Eletroretinograma acoplado direto (DC-ERG) para gravar as respostas elétricas evocadas pela luz do epitélio pigmento de retina do rato

Resumo

Aqui, apresentamos um método para registrar respostas elétricas evocadas pela luz do epitélio pigmento da retina (RPE) em camundongos usando uma técnica conhecida como DC-ERGs descrita pela primeira vez por Marmorstein, Peachey, e colegas no início dos anos 2000.

Resumo

O epitélio pigmento da retina (RPE) é uma monocamada especializada de células estrategicamente localizadas entre a retina e os coriocapillaris que mantêm a saúde geral e a integridade estrutural dos fotorreceptores. O RPE é polarizado, exibindo receptores ou canais localizados apicamente e basally, e realiza transporte vetorial de água, íons, metabólitos e secreta várias citocinas.

As medidas in vivo não invasivas da função RPE podem ser feitas usando ERGs acoplados diretos (DC-ERGs). A metodologia por trás do DC-ERG foi pioneira por Marmorstein, Peachey, e colegas usando um sistema de gravação de estimulação personalizado e mais tarde demonstrou usando um sistema comercialmente disponível. A técnica DC-ERG usa capilares de vidro preenchidos com a solução de sal tampão (HBSS) de Hank para medir as respostas elétricas mais lentas do RPE provocadas a partir de mudanças de concentração evocadas pela luz no espaço subretinal devido à atividade do fotorreceptor. O estímulo de luz prolongado e o comprimento da gravação dc-ERG tornam-no vulnerável à deriva e ao ruído, resultando em um baixo rendimento de gravações de utilidade. Aqui, apresentamos um método rápido e confiável para melhorar a estabilidade das gravações, ao mesmo tempo em que reduzimos o ruído usando pressão de vácuo para reduzir/eliminar bolhas que resultam da eliminação do HBSS e do suporte de eletrodos. Além disso, os artefatos da linha de energia são atenuados usando um regulador de tensão/condicionador de energia. Incluímos os protocolos necessários de estimulação de luz para um sistema ERG comercialmente disponível, bem como scripts para análise dos componentes DC-ERG: onda c, oscilação rápida, pico de luz e resposta off. Devido à melhor facilidade de registros e ao fluxo de trabalho de análise rápida, este protocolo simplificado é particularmente útil na medição de mudanças relacionadas à idade na função RPE, progressão da doença e na avaliação da intervenção farmacológica.

Introdução

O epitélio pigmento da retina (RPE) é uma monocamada de células especializadas que alinham o segmento posterior do olho e exercem funções críticas para manter a homeostase da retina¹. O RPE suporta fotorreceptores regenerando seu pigmento visual captura de fótons em um processo chamado ciclo visual², participando da fagocitose diurna das pontas do segmento externo do galpão³, e no transporte de nutrientes e produtos metabólicos entre fotorreceptores e os choriocapillaris^4,5. Anormalidades na função RPE estão por trás de inúmeras doenças da retina humana, como a degeneração macular relacionada à idade⁶, a amaurose congênita de Leber^7,8 e Melhor distrofia macular vitelliform⁹. Como os tecidos oculares doadores são frequentemente difíceis de obter apenas para fins de pesquisa, modelos animais com modificações genéticas podem fornecer uma maneira alternativa de estudar o desenvolvimento de doenças da retina^10,11. Além disso, o surgimento e a aplicação da tecnologia CRISPR cas9 agora permitem introduções genômicas (knock-in) ou exclusões (knock-out) em um processo simples de uma etapa superando as limitações das tecnologias anteriores de segmentação genética¹². O boom na disponibilidade de novos modelos de mouse¹³ requer um protocolo de gravação mais eficiente para avaliar não invasivamente a função RPE.

A medição das respostas elétricas evocadas pela luz do RPE pode ser obtida utilizando uma técnica de eletroretinograma acoplado direto (DC-ERG). Quando usado em combinação com gravações convencionais de ERG que medem as respostas celulares fotorreceptoras (a-onda) e bipolar (onda b)^14,o DC-ERG pode definir como as propriedades de resposta do RPE mudam com a degeneração da retina^15,16,17 ou se a disfunção RPE precede a perda do fotorreceptor. Este protocolo descreve um método adaptado do trabalho de Marmorstein, Peachey e colegas que desenvolveram pela primeira vez a técnica DC-ERG^16,18,19,20 e melhora a reprodutibilidade e facilidade de uso.

