Um modelo pré-clínico de impacto cortical controlado para hemorragia traumática, contusão e neuroinflamação

Resumo

Hemorragia intraparenquimatosa e neuroinflamação acompanhadas de contusão cerebral podem desencadear lesão cerebral secundária grave. Este protocolo detalha um modelo de impacto cortical controlado por camundongos (CCI), permitindo que os pesquisadores estudem a contusão por hemorragia e respostas imunes pós-traumáticas e explorem possíveis terapêuticas.

Resumo

A contusão cerebral é um problema médico grave que afeta milhões de pessoas em todo o mundo a cada ano. Há uma necessidade urgente de entender o mecanismo fisiopatológico e desenvolver uma estratégia terapêutica eficaz para esse distúrbio neurológico devastador. A hemorragia intraparenquimatosa e a resposta inflamatória pós-traumática induzida pelo impacto físico inicial podem agravar a ativação da microglia/macrófago e a neuroinflamação que subsequentemente pioram a patologia cerebral. Fornecemos aqui um protocolo de impacto cortical controlado (CCI) que pode reproduzir a contusão cortical experimental em camundongos usando um sistema de impactor pneumático para fornecer força mecânica com magnitude e velocidade controláveis na superfície dural. Este modelo pré-clínico permite que os pesquisadores induzam contusão cerebral focal moderadamente grave em camundongos e investiguem uma ampla gama de progressões patológicas pós-traumáticas, incluindo contusão hemorrágica, ativação de micróglia/macrófagos, toxicidade de ferro, lesão axonal, bem como déficits neurocomportamentais de curto e longo prazo. O presente protocolo pode ser útil para explorar os efeitos a longo prazo e as possíveis intervenções para a contusão cerebral.

Introdução

A contusão cerebral é uma forma de lesão cerebral traumática que está entre os problemas de saúde mais mortais da sociedade moderna¹. É causada principalmente por eventos acidentais, como acidentes de trânsito, que resultam em forças externas que aplicam energia mecânica na cabeça. O traumatismo cranioencefálico afeta aproximadamente 3,5 milhões de pessoas e é responsável por 30% de todas as mortes relacionadas a lesões agudas nos EUA a cada ano². Os pacientes que sobrevivem à contusão cerebral muitas vezes sofrem consequências de longo prazo, incluindo fraqueza motora focal, disfunção sensorial e doença mental¹.

A lesão primária da contusão cerebral é induzida por fatores mecânicos, incluindo forças de estiramento e ruptura, levando à deformação imediata da estrutura parenquimatosa e morte celular focal do SNC³. Contusão hemorrágica é um termo geral para hemorragias cerebrais devido a ruptura vascular no local do traumatismo craniano⁴. Especificamente, a hemorragia intraparenquimatosa ocorre imediatamente após uma contusão cerebral que leva à formação tardia de hematoma. Dentro do hematoma, a hemoglobina e o ferro livre liberados dos glóbulos vermelhos lisados podem desencadear ainda mais toxicidade relacionada ao sangue ^5,6, que causa hérnia, edema cerebral e elevação da pressão intracraniana ^5,6. As funções colaborativas dos neurônios (axônios), glia, vasos sanguíneos e tecido de suporte também são comprometidas pelo efeito de massa do hematoma⁷. Além disso, a neuroinflamação persistente e difusa com neurodegeneração progressiva continua por meses e causa danos secundários no cérebro⁸.

A ativação da microglia é uma das muitas características patológicas importantes da contusão cerebral ^9,10. Depois de detectar os padrões moleculares associados a danos (DAMPs) e o sangue vazado no tecido lesionado, a microglia ativada desencadeia neuroinflamação que promove danos cerebrais secundários¹¹. Além disso, o quimioatraente liberado pela microglia promove a infiltração de células imunes periféricas no território traumático, resultando na produção de espécies reativas de oxigênio e citocinas pró-inflamatórias. Isso cria um ambiente pró-inflamatório autoperpetuante que desencadeia lesão cerebral progressiva ^9,12. Enquanto isso, a microglia com um fenótipo ativado alternativamente pode contribuir para a restauração homeostática do tecido e reparo cerebral através da limpeza de detritos do tecido lesionado¹³. A prevenção da neuroinflamação secundária por meio da redução das respostas imunes microgliais prejudiciais demonstrou ser particularmente útil para promover a recuperação cerebral da contusão cerebral 3,9,10,12.

Vários modelos pré-clínicos foram desenvolvidos para estudar lesão cerebral traumática, incluindo modelo de queda de peso, lesão por percussão de fluido lateral e modelo de onda de choque^14,15. No entanto, cada um desses modelos tem sua fraqueza, incluindo alta taxa de mortalidade durante o procedimento, baixa reprodutibilidade dos resultados histológicos e alta variabilidade da lesão infligida entre os laboratórios ^16,17. Em comparação, o modelo de impacto cortical controlado (ICC) é mais adequado para o estudo da contusão cerebral focal devido ao seu controle preciso e alta reprodutibilidade 14,15,18,19.

