In Vivo Intracelular Gravação de Motoneurons vertebrais de rato identificados tipo durante estimulação de corrente direta trans-espinhal

Resumo

Este protocolo descreve a gravação intracelular in vivo de motoneurons lombares de rato com estimulação simultânea de corrente trans-espinhal. O método permite medir as propriedades da membrana e registrar disparos rítmicos de motoneurons antes, durante e depois da polarização anodal ou catódal da medula espinhal.

Resumo

O registro intracelular de motoneurons espinhais in vivo fornece um "padrão-ouro" para determinar as características eletrofisiológicas das células na rede espinhal intacta e contém vantagens significativas em relação às técnicas clássicas de gravação in vitro ou extracelular. Uma vantagem das gravações intracelulares in vivo é que esse método pode ser realizado em animais adultos com um sistema nervoso totalmente maduro, e, portanto, muitos mecanismos fisiológicos observados podem ser traduzidos para aplicações práticas. Neste artigo metodológico, descrevemos esse procedimento combinado com a estimulação de corrente constante aplicada externamente, que imita processos de polarização ocorridos dentro das redes neuronais espinhais. A estimulação de corrente direta trans-espinhal (TSDCS) é um método inovador cada vez mais utilizado como intervenção neuromodulatória na reabilitação após várias lesões neurológicas, bem como em esportes. A influência do TSDCS no sistema nervoso permanece mal compreendida e os mecanismos fisiológicos por trás de suas ações são amplamente desconhecidos. A aplicação do tsDCS simultaneamente com gravações intracelulares permite observar diretamente as alterações das propriedades da membrana motoneuron e características do disparo rítmico em resposta à polarização da rede neuronal espinhal, o que é crucial para a compreensão das ações do TSDCS. Além disso, quando o protocolo apresentado inclui a identificação do motoneuron no que diz respeito a um músculo inervado e sua função (flexor versus extensor), bem como o tipo fisiológico (rápido versus lento) proporciona uma oportunidade de investigar seletivamente a influência do TSDCS em componentes identificados de circuitos espinhais, que parecem ser diferentemente afetados pela polarização. O procedimento apresentado foca na preparação cirúrgica para gravações intracelulares e estimulação com ênfase nas etapas necessárias para alcançar a estabilidade da preparação e a reprodutibilidade dos resultados. Os detalhes da metodologia da aplicação anodal ou cathodal tsDCS são discutidos enquanto prestam atenção às questões práticas e de segurança.

Introdução

A estimulação da corrente direta trans-espinhal (tsDCS) está ganhando reconhecimento como um método potente para modificar a excitabilidade do circuito espinhal na saúde e na doença^1,,2,3. Nesta técnica, é passada uma corrente constante entre um eletrodo ativo localizado acima dos segmentos espinhais selecionados, com um eletrodo de referência localizado ventrally ou mais rostrally⁴. Vários estudos já confirmaram que o TSDCS pode ser usado no gerenciamento de certas condições patológicas, como dor neuropática⁵, espasticidade^6,lesão medular⁷ ou para facilitar a reabilitação⁸. Os pesquisadores sugerem que o TSDCS evoca alterações na distribuição de íons entre o espaço intracelular e o espaço extracelular através da membrana celular, e isso pode facilitar ou inibir a atividade neuronal dependendo da orientação atual^9,,10,,11. No entanto, até recentemente, faltava uma confirmação direta dessa influência sobre os motoneurons.

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para realizar o registro intracelular in vivo de potenciais elétricos de motoneurons lombares no rato anesthetizado com aplicação simultânea de TSDCS, a fim de observar alterações na membrana motoneuron e propriedades de disparo em resposta à polarização anodal ou catódal da rede neuronal espinhal. Gravações intracelulares abrem diversas áreas de investigação de propriedades de neurônios, indisponíveis para técnicas extracelulares previamente utilizadas^9,12. Por exemplo, é possível medir com precisão a resposta de tensão da membrana do motoneuron ao fluxo de corrente direta induzido pelo TSDCS, indicar limiar de tensão para geração de picos ou analisar parâmetros potenciais de ação. Além disso, essa técnica nos permite determinar as propriedades da membrana passiva do motoneuron, como a resistência à entrada, e observar a relação entre a corrente de estimulação intracelular e a frequência de disparo rítmico de motoneurons. A identificação antidrómica do motoneuron registrado, com base na estimulação de nervos identificados funcionalmente (ou seja, nervos que fornecem eferentes a flexores ou extensores) permite identificar adicionalmente tipos de unidades motoras inervadas (rápida versus lenta), o que dá a oportunidade de testar se a polarização influencia de forma diferente elementos individuais do sistema neuronal espinhal maduro. Devido à extensa cirurgia que precede o registro e aos altos requisitos de estabilidade e confiabilidade das gravações, essa técnica é altamente desafiadora, mas permite a avaliação direta e a longo prazo das características eletrofisiológicas de um motoneuron: antes, durante e depois da aplicação do TSDCS, que é crucial para determinar tanto suas ações agudas quanto os efeitos persistentes¹³. Como um motoneuron ativa diretamente as fibras musculares extrafusais¹⁴ e participa do controle de feedback de uma contração muscular e desenvolveu força^15,16 qualquer influência observada de tsDCS na unidade motora ou propriedades contratuais musculares pode estar ligada a modulações de excitabilidade do motoneuron ou características de disparo.

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Protocolo

Todos os procedimentos ligados a este protocolo foram aceitos pelas autoridades competentes (por exemplo, Comitê de Ética Local) e seguem as regras nacionais e internacionais sobre bem-estar e gestão animal.

NOTA: Cada participante envolvido no procedimento deve ser devidamente treinado em procedimentos cirúrgicos básicos e tem que ter uma licença válida para a realização de experimentos em animais.

1. Anestesia e premeditação

1. Anestesiar um rato com injeções intraperitoneais de pentobarbital de sódio (uma dose inicial de 60 mg·kg^-1 para ratos Wistar machos de 6 meses de idade pesando 400\u2012550g).
   NOTA: Este protocolo não se limita à tensão indicada, sexo ou idade dos ratos. Além disso, anestesia alternativa como mistura cetamina-xilazina, alfa-clorona ou fentanil+midazolam+medetomidina pode ser usada se mais adequada para diferentes objetivos de pesquisa ou quando exigida pelo comitê de ética.
2. Após aproximadamente 5 minutos, verifique a profundidade da anestesia beliscando o dedo do membro traseiro do rato com fórceps contundentes. Proceda com os próximos passos do protocolo somente quando nenhuma ação reflexa for observada.
3. Injete 0,05 mL de atropina subcutânea para reduzir a produção de muco após a intubação.
4. Injete subcutâneamente 5 mL de tampão fosfato contendo 4% de solução de glicose, NaHCO₃ (1 %) e gelatina (14%). Este buffer será absorvido pelos vasos cutâneos durante um experimento e ajudará a manter o equilíbrio dos fluidos.
5. Durante toda a cirurgia, verifique periodicamente o animal quanto às ações reflexas e suplementa se necessário (10 mg·kg^-1·h^-1de pentobarbital de sódio).

2. Cirurgia

1. Prepare o animal para tratamento cirúrgico, raspando pele sobre a parte dorsal da linha traseira esquerda, do tornozelo ao quadril, da parte traseira, da cauda aos segmentos torácticos elevados, do lado esquerdo do peito e do lado ventral da área do pescoço acima do esterno
2. Colocação da linha intravenosa
   1. Coloque o rato de costas em uma almofada de aquecimento de laço fechado (e fixe-o com fixações de membros).
   2. Usando uma lâmina 21, faça um corte longitudinal através da pele de um esterno para um queixo.
   3. Segure a pele com fórceps e separe-a do tecido subjacente.
   4. O uso de técnicas de dissecção contundente expõe a veia jugular direita. Dissecar cuidadosamente a veia dos tecidos circundantes.
   5. Localize a parte da veia sem pontos de ramificação, deslize duas ligaduras 4-0 abaixo dela.
   6. Faça um nó solto na extremidade proximal do segmento não ramificado anteriormente identificado da veia e um nó solto na extremidade distal deste segmento da veia. Fixar a veia proximal ao coração, e então ligar a parte distal da veia.
   7. Usando uma tesoura de íris, faça uma incisão entre o grampo e a ligadura distante. Segure uma aba da veia e introduza um cateter pré-preenchido ao ponto em que é bloqueado pelo grampo.
   8. Enquanto segura a veia e o cateter junto com fórceps, remova o grampo e empurre o cateter vários milímetros para dentro da veia. Fixar as duas extremidades do cateter na veia e adicionar um ponto de fixação adicional à pele.
3. Introdução do tubo traqueal
   1. O uso de fórceps contundentes separa as duas glândulas mandibulares que cobrem os músculos esternohióides. Separe os músculos esternonióides na linha média para expor a traqueia.
   2. Deslize três ligaduras 4-0 abaixo da traqueia, em seguida, faça dois nós abaixo do ponto de inserção do tubo traqueal e um nó acima.
   3. Localize a cartilagem cricoide da laringe e faça uma incisão abaixo da terceira cartilagem traqueal.
   4. Insira um tubo traqueal pela traqueia e fixe o tubo no lugar com ligaduras pré-preparadas e adicione uma ligadura adicional à pele.
   5. Coloque um pequeno pedaço de lã de algodão acima dos músculos separados, e sutura a pele sobre a área operada.
4. Dissecção dos nervos do membro traseiro
   1. Usando 21 lâminas, faça um corte longitudinal no lado posterior do membro traseiro esquerdo, do tendão de Aquiles até o quadril.
   2. Pegue a pele com fórceps, e usando técnicas de dissecção sem cortes separam a pele dos músculos subjacentes em ambos os lados da incisão.
   3. Localize a fossa popliteal na parte de trás da articulação do joelho, que é coberta pelo músculo bíceps femoral, e usando uma tesoura faça um corte entre a parte anterior e posterior deste músculo.
   4. Movendo-se para cima cortou duas cabeças do bíceps femoral todo o caminho até o quadril para expor o nervo ciático. Cauterize conforme necessário para evitar sangramento.
   5. Identifique os ramos surais, tibiais e peroneais comuns do nervo ciático.
   6. Usando uma tesoura, separe a lateral da cabeça medial do músculo gastrocnemius para expor o nervo tibial e seus ramos.
   7. Usando 55 fórceps pegue a extremidade distal do nervo sural, corte-a distally e disseca o mais longe possível.
   8. Repita o procedimento com o nervo peroneal comum.
   9. Usando uma haste de vidro sem corte, separe o nervo tibial dos tecidos circundantes, tomando cuidado para não danificar os vasos sanguíneos, e cortá-lo distally.
   10. Identifique os nervos gastrocnemius medial (MG) e os nervos gastrocnemius lateral e soleus (LGS).
   11. Utilizando 55 fórceps, disseco cuidadosamente os nervos MG e LGS, desconectando-os dos tecidos circundantes, mas mantendo sua conexão com os respectivos músculos.
   12. Coloque um pedaço de algodão encharcado de soro sob os nervos expostos.
   13. Feche a pele sobre a área operada.
5. Laminectomia
   1. Usando 21 lâminas faça uma incisão longitudinal do sacro até as vértebras torácicas.
   2. Separe a pele dos músculos subjacentes.
   3. Corte o músculo longissimus em ambos os lados dos processos torácicos e lombares.
   4. O uso de bisturi de bordas cegas retrai os músculos da coluna vertebral para expor os processos transversais de cada vértebra.
   5. O uso de uma tesoura de ponta sem corte cortou os tendões dos músculos ligados aos processos transversais ao longo da coluna vertebral exposta. Aplique agentes hemostáticos, se necessário.
   6. Identifique a vértebra Th13 como o segmento torácico mais baixo com inserção da costela e usando rongeurs finos removem processos espinhosos e laminas de vértebras Th13 a L2 para expor segmentos lombares da medula espinhal. Lembre-se de não danificar o processo spinous L3 que será usado como ponto de fixação para estabilização da coluna vertebral.
   7. Remova o processo espinhoso th12 e suavize a superfície dorsal da vértebra o máximo possível.
   8. O uso de técnicas de dissecção contundente separa os músculos da vértebra Th11 para criar pontos de inserção do suporte.
   9. Coloque lã de algodão salina fina sobre os segmentos da medula espinhal exposta.
   10. Mova o rato para a estrutura metálica feita sob medida com duas barras paralelas e dois braços ajustáveis com grampos para apoiar e estabilizar a coluna vertebral.

3. Preparação para a gravação e estimulação

1. Fixação da coluna vertebral e arranjo nervoso
   1. Coloque o rato na estrutura personalizada em uma almofada de aquecimento, conectada ao sistema de aquecimento de laço fechado para manter a temperatura do corpo animal a 37 ± 1°C.
   2. Insira eletrodos ECG sob a pele e conecte-se a um amplificador para monitoramento da frequência cardíaca.
   3. Usando os retalhos da pele, forme uma piscina profunda sobre a medula espinhal exposta.
   4. Utilizando grampos metálicos, fixar a coluna vertebral colocando grampos abaixo de processos transversais th12 e em processo spinous L3.
   5. Certifique-se de que a coluna vertebral está fixa e organizada horizontalmente e, em seguida, aplique pressão dorso-ventral em ambos os lados da coluna para retrair os músculos.
   6. Encha a piscina com óleo mineral quente (37 °C) e mantenha-a nesta temperatura.
   7. Enfie uma ligadura de 4-0 através do tendão de Aquiles, levante e estique o membro traseiro esquerdo operado para que o tornozelo seja nivelado com o quadril.
   8. Usando os retalhos da pele fazem uma piscina profunda sobre os nervos tibial expostos, MG e LGS.
   9. Encha a piscina com óleo mineral quente (37 °C).
   10. Coloque os nervos MG e LGS em eletrodos estimulantes de fio prateado bipolar e conecte-os a um estimulador de pulso quadrado. Use canais de estimulação separados para cada nervo.
2. Colocação de eletrodos de superfície
   1. Coloque um eletrodo de bola de prata no lado esquerdo caudal da medula espinhal exposta, com um eletrodo de referência inserido nos músculos das costas, e conecte ambos os eletrodos ao amplificador DC diferencial. O eletrodo de bola de superfície será usado para gravar voleios diferentes dos nervos.
   2. Utilizando um estimulador de corrente constante, estimule os nervos MG e LGS com pulsos quadrados de duração de 0,1 ms, repetidos em uma frequência de 3 Hz, e observe voleios diferentes.
   3. Determine o limiar (T) para ativação nervosa, estimule cada nervo a aproximadamente 3· Intensidade T, e amplitude recorde de voleio diferente para cada nervo.
   4. Mova o rostral de eletrodo superficial e repita o procedimento para identificar segmentos espinhais em que amplitudes das voleios são as mais altas para cada nervo. Depois de determinar a localização máxima do voleio, mova o eletrodo da superfície para uma distância segura da medula espinhal.
3. Paralisia muscular e formação de pneumotórax para reduzir os movimentos respiratórios
   1. Paralise o rato por via intravenosa com um bloqueador neuromuscular e conecte o tubo traqueal a um ventilador externo em linha com um capnômetro compatível com roedores (brometo de pancurônio, em uma dose inicial de 0,4 mg·kg^-1, suplementado a cada 30 minutos em doses de 0,2 mg·kg^-1)
   2. Monitore a concentração de CO₂ de maré final e mantenha-a em cerca de 3\u20124% ajustando parâmetros de ventilação (frequência, pressão de ar e volumes de fluxo).
   3. Faça uma incisão longitudinal na pele entre a 5ª e a 6ª costela em um lado da gravação.
   4. Usando uma tesoura de ponta sem corte, corte os músculos sobreladais para visualizar o espaço intercostal entre as costelas.
   5. Usando uma pequena tesoura afiada, faça uma pequena incisão nos músculos intercostais e na pleura, em seguida, insira uma ponta de uma borda cega fórceps na abertura, tomando cuidado para não pressionar os pulmões.
   6. Permita que as fórceps se expandam ou insira um pequeno tubo para manter o pneumotórax aberto durante todo o experimento.
   7. Após o bloqueio neuromuscular, monitore a profundidade da anestesia verificando a frequência do ECG e complemente o agente anestésico se a frequência cardíaca exceder 400 bpm. Paralisia muscular e formação de pneumotórax para reduzir os movimentos respiratórios, o que melhorará a estabilidade do registro
4. Abrindo o dura e pia mater
   1. Usando #55 fórceps, levante suavemente a dura mater, e corte-a caudally do segmento L5, rostrally até o segmento L4.
   2. Usando um par de fórceps 5SF ultrafinos fazem um pequeno patch na pia cobrindo a coluna dorsal, entre os vasos sanguíneos, exatamente ao nível do voleio máximo diferente do MG ou do nervo LGS.
   3. Use pequenos pedaços de espuma de gel salino e seca para bloquear o sangramento, se necessário.
5. colocação de eletrodos tsDCS
   1. Faça uma pequena incisão na pele no lado ventral de um abdômen de rato no nível rostro-caudal correspondente à localização dos segmentos espinhais L4-L5.
   2. Pegue a aba de pele exposta com um clipe de metal que servirá como um eletrodo de referência.
   3. Coloque uma esponja encharcada de soro fisiológico no lado dorsal da vértebra Th12. Certifique-se de que o tamanho da esponja é igual ao de um eletrodo tsDCS ativo (placa de aço inoxidável em forma de círculo de 5 mm de diâmetro).
   4. Usando um manipulador fino, pressione a esponja com um eletrodo tsDCS ativo no osso e certifique-se de que toda a superfície do eletrodo seja pressionada igualmente.
   5. Conecte eletrodos tsDCS de referência e ativos a uma unidade estimuladora de corrente constante, capaz de fornecer um fluxo contínuo de corrente direta.
6. Preparação de micropipettos
   1. Usando um puxador de microeletrodo, prepare uma microeletrídua.
      NOTA: Tanto os eletrodos de filamento quanto os eletrodos não filamentos podem ser usados, no entanto, lembre-se que a haste do eletrodo deve ser longa o suficiente para atingir o chifre ventral enquanto é fina o suficiente para não comprimir a medula espinhal durante a descida.
      1. Ajuste a configuração do puxador para que a haste que entra na medula espinhal tenha aproximadamente 3 mm de comprimento, enquanto a ponta do eletrodo não é superior a 1\u20122 μm de diâmetro e a resistência à microeletrísola está entre 10 e 20 MΩ.
   2. Encha os microeletrodos com eletrólitos de potássio de 2M.
   3. Monte a microeletrínda preparada no micromanipulador permitindo 1\u20122 μm movimento de pisada e calibração estereotaxic.
   4. Conecte o microeletro ao amplificador intracelular com o eletrodo de referência colocado nos músculos das costas.
7. Após o bloqueio neuromuscular, monitore a profundidade da anestesia verificando a frequência do ECG e complemente o agente anestésico para que a frequência cardíaca do rato não exceda 400 bpm.

4. Rastreamento e penetração de motoneuron

1. Coloque o diferente eletrodo de gravação de voleio de volta na superfície dorsal da medula espinhal, caudalmente à localização do local de gravação, ao nível do segmento L6.
2. Estimule os nervos MG e LGS com pulsos elétricos de 0,1 ms em uma frequência de 3 Hz, e intensidade 3T, para ativar todos os axônios de alfa-motoneurons dentro de um nervo selecionado.
3. Dirija a micropipette em um patch selecionado na pia com um ângulo medio-lateral de 15\u201220° (com uma ponta direcionada lateralmente).
4. Depois de descer abaixo da superfície, calibrar a microeletrância e compensar sua capacitância e deslocamento de tensão, e continuar a penetração da medula espinhal quando todos os parâmetros estiverem estáveis. Um potencial de campo antidérmico da piscina de motoneuron será visível no traço de tensão de microeletrodes enquanto se aproxima de um núcleo motor dedicado durante a estimulação do respectivo nervo.
5. Proceda a penetração com a microeletrídula a passos de 1\u20122 μm e use periodicamente a função de zumbido do amplificador intracelular para limpar a ponta do eletrodo de qualquer resíduo.
6. Observe a penetração do motoneuron que será caracterizada por uma hiperpolarização súbita do traço de tensão registrado e aparência de um potencial de pico antidrómico.

5. Gravação de membrana de motoneuron e propriedades de disparo

1. Em um modo de ponte do amplificador intracelular, identifique o motoneuron com base na aparência "tudo ou nada" do potencial de ação antidrómica estimulando seus respectivos ramos nervosos. Registos 20 subsequentes para a média posterior.
2. Implementar um critério de inclusão rigoroso para garantir dados de alta qualidade: potencial de membrana de repouso de pelo menos -50 mV em amplitude; amplitudes potenciais de ação superiores a 50 mV, com um sobrev positivo; potencial de membrana estável por pelo menos 5 minutos antes de gravar.
3. Em um modo de fixação atual descontínua (modo de taxa de comutação atual de 4 a 8 kHz) do amplificador intracelular, evoque um potencial de ação ortodrómica em um motoneuron usando pulsos de corrente despolarizantes intracelulares de 0,5 ms. Repita pelo menos 20 vezes para a média offline.
4. Estimule um motoneuron com 40 pulsos curtos (100 ms) de corrente hiperpolarizadora (1 nA) a fim de calcular a resistência à entrada celular.
5. Estimule um motoneuron com pulsos de onda quadrada de 50 ms em amplitudes crescentes para determinar o valor da reobase como a amplitude mínima de corrente despolarizadora necessária para provocar um único pico.
6. Injete pulsos de onda quadrada de 500 ms de corrente despolarizadora, aumentando as amplitudes em passos de 0,1-2 nA para evocar descargas rítmicas de motoneurons.

6. Estimulação de corrente direta trans-espinhal (tsDCS)

1. Mantendo uma penetração estável do motoneuron, inicie o procedimento de polarização por aplicação trans-espinhal de corrente direta. Ajuste a intensidade atual e o tempo de aplicação ao design do experimento (por exemplo, 0,1 mA por 15 min).
2. Imediatamente após ligar o DC, observe o potencial da membrana do motoneuron. A polarização anodal (o eletrodo ativo como ânodo) deve resultar na despolarização do potencial da membrana, enquanto a polarização catódal (o eletrodo ativo como um cátodo) deve evocar um efeito oposto. Observe se uma mudança no potencial da membrana de repouso em resposta à estimulação dc é constante, o que garante que a intensidade do campo elétrico não seja afetada.
3. Durante a aplicação contínua de corrente, repita as etapas 5.3\u20125.6 em intervalos de 5 minutos.
4. Desligue o DC e continue repetindo as etapas 5.3\u20125.6 em intervalos de 5 minutos até que as gravações se tornem instáveis ou os critérios de inclusão sejam comprometidos.
5. Termine o experimento e eutanize o animal usando administração intravenosa de uma dose letal de sódio pentobarbital (180 mg·kg^-1).

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Resultados

Parâmetros de potencial de ação e várias propriedades de membrana podem ser calculados com base em gravações intracelulares quando condições estáveis de penetração celular são garantidas. A Figura 1A apresenta um potencial típico de ação ortodrómica evocado pela estimulação intracelular, que atende a todos os critérios de inclusão de dados (o potencial de membrana de repouso de pelo menos -50 mV, e a amplitude de pico superior a 50 mV, com uma superação positiva). Os pa...

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Discussão

Se realizada corretamente, a parte cirúrgica do protocolo descrito deve ser concluída dentro de aproximadamente três horas. Deve-se tomar cuidado especial na manutenção de condições fisiológicas estáveis de um animal durante a cirurgia, em especial a temperatura corporal e a profundidade da anestesia. Além de considerações éticas óbvias, a falta de anestesia adequada pode resultar em movimentos excessivos de membros durante a dissecção nervosa ou laminectomia e levar a danos à preparação ou a um térmi...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Durgs and solutions	-	-	-
Atropinum sulfuricum	Polfa Warszawa	-	-
Glucose	Merck	346351	-
NaHCO3	Merck	106329	-
Pancuronium Jelfa	PharmaSwiss/Valeant	-	Neuromuscular blocker
Pentobarbital sodium	Biowet Pu?awy Sp. z o.o	-	Main anesthetic agent
Pottasium citrate	Chempur	6100-05-06	-
Tetraspan	Braun	-	HES solution
Surgical equipment	-	-	-
21 Blade	FST	10021-00	Scalpel blade
Cauterizer	FST	18010-00	-
Chest Tubes	Mila	CT1215	-
Dumont #4 Forceps	FST	11241-30	Muscle forceps
Dumont #5 Forceps	FST	11254-20	Dura forceps
Dumont #5F Forceps	FST	11255-20	Nerve forceps
Dumont #5SF Forceps	FST	11252-00	Pia forceps
Forceps	FST	11008-13	Blunt forceps
Forceps	FST	11053-10	Skin forceps
Hemostat	FST	13013-14	-
Rongeur	FST	16021-14	For laminectomy
Scissors	FST	15000-08	Vein scissors
Scissors	FST	15002-08	Dura scissors
Scissors	FST	14184-09	For trachea cut
Scissors	FST	104075-11	Muscle scissors
Scissors	FST	14002-13	Skin scissors
Tracheal tube	-	-	Custom made
Vein catheter	Vygon	1261.201	-
Vessel cannulation forceps	FST	18403-11	-
Vessel clamp	FST	18320-11	For vein clamping
Vessel Dilating Probe	FST	10160-13	For vein dissection
Sugrgical materials	-	-	-
Gel foam	Pfizer	GTIN 00300090315085	Hemostatic agent
Silk suture 4.0	FST	18020-40	-
Silk suture 6.0	FST	18020-60	-
Equipment	-	-	-
Axoclamp 2B	Molecular devices	discontinued	Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A
CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor	CWE	11-10000	Gas analyzer
Grass S-88	A-M Systems	discontinued	Constant current stimulator
Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe	Harvard Apparatus	507222F	Heating system
ISO-DAM8A	WPI	74020	Extracellular amplifier
Microdrive	-	-	Custom made/replacement IVM/Scientifica
P-1000 Microelectrode puller	Sutter Instruments	P-1000	Microelectrode puller
SAR-830/AP Small Animal Ventilator	CWE	12-02100	Respirator
Support frame	-	-	Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting
Spinal clamps	-	-	Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting
TP-1 DC stimulator	WiNUE	-	tsDCS stimulator
Miscellaneous	-	-	-
1B150-4 glass capillaries	WPI	1B150-4	For microelectrodes production
Cotton wool	-	-	-
flexible tubing	-	-	For respirator and CO2 analyzer connection
MicroFil	WPI	MF28G67-5	For filling micropipettes
Silver wire	-	-	For nerve electrodes