (oval amarelo),respectivamente (Figura 1D),para permitir a detecção da formação da estrutura usando microscopia de fluorescência. Ao todo, o motivo SST é feito de 9 oligômeros totais para permitir a formação de nanofibras de 3 hélices através da complementaridade programada de cada domínio individual ao domínio correspondente em um oligômero vizinho(Figura 1E).

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Protocolo

1. design de sequência γPNA

  1. Baixe a caixa de ferramentas de design de DNA22 desenvolvida pelo Winfree Lab na Caltech23 na pasta contendo scripts de programação para projetar sequências.
  2. Dentro dessa pasta de design de sequência, abra uma linguagem de programação de quarta geração compatível com a extensão de arquivo ".m", e adicione a pasta "DNAdesign" previamente baixada ao caminho usando o seguinte comando:
    >> addpath DNAdesign
  3. Execute posteriormente o seguinte script chamado "PNA3nanofiber.m" (ver Figura Suplementar 1) usando o seguinte comando:
    >> PNA3nanofiber
  4. Execute este script para criar variáveis chamadas "thisSeqs" e "thisScore". A variável "thisSeqs" contém as sequências dos oligômeros projetados, e "thisScore" é a pontuação de penalidade.
  5. Execute o script várias vezes para obter a pontuação mais mínima. Uma amostra de 20 dessas corridas é mostrada na Tabela 1.
  6. Confirme manualmente a complementaridade watson-crick desejada de cada domínio das sequências geradas para o motivo estrutural SST especificado. As especificações de sequência para a estrutura de nanofibra de 3 hélices são mostradas na Tabela 2.
  7. Verifique o seguinte para sequências geradas.
    1. Evite usar quatro bases C e G consecutivas.
    2. Selecione manualmente sequências específicas para funcionalização de n-terminal com moléculas de corante fluorescente e biotina para permitir estudos de microscopia fluorescente.
    3. Inclua um mínimo de 3 mini-PEG modificações gama na espinha dorsal para permitir a conformação helicoidal pré-organizada nos oligômeros de uma única cadeia, conforme descrito por Sahu et al. 21

2. Preparação de fios de estoque γPNA

  1. Obtenha fios de componentes γPNA de sequências especificadas em síntese de escala de 50 nmol com purificação de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) de um fabricante comercial.
  2. Resuspend cada fio em água deionizada para concentrações de 300 μM. Armazene os fios resuspendados em -20 °C congelador até vários meses até que seja necessário para experimentação.

3. Estudos de curvas de fusão de subconjuntos de oligômeros γPNA

  1. Obtenha faixas de temperatura de fusão para diferentes combinações de subconjuntos complementares de 2-oligômeros e 3-oligômeros executando um estudo de curva de derretimento em tampões aquosos como 1x salina tamponada fosfato (PBS) ou solvente orgânico polar preferido, como Dimethylformamida (DMF) ou sulfoxida dimetil (DMSO) (ver Figura 2).
    NOTA: As curvas de fusão térmica em >50% do DMF começam a perder a linha de base superior e apresentam distúrbios graves em parte devido à alta absorção de DMF no comprimento de onda necessário para os experimentos. Este é um fenômeno notável na literatura24. No entanto, é possível obter as curvas de fusão a 5 μM por retração concentrações nestas condições de solvente.
    1. Alíquota de 16,7 μL do estoque de 300 μM de cada oligômero e faça o volume final para um DMF de 1000 μL, seja em 1x PBS ou 100% (v/v) DMSO ou 100% (v/v) DMF efetivamente obtendo 5 μM de concentração final por oligômero. Transfira esta mistura de subconjunto de oligômero para um caminho óptico de 1 cm, cuvette de quartzo.
    2. Realize experimentos UV-Vis de temperatura variável em um espectotômetro equipado com um bloco de temperatura programável.
    3. Colete pontos de dados para as curvas de fusão sobre uma faixa de temperatura de 15\u201290 °C para ciclos de resfriamento (ressarcimento) e aquecimento (derretimento) a uma taxa de 0,5\u20121 °C/min. Mantenha as amostras por 10 minutos a 90 °C antes de esfriar e a 15 °C antes de aquecer. Determine a temperatura de fusão (Tm) do pico do primeiro derivado da curva de aquecimento.
    4. Verifique se as faixas de temperatura de fusão para subconjuntos de 2 oligômeros estão acima de 35 °C em todos os casos de solvente. Além disso, verifique se os subconjuntos correspondentes de 3 oligômeros que contêm uma vertente adicional ao seu subconjunto equivalente de 2 oligômeros mostra um aumento considerável no Tm devido ao aumento da cooperaperatividade.
      NOTA: Isso verificaria se um único pote de auto-montagem de vários oligômeros pode dobrar cooperativamente na nanoestrutura desejada com estabilidade térmica razoável.