A gravação do DC-ERG é difícil de realizar devido ao longo tempo de aquisição (9 min) durante o qual qualquer interrupção ou introdução de ruído pode complicar a interpretação dos dados. A vantagem deste novo método é que as linhas de base atingem um estado estável em um período menor de tempo reduzindo a probabilidade de que o animal acorde prematuramente da anestesia e seja menos propenso à formação de bolhas nos eletrodos capilares.

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Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes de cuidado animal descritas no protocolo de estudo animal aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Nacional de Olhos.

1. Importação de protocolos de estimulação de luz para DC-ERG

NOTA: Siga as instruções abaixo para importar os protocolos de estimulação de luz para o DC-ERG no software do sistema ERG (Tabela de Materiais). O protocolo consiste em um intervalo pré-estímulo de 0,5 min, seguido por um passo de luz (10 cd/m²) por 7 min, e terminando com um intervalo pós-estímulo de 1,5 min. A intensidade de luz de 10 cd/m² (1 log₁₀ cd/m²) foi selecionada, pois evoca aproximadamente metade da resposta máxima para todos os componentes do DC-ERG em ratos WT^18,21. A onda c e a oscilação rápida são de particular interesse, pois as origens dessas respostas elétricas são bem caracterizadas e podem ser isoladas e estudadas ainda mais in vitro modelos RPE (por exemplo, iPSC-RPE). A aplicação de outras intensidades de luz pode extrair informações adicionais, por exemplo, a resposta off sofre uma reversão da polaridade em estímulos de luz mais brilhantes e pode mostrar diferenças na intensidade em que essa reversão ocorre. O usuário é livre para alterar as configurações de intensidade de luz a seu critério.

1. Abra o software do sistema ERG.
2. Clique no Database Center.
3. Clique em Novo (forneça um novo nome de arquivo de banco de dados). Clique em Salvar. A caixa pop-up exibirá: "Banco de dados criado, você deseja se conectar ao novo arquivo do banco de dados." Clique em Sim. O nome atual do banco de dados deve agora refletir o novo nome do arquivo.
4. Clique em Transferir na janela do centro de controle do banco de dados.
5. Selecione Arquivo Suplementar 1: LightProtocols - TRANSFER. EXP. Clique em Abrir.
6. Clique em Fechar (Centro de Controle de Banco de Dados) após a conclusão da barra de progresso.
7. Clique no botão iniciar verde.
8. Clique em Novo na Janela de Pacientes Selecionados. Crie um novo nome de família de paciente descrevendo o modelo do mouse, digite a data de nascimento (DOB, mm/dd/yyyy), alternou o botão de gênero (M/F) para a descrição apropriada. Clique em Fechar para salvar os detalhes experimentais.
9. Clique em Protocolos. Os protocolos ERG e DC-ERG adaptados à escuridão devem agora ser visíveis.
10. Por fim, coloque o arquivo Long Flash.col na seguinte pasta C:\ERG User Files\Long Flash.col.

2. Preparação do eletrodo capilar

1. Corte os capilares de vidro de 1,5 mm ao meio usando uma telha cerâmica(Tabela de Materiais) para marcar o vidro e quebrá-los limpamente usando uma mesa para fornecer contraforça física e estabilizar o vidro.
   NOTA: Corte as extremidades do corte conforme necessário.
2. O uso de um queimador Bunsen(Tabela de Materiais)permite que o calor faça uma pequena curva no capilar enquanto o segura sobre a chama com fórceps.