Além disso, por meio da manipulação dos parâmetros de deformação biomecânica, como velocidade e profundidade do impacto, a gravidade do dano induzido pode ser controlada para produzir uma ampla gama de magnitudes de lesão, permitindo que os pesquisadores mimetizem diferentes níveis de comprometimento frequentemente observados em pacientes¹⁷. O modelo pré-clínico da ICC foi desenvolvido pela primeira vez em 1896²⁰. Desde então, o CCI tem sido o modelo aplicável mais amplo a ser modificado para uso em primatas²¹, suínos²², ovinos²³, ratos²⁴ e camundongos²⁵. Juntas, essas características fazem do ICC um dos modelos experimentais de contusão cerebral mais^adequados26.

Nosso laboratório usa um sistema de impacto CCI pneumático disponível comercialmente e parâmetros de deformação biomecânica testados para produzir contusão cerebral focal moderadamente grave que territorializa as áreas corticais sensoriais e motoras primárias sem danificar o hipocampo^27,28. Nós e outros demonstramos que este procedimento de ICC pode ser usado para estudar características clínicas de contusão cerebral humana, incluindo perda de tecido cerebral, lesão neuronal, hemorragia intraparenquimatosa, neuroinflamação e deficiência sensório-motora 24,25,27,28,29,30 . Aqui, detalhamos um protocolo padrão para realizar CCI em camundongos que permite fazer perguntas sobre perda de mielina induzida por CCI, deposição de ferro, inflamação do SNC, toxicidade hemorrágica e as respostas de microglia / macrófagos após contusão cerebral focal.

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Protocolo

Todos os procedimentos descritos neste protocolo foram conduzidos sob a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Geral Cheng Hsin e da Faculdade de Medicina da Universidade Nacional de Taiwan. Camundongos C57BL/6 machos do tipo selvagem de oito a dez semanas de idade foram usados neste protocolo.

1. Indução anestésica

1. Anestesiar o camundongo com ~4% de isoflurano misturado com ar ambiente a ~0,2 L/min em uma câmara de indução conectada ao vaporizador de isoflurano.
2. Certifique-se de que o padrão respiratório seja suave. Verifique a profundidade da anestesia confirmando a falta de reflexo de pinça no animal.

2. Preparação pré-cirúrgica

1. Raspe a cabeça do mouse com um cortador elétrico na direção caudal a rostral. Não apare os bigodes do mouse.
   NOTA: A perda de bigodes pode influenciar a precisão dos resultados dos testes comportamentais subsequentes.
2. Coloque o mouse no quadro estereotáxico. Insira cuidadosamente as barras auriculares nos canais auditivos. Certifique-se de que a cabeça do mouse esteja estabilizada por ambas as barras auriculares igualmente.
3. Traga o cone do nariz e mantenha a anestesia a 1% - 2% de isoflurano durante a cirurgia.
4. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento durante a cirurgia. Mantenha o animal em uma almofada de aquecimento para manter uma temperatura corporal de 37 °C.
5. Desinfete a cabeça raspada com betadine seguido de álcool 70% usando cotonetes estéreis. Repita três vezes.