4. Protocolo de automontagem para múltiplos oligômeros γPNA distintos

NOTA: Para elaborar um protocolo de rampa térmica de auto-montagem para nanoestruturas γPNA, é desejável a ressarcimento em rampa lenta.

  1. No caso das sequências de oligômeros geradas, as amostras são de 22,5 h em um cicloviário térmico de 90 a 20 °C. Normalmente, a temperatura de fusão obtida para subconjuntos γPNA de 2-oligômeros e 3-oligomer situa-se em faixas de 40\u201270 °C para diferentes condições de solvente.
  2. Programe o cicloviário térmico da seguinte forma: mantenha a 90 °C por 5 min, rampa para baixo de 90 a 70 °C a uma taxa constante de 0,1 °C/min, rampa para baixo de 70 a 40 °C a uma taxa de 0,1 °C/3 min, rampa para baixo de 40 a 20 °C a uma taxa de 0,1 °C/min e manter a 4 °C (ver Tabela 3). As amostras podem ser armazenadas em 4 °C por 12\u201224 h antes da caracterização.
    NOTA: Enquanto subconjuntos de 2 e 3- oligômeros do nosso sistema de nanofibra podem se formar em 1x PBS, as nanofibras em escala de micron completa agregam em 1x PBS. Portanto, as condições de solvente devem ser otimizadas com base na escala e tamanho da estrutura que está sendo formada, bem como no tipo e densidade das modificações gama.
  3. Para micron escala longa 3-hélices nanofibras, prepare amostras de lote anneal em 75% DMSO: H2O (v/v), 75% DMF: H2O (v/v), 40% 1,4-Dioxane: H2O (v/v) com base em estudos de otimização de solventes15.
  4. Prepare os lotes anneal da seguinte forma (ver Tabela 4). Primeiro, prepare 10 sub-estoques de μL em concentrações de 20 μM dos estoques principais de 300 μM para cada oligômero, aliquoting 0,67 μL do estoque principal e fazendo o volume para 10 μl usando água desionizada.
  5. Alíquota 1 μL dos subestos de 20 μM para cada oligômero e adicione-a a um tubo PCR de 200 μL. Isso representa um volume total de 9 μL para 9 oligômeros.
  6. Adicione 30 μL de DMSO/DMF anidro para os casos DMSO de 75% e 75% DMF com um adicional de 1 μL de água desionizada para fazer um volume final de 40 μL com cada oligômero a 500 nM concentrações finais. Adicione 16 μL de 1,4-Dioxano e faça o volume com água deionizada a 40 μL para a condição de solvente de dioxano de 40%.
  7. Carregue os lotes anneal no ciclo de tempo térmico e ressar o protocolo mencionado na etapa 4.2.

5. Imagem total de ressonância magnética de reflexão interna (TIRF)

  1. Prepare uma câmara de umidade a partir de uma caixa de pontas de pipeta vazia. Encha a caixa com aproximadamente 5 mL de água para evitar a secagem dos canais de fluxo amostral descritos da seguinte forma (ver Figura 3).
  2. Prepare a câmara de fluxo com um slide de microscópio, 2 tiras de fita de duas faces e tampas revestidas de nitrocelulose. Para revestir o talo com nitrocelulose, mergulhe a mancha em um béquer contendo 0,1% de colodion em acetato de amilo e ar-seco.
    1. Prepare a solução de nitrocelulose fazendo uma diluição de 20 vezes disponível comercialmente em acetato de amilo com solvente de acetato isoamyl.
  3. Prepare a solução biotinylated de soro bovino (Biotin-BSA) pesando 1 mg de Biotin-BSA e dissolvendo-a em 1 mL de 1x PBS. Flua 15 μL de 1 mg/mL Biotin-BSA em 1x de buffer PBS colocando o canal de fluxo em um ângulo. Incubar o canal de fluxo por 2-4 min em temperatura ambiente em uma câmara umidificada.
  4. Prepare o tampão de lavagem dissolvendo 1 mg de BSA em 1 mL de 1x PBS. Lave o excesso de Biotin-BSA fluindo 15 μL do tampão de lavagem. Para passar pela superfície, incubar o canal de fluxo por 2-4 minutos à temperatura ambiente em uma câmara umidificada.
  5. Prepare a solução streptavidin medindo 0,5 mg de streptavidina e 1 mg de BSA e, em seguida, dissolvendo usando 1 mL de 1x PBS. Fluxo 15 μL de 0,5 mg/mL streptavidin em 1x PBS contendo 1 mg/mL BSA. Incubar o canal de fluxo por 2-4 min em temperatura ambiente em uma câmara umidificada. Flua 15 μL do tampão de lavagem para lavar Streptavidin sem saída.
  6. Fluxo 15 μL de lote anteriormente enaltado de oligômeros γPNA a 500 nM de concentração por fio em 75% DMSO, 75% DMF ou 40% 1,4-Dioxano condição. Incubar o canal de fluxo por 2-4 minutos à temperatura ambiente em uma câmara umidificada.
  7. Prepare 1 mM Trolox em condições de solvente preferencial, diluindo 10 vezes de um estoque de 10 mM de Trolox em DMSO (medir 2,5 mg de Trolox e dissolver em 1 mL de DMSO). Lave as nanoestruturas desvinculadas no canal de fluxo com 15 μL de trolox de 1 mM com a mesma composição de solventes das nanoestruturas.
    NOTA: O teor de >50% DMSO no canal de fluxo produziria pequenos distúrbios de sinal devido ao diferente índice de refração da condição de solvente durante a TIRF, que é tipicamente calibrado para ângulos de TIRF de água coberta. Isso pode ser corrigido lavando com trolox de 1 mM feito diluindo o Trolox 10 vezes de 10 vezes usando água desionizada. Esta técnica fornece imagens mais claras, mas só é útil para avaliar se a formação ocorreu, no entanto, porque produz micro-bolhas de duas fases no canal de fluxo. Como resultado, as nanoestruturas podem ser visíveis na interface das duas fases, como mostrado na Figura 4D.
  8. Transfira o canal de fluxo para o suporte de slides e imagem usando um microscópio de fluorescência equipado com imagem TIRF usando um objetivo de imersão em óleo de 60x e uma lupa de 1,5x. Escaneie o canal de fluxo em ampliação de 60x ou 90x monitorando o canal Cy3 (ver Figura 4).