3. Enchimento de eletrodos capilares

1. Conecte o dessecador de vácuo à linha de vácuo do laboratório através de um filtro em linha(Tabela de Materiais).
2. Despeje 30 mL da Solução de Sal Balanceado (HBSS) (Tabela de Materiais) da Hanks em um tubo cônico aberto de 50 mL e coloque-o (com a tampa removida) na câmara de vácuo.
3. Ligue o vácuo e desgase o HBSS ao ligar o computador e o equipamento de gravação.
4. Depois de 5\u201210 min desligue o vácuo e use o HBSS desgaseado para encher uma seringa de 12 mL através de uma agulha de 25 G anexada. Use-o para preencher as bases dos porta-eletrodos tomando precauções extras para não introduzir bolhas.
   1. Para isso, remova a tampa do parafuso roscado e deslize cuidadosamente a agulha da seringa através da junta de borracha de silicone para alcançar a parede traseira (pelota de cloreto de prata/prata) do suporte.
      NOTA: As pelotas de cloreto de prata/prata são vantajosas sobre os suportes que usam fio de prata, pois fornecem mais área de superfície, resultando em uma linha de base estável de baixo ruído. No entanto, as pelotas de cloreto de prata/prata requerem uma interface líquida livre de bolhas de ar para obter uma boa conexão. Portanto, tome muito cuidado para não introduzir bolhas de ar durante esse processo.
   2. Injete gradualmente o HBSS para preencher toda a microeletrídada enquanto retrai lentamente a agulha da seringa. Recoloque a tampa roscada, mas não aperte. Reinsera a agulha da seringa para preencher o espaço vazio dentro da tampa com HBSS. Em seguida, encha o capilar de vidro enquanto segura horizontalmente para evitar que a solução escape da outra extremidade.
   3. Segure o capilar de vidro da extremidade dobrada e insira lentamente a extremidade oposta através da tampa solta e, em seguida, aperte a tampa do parafuso no lugar.
      NOTA: Eletrodos de vidro preenchidos com HBSS mantêm a lubrificação do olho do mouse e evitam a desidratação corneal que ocorreria com o uso de eletrodos de laço dourado padrão.
5. Posicione os suportes de eletrodos com os eletrodos capilares inclinados para cima para permitir que as bolhas fluam. Execute o vácuo por 5\u201210 min para degas. O gás que escapa das superfícies de vidro e plástico empurrará o HBSS para fora dos suportes de eletrodos.
6. Pare e, em seguida, solte lentamente o vácuo. Reabastecer os porta-eletrodos e capilares de vidro, conforme descrito anteriormente.
   NOTA: As bolhas tendem a ser coletadas sobre ou perto da junta de borracha de silicone e também podem se esconder nas ranhuras da tampa roscada, portanto, é preciso prestar atenção especial para manter essas áreas livres de bolhas.
7. Instale e fixe o suporte de microeletrodos no suporte de articulação T-clip/Magnetic ball(Figura 1A, inset). Para fazer o suporte personalizado para o suporte de microeletrodos, modifique um clipe T (5/16"-11/32" OD Tubing) #8(Tabela de Materiais) removendo os clipes poliacetais pretos de um lado. Tenha a base do cilindro das juntas de esfera magnética usinadas ao meio para ajustar a altura(Tabela de Materiais). Fixar os clipes T modificados nos parafusos de montagem da bola magnética com porcas do tamanho M3.
8. Coloque o suporte de microeletroder no clipe T modificado e segure-o firmemente no lugar deslizando em aproximadamente uma alça de madeira afilada de 1 polegada feita de quebrar uma vara de limpeza com ponta de algodão(Tabela de Materiais)em um ângulo. Use a base do cilindro de ímã de terras raras para posicionar com segurança o suporte de eletrodo personalizado sobre a placa metálica do palco, permitindo a rotação de 360° em um eixo de 180°.

4. Testar eletrodos

1. Despeje o HBSS em um recipiente pequeno (por exemplo, a tampa do tubo cônico de 50 mL).
2. Abaixe suavemente os microeletrodos capilares totalmente montados, cheios de HBSS na tampa contendo HBSS para pré-equilibrar os eletrodos e colocar o eletrodo moído da agulha (parte traseira/traseira) e o eletrodo de referência de pelotização de pelotização Ag/AgCl (boca) no mesmo HBSS para completar o circuito(Figura 1A).
   NOTA: Execute todas as etapas subsequentes sob luz vermelha fraca. Use uma lanterna de luz vermelha para posicionar o mouse e os eletrodos capilares. Lembre-se de desligar completamente todas as fontes de luz antes de iniciar a gravação.
3. Selecione ou crie um identificador apropriado (nome da família) para descrever o mouse a ser testado e selecione o protocolo DC-ERG a ser realizado completando o registro de acordo com a seguinte ordem.
   1. Clique em Protocolos. Selecione DC-ERG. Clique em Executar. Uma caixa de diálogo aparecerá: "O paciente atual é XXX [DOB: XX/XX/XX) Isso está correto para o teste que está sendo realizado?" Clique em Sim. Em seguida, prossiga para "Passo 1/6".
4. Feche as portas da jaula de Faraday.
5. Exibir o modo de impedância clicando em Impedance e verificar se os valores para a referência da boca, o solo da cauda e os eletrodos de gravação são aceitáveis (ver Figura 1B).
6. Teste a estabilidade da linha de base (ruído e deriva) clicando em Passo (seta para frente) para selecionar o passo 4/6 "Flash longo sem luz".
   NOTA: A quantidade de deriva observada quando os eletrodos são colocados no banho HBSS é geralmente inferior a 500 μV por 80 s uma vez que eles estabilizaram e é equivalente à deriva observada quando os eletrodos estão conectados ao mouse. Assim, a leitura elétrica dos eletrodos no banho HBSS é um importante indicador do estado dos eletrodos. O ruído, medido como pico ao pico, é geralmente ~ 10\u201215% maior no mouse do que no banho HBSS. Isso é provavelmente devido à adição de artefatos de movimento de respiração.
7. Comece a visualizar os traços clicando em Visualização. Os traços devem ser de baixo ruído com amplitude de pico ao pico <200 μV. Uma leve deriva (<500 μV/80 s) que gradualmente desaparece para a linha de base é aceitável(Figura 1C).

5. Posicionamento de rato e eletrodo

1. Mantenha os ratos durante a noite em uma caixa bem ventilada para adaptação escura.
2. Anestesiar os animais por injeção intraperitoneal de cetamina (80 mg/kg) e xilazina (8 mg/kg).
3. Aplique uma queda de 0,5% de proparacaine HCl topicamente para anestesiar a córnea, bem como uma queda de 2,5% de fenilefrina HCl e 0,5% de trópico para dilatar as pupilas.
4. Apare os bigodes do mouse com uma tesoura para evitar que a contração inadvertida perturnou os eletrodos capilares de vidro durante a gravação.
   NOTA: O protocolo de estímulo DC-ERG dentro do sistema ERG tem várias rotinas de estímulo incorporadas que podem ser selecionadas clicando na etapa (seta para frente) ou passo (seta para trás). Apenas as etapas 1, 4 e 5 do software são necessárias para preparar e executar a gravação dc-ERG.
5. No sistema ERG, verifique se o paciente correto está selecionado. Clique no botão protocolos verdes. De acordo com a descrição do protocolo, selecione DC-ERG. Em seguida, clique em Executar. Verifique se este é o teste correto que está sendo realizado clicando em Sim.
6. Use o estímulo da Luz Vermelha designada para o passo 1/6 para acender a luz vermelha dentro da cúpula para ajudar a posicionar o mouse e os eletrodos enquanto observa as mudanças na impedância.
7. Coloque o mouse sobre uma mesa de gravação aquecida e tenda cuidadosamente a pele da perna traseira usando fórceps. Segure o eletrodo da agulha firmemente em uma mão e insira-o subcutâneamente na perna traseira para fixá-lo no lugar.
8. Coloque a referência Eletrodo Ag/AgCl(Tabela de Materiais) dentro da boca para que a pelota sinteresse ao longo da bochecha traseira e seja mantida no lugar atrás dos dentes.
   NOTA: Os eletrodos de fio de ouro não devem ser usados como eletrodo de referência bucal, pois possuem características diferentes de impedância e aumentam o ruído de pico ao pico.
9. Antes de colocar os eletrodos capilares no olho do mouse, segure o suporte de eletrodo com os capilares de vidro vertical, pisque o suporte do eletrodo com o dedo indicador para remover quaisquer bolhas que possam ter sido introduzidas. Encha a ponta com HBSS usando uma agulha de 25 G presa a uma seringa e inspecione para garantir que não haja bolha de ar presa na ponta. Posicione o suporte do suporte do eletrodo para que a ponta aberta dos capilares cheios de HBSS esteja em contato suave com a córnea.
10. Use precauções especiais para evitar a introdução de bolhas de ar segurando o distribuidor de gel de olho lubrificante invertido e descarte as gotas iniciais. Coloque uma gota de gel lubrificante em cada olho para manter a condutividade e evitar a dessecação durante a gravação.

6. Gravação DC-ERG

1. Clique em Passo (seta para frente) para selecionar o passo 4/6 "Long Flash No Li".
2. Clique em Impedance. Use a tela de verificação de impedância para examinar as resistências dos olhos esquerdo e direito. Espera-se que os valores de impedância dos eletrodos de gravação em cada olho sejam semelhantes (~39 kΩ). Espera-se que os valores de impedância tanto para os eletrodos de terra quanto para referência sejam inferiores a 10 kΩ).
3. Clique em Visualização para ver os traços do olho esquerdo e direito. Aguarde que uma linha de base estável seja alcançada (<10 min). Clique em Parar para sair da visualização do rastreamento.
   NOTA: Mudanças bruscas na direção de deriva ou ruído aberrante na gravação não melhorarão com o tempo e exigirão a identificação do eletrodo capilar que requer atenção. A causa mais provável é uma bolha introduzida na ponta do eletrodo. Reabastecer a ponta com HBSS. Clique em Preview novamente para verificar a linha de base.
4. Clique em Passo (seta para frente) para selecionar o passo 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min.".
5. Clique em Executar para iniciar a gravação (Figura 1D).

7. Exportação de dados

1. Selecione o "Paciente" (Nome da Família) descrevendo a gravação do mouse a ser exportada.
2. Clique em Testes Antigos.
3. Em Descrição do protocolo selecione DC-ERG. Clique no botão verde Carregar para carregar os dados adquiridos anteriormente.
4. Clique em Passo (seta para frente) para avançar para o Passo 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min."
5. Clique em Exportar.
6. Forneça o nome do arquivo (e.g., nome de arquivo.csv). Um nome de arquivo válido deve começar com uma letra, seguida de letras, números ou sublinhados. Não use caracteres especiais ou hífens. O programa de análise de dados (DCERG_Analysis.exe) exige que as entradas de tabela satisfalham os requisitos para nomes variáveis.
7. Coloque uma marca de verificação ao lado da Tabela de Dados. Ao lado do separador, selecione Guia. Marcar as marcas de verificação ao lado de Opções(Títulos, Vertical),Incluir Todos(Etapas, Chans, Resultados),Colunas de Dados(Conteúdo, Resultados, Varreduras)e Formato(Arquivo).
8. Em seguida, clique em Exportar (Figura 1E). Isso salva o arquivo *.csv para a pasta C:\Multifocal.

8. Análise de dados

1. Baixe e instale o instalador de tempo de execução apropriado(Tabela de Materiais)
2. Baixe e instale o instalador de DCERG_Analysis.exe.
   NOTA: Isso instala o script que executará a análise dos componentes DC-ERG e cria um atalho para executar o programa na pasta Menu Iniciar.
3. Clique no atalho criado na pasta Menu Iniciar > Programas.
4. Selecione o arquivo de dados ou arquivos exportados (*.csv) para análise. Use Ctrl + clique esquerdo no mouse para selecionar mais de um arquivo.
   NOTA: O arquivo executável gera dois tipos de parcelas: 1) os dados brutos são plotados com uma linha de ajuste melhor indicando a deriva medida; 2) a resposta corrigida à deriva é plotada após ser suavizada com uma média móvel (com um intervalo de ~5 s). A partir deste gráfico são identificadas as amplitudes e o tempo-a-pico dos componentes DC-ERG: onda c, oscilação rápida, pico de luz e resposta off. Os dados são então exportados em formato de tabela para se destacar onde cada folha corresponde a uma gravação de mouse diferente. Essas folhas são seguidas por duas folhas de resumo: (i) amplitudes DC-ERG compiladas (mV); (ii) compilado dc-erg tempo-para-picos (início de luz, t = 0 min).

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Resultados

Figura 2 é um conjunto de dados de amostra de miR-204 ko/ko cre/+ (KO condicional) e ratos do tipo selvagem (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ são camundongos com um nocaute condicional de microRNA 204 no epitélio pigmento da retina. Esses camundongos são gerados pela travessia de camundongos miR-204 floxed (produzidos pela NEIGEF)²² com ratos VMD2-CRE²³. O MiR-204 é altamente expresso no RPE, onde regula a expressão de proteínas críticas para a...

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Discussão

Passos críticos

Uma boa gravação DC-ERG requer eletrodos estáveis que estão livres de bolhas