3. Cirurgia CCI

1. Administrar 100 μL de Bupivacaína (0,25%) por via subcutânea com agulha de insulina 31 G antes da incisão. Massageie suavemente o local da injeção para melhor absorção.
   NOTA: Este anestésico local proporciona alívio da dor diretamente no local da cirurgia.
2. Faça uma incisão longitudinal (~ 1,5 cm) ao longo da linha média do couro cabeludo com um bisturi ou tesoura. Use um hemostático para segurar a pele do lado direito e deixe o crânio exposto secar por 1 min. Use um cotonete estéril para limpar qualquer resíduo de sangue e tecidos no crânio.
3. Verifique se a cabeça do mouse está nivelada no plano horizontal.
   1. Identifique os pontos de referência anatômicos Bregma e Lambda e marque ambos os locais com um marcador/lápis cirúrgico estéril.
   2. Certifique-se de que a cabeça do animal esteja nivelada na direção rostral-caudal. Faça isso medindo as coordenadas Z de Bregma e Lambda usando uma agulha de insulina de 31 G presa ao quadro estereotáxico.
      NOTA: Ajuste a barra auricular verticalmente, se necessário.
   3. Execute o posicionamento horizontal da cabeça do animal seguindo o mesmo procedimento de verificação das coordenadas Z na linha média junto com dois locais correspondentes no lado esquerdo e direito da linha média e ajuste as barras auriculares, se necessário.
      NOTA: Um posicionamento nivelado e estável da cabeça do animal é crucial para a reprodutibilidade e confiabilidade do modelo CCI.
4. Use a mesma agulha de insulina 31 G para identificar o local da craniectomia. Defina a origem XY para Bregma e mova lateralmente a agulha 3 mm para a direita. Marque esta posição como o local da craniectomia e desenhe um círculo de 4 mm de diâmetro no crânio com um marcador/lápis cirúrgico estéril.
5. Use uma micro broca de alta velocidade com uma trefina (4 mm de diâmetro) para cortar ao longo do círculo contornado a lápis para criar um orifício aberto de 4 mm de diâmetro. Use uma configuração de velocidade de 20.000 rpm. Evite aplicar pressão excessiva.
   NOTA: Execute esta etapa rapidamente (geralmente dentro de 30 s a 1 min) para evitar qualquer dano térmico ao cérebro. A aplicação de pressão excessiva durante a perfuração pode levar à penetração acidental que pode comprimir e ferir a superfície do cérebro.
6. Remova cuidadosamente o retalho ósseo com uma pinça e guarde-o temporariamente em solução salina normal gelada. Enxágue suavemente o orifício com solução salina normal antes de aplicar pressão na superfície do cérebro com a ponta do cotonete para parar o sangramento.
7. Ajuste a ponta arredondada do pêndulo de 2,5 mm de diâmetro no dispositivo CCI para um ângulo de 22,5°. Zere a ponta de impacto na superfície dural. Defina os parâmetros de impacto na caixa de controle para uma velocidade de 4 m/s e uma profundidade de deformação de 2 mm. Retraia a ponta de metal.
   NOTA: Zerar a ponta enquanto ela é estática e levemente pressionada contra a superfície dural na posição de curso completo melhora a precisão do ponto zero e a reprodutibilidade do nível de lesão.
8. Descarregue o pistão para gerar impactação no cérebro. Coloque um cotonete estéril na área lesionada para parar o sangramento.
9. Coloque a aba óssea de volta no cérebro do camundongo e prenda com cimento dental. Feche o couro cabeludo com adesivo tecidual (por exemplo, 3M Vetbond).

4. Recuperação pós-operatória

1. Coloque o mouse em uma gaiola de recuperação limpa com roupa de cama sob a lâmpada de calor até a recuperação total.
2. Forneça ração umedecida e administre cetoprofeno (5 mg / kg) por via subcutânea por dois dias consecutivos após a cirurgia.
3. Execute os procedimentos acima, exceto as etapas 3.7 e 3.8 para animais de controle simulados.

5. Eutanásia de camundongos

1. Eutanásia de camundongos no dia do estudo por overdose de isoflurano e depois decapitação.
   NOTA: Várias estratégias podem ser usadas para sacrificar os animais experimentais antes da coleta da amostra.
2. Colete amostras de cérebro para análise histológica.

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Resultados

Ilustração da colocação estereotáxica e do procedimento de craniotomia.

O modelo CCI é conhecido por sua estabilidade e reprodutibilidade na produção de lesões que variam de leves a graves¹⁸. A técnica estereotáxica adequada e o procedimento de craniotomia são os principais determinantes na produção de lesão cerebral induzida por CCI estável e reprodutível (Figura 1A,

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Discussão

O protocolo CCI produz lesões mecânicas altamente reprodutíveis no cérebro para pesquisa de contusão cerebral. As etapas a seguir são cruciais para gerar lesões cerebrais consistentes em animais usando este protocolo CCI.

Primeiro, a cabeça do mouse deve ser montada de forma estável na estrutura estereotáxica e os marcos anatômicos Bregma e Lambda sempre no mesmo plano horizontal. A colocação instável ou desnivelada da cabeça muitas vezes result...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4mm Short Trephine Drill	Salvin Dental Specialties, Inc.	TREPH-SHORT-4
anti-Iba1 antibody	Wako chemicals	#019-19741
anti-Ly76 antibody	abcam	ab91113
carboxylate cement	3M	70201136010
cortical contusion injury impactor	Custom Design & Fabrication, Inc.	S/N 49-2004-C, eCCI Model 6.3	CCI device (S/N 49-2004-C, eCCI Model 6.3)
cresyl violet acetate	Sigma-Aldrich	C5042
DAB staining kit	Vector	SK-4105
goat anti-rabbit IgG secondary antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11034
goat anti-rat IgG secondary antibody, Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11007
Mayer's Hematoxylin	ScyTek	HMM500
tweezers	fine science tools	11252-20 NO. 5
isoflurane	Panion & BF Biotech Inc.
Bupivacaine 0.25%	Hospira
lithium carbonate	Sigma-Aldrich	62470
steriotexic frame	stoelting
scissors	fine science tools	14068-12
solvent blue 38	Sigma-Aldrich	S3382