6. Imagem de microscopia eletrônica de transmissão (TEM)

  1. Pese 0,5 g de acetato de urânyl em 50 mL de água destilada para preparar uma solução de mancha de acetato de urândalo 1%. Filtre a solução de mancha de acetato de urânyl de 1% aquosa usando um filtro de 0,2 μm ligado a uma seringa.
    NOTA: Alternativamente, 2% de acetato aquoso de urano poderia ser comprado de um fabricante comercial.
  2. Compre grades de cobre revestidas de camada de suporte de formvar disponíveis comercialmente com tamanho de 300 malhas.
    NOTA: É importante notar que a camada de suporte formvar pode ser dissolvida por solventes como o DMSO além de 2 minutos. Para maior incubação amostral, formvar comercialmente disponível estabilizado com monóxido de silício em redes de cobre estão disponíveis que permitem que a rede seja mais hidrofílica do que as grades revestidas de carbono e pode suportar condições vigorosas de amostra e feixe de elétrons, como mostrado na Figura 5C.
  3. Pipeta 4 μL de amostra na grade para 15 s. Use um pedaço de papel filtro para retirar a amostra, trazendo o papel filtro em contato com a grade lateral.
  4. Adicione imediatamente 4 μL da solução de manchas na rede para 5 s.
  5. Descarve a mancha como antes e segure o papel do filtro contra a grade por 1\u20122 min para ter certeza de que a grade está seca. As amostras devem ser tipicamente imagens dentro de 1\u20122 h após a coloração. Alternativamente, se a rede estiver completamente seca, as grades podem ser armazenadas em uma caixa de armazenamento de grade TEM por até 3 dias antes da imagem.
  6. Transfira a grade para um suporte de espécime TEM e imagem usando um microscópio eletrônico de transmissão operado a 80 kV com ampliação variando de 10 K a 150K (ver Figura 5).

7. Diferentes morfologias para híbridos γPNA-DNA baseados na substituição seletiva com DNA

  1. Obtenha oligômeros de DNA de sequências especificadas (ver Tabela 5) de fabricantes comerciais de oligonucleotídeos sintetizados em escala de 25 nmol usando desalização padrão. Resuspenque essas sequências de DNA usando água deionizada livre de RNase a concentrações de estoque de 20 μM.
  2. Para substituições contíguas de fios γPNA com DNA, as sequências D3, D5 e D9 podem substituir os fios p3, p5 e p9. Da mesma forma, para substituições de fios crossover γPNA com DNA, as sequências D1, D4 e D7 podem substituir os fios p1, p4 e p7.
  3. Aliquot 1 μL dos sub-estoques de 20 μM para cada γPNA ou oligômero de DNA e adicioná-lo a um tubo PCR de 200 μL como na etapa 2.7. Adicione 30 μL de DMSO anidro e 1 μL de água deionizada sem RNase para fazer o volume final a 40 μL (ver Tabela 6).
  4. Carregue os lotes anneal no ciclo de tempo térmico e ressar o protocolo mencionado na etapa 4.2.
  5. Caracterize nanoestruturas híbridas γPNA-DNA usando o protocolo TIRF seguindo etapas na seção 5 ou usando o protocolo de imagem TEM mencionado na seção 6 (ver Figura 6).

8. Diferentes morfologias para nanofibras γPNA em concentrações variadas de SDS

  1. Prepare um estoque principal SDS de 20% (wt/v) medindo 20 mg de SDS e dissolvendo-o em 100 μL de água deionizada.
  2. Prepare um sub-estoque SDS de 6% (wt/v) aliquoting 3 μL do estoque SDS de 20% e fazendo o volume para 10 μL usando água deionizada.
  3. Anneal os oligômeros γPNA em concentrações finais de 5,25 mM e 17,5 mM SDS da seguinte forma. Aliquot 1 μL dos sub-estoques de 20 μM para cada oligômero γPNA e adicione-o a um tubo PCR de 200 μL como na etapa 2.7. Adicione 30 μL de DMSO anidro e 1 μL de 6% e 20% SDS para fazer o volume final a 40 μL para alcançar concentrações finais de SDS de 5,25 mM e 17,5 mM, respectivamente (ver Tabela 7).
  4. Carregue os lotes anneal de diferentes concentrações de SDS no ciclocicr térmico e anneal usando o protocolo mencionado na etapa 4.2.
  5. Caracterize nanoestruturas γPNA na presença de SDS utilizando o protocolo TIRF seguindo etapas na seção 5 ou usando o protocolo de imagem TEM mencionado na seção 6 (ver Figura 7).

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Resultados

Os protocolos discutidos nas seções acima descrevem o desenho de um motivo SST adaptado de nanofibras de DNA para a geração robusta de estruturas de nanofibras auto-montadas usando múltiplos oligômeros γPNA. Esta seção descreve a interpretação dos dados obtidos a partir da recriação bem sucedida dos protocolos descritos.

Seguindo o protocolo descrito na seção 5 para imagem TIRF de amostras de oligômeros γPNA annealed em 75% DMSO: H2O (v/v) mais facilmente fornece ev...

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Discussão

Este artigo se concentra na adaptação e melhoria dos protocolos de nanotecnologia de ácido nucleico existentes para misturas orgânicas de solventes. Os métodos descritos aqui se concentram em modificações e solução de problemas dentro de um espaço experimental definido de solventes orgânicos apóticos polares selecionados. Ainda há potencial inexplorado para que outros protocolos de nanotecnologia de ácido nucleico estabelecidos sejam adaptados dentro deste espaço. Isso poderia melhorar aplicações potenci...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado em parte pela Fundação Nacional de Ciência 1739308, bolsa NSF CAREER 1944130 e pelo Escritório da Força Aérea de Pesquisa científica número FA9550-18-1-0199. As sequências γPNA foram um presente generoso do Dr. Tumul Srivastava da Trucode Gene Repair, Inc. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Erik Winfree e ao Dr. Rizal Hariadi por suas conversas úteis sobre o código MATLAB da Caixa de Ferramentas de DESIGN de DNA. Gostaríamos também de agradecer a Joseph Suhan, Mara Sullivan e ao Centro de Imagem Biológica por sua assistência na coleta de dados TEM.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
γPNA strands/oligomersTrucode Gene Repair Inc.Section 2.1
UV-Vis SpectrophotometerAgilentVarian Cary 300Section 3.1.2
Quartz cuvettesStarna29-Q-10Section 3.1.1
Thermal cyclerBio RadC1000 touchSection 4.1
0.2 mL PCR tubesVWR53509-304Section 4.5
Anhydrous DMFVWREM-DX1727-6Section 4.6
Anhydrous DMSOVWREM-MX1457-6Section 4.6
Anhydrous 1,4-DioxaneFisher ScientificAC615121000Section 4.6
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)VWR75800-994Section 3.1.1
Microscope slidesVWR89085-399Section 5.2
Glass cover slipsVWR48382-126Section 5.2
2% Collodion in Amyl AcetateSigma-Aldrich9817Section 5.2
Isoamyl AcetateVWR200001-180Section 5.2
Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA)Sigma-AldrichA8549Section 5.3
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153Section 5.4
StreptavidinSigma-Aldrich189730Section 5.5
TroloxSigma-Aldrich238813Section 5.7
Total Internal Reflection Fluorescence microscopeNikonNikon Ti2-ESection 5.8
Transmission Electron MicroscopeJoelJEM 1011Section 6.6
TweezersDumont0203-N5AC-POSection 6.3
Uranyl AcetateElectron Microscopy Sciences22400Section 6.1
Formvar, 300 mesh, Copper gridsTed Pella Inc.1701-FSection 6.2
Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper gridsTed Pella Inc.1829Section 6.2
DNA oligomers/strandsIDTSection 7.1
Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)VWR97064-860Section 8.1

Referências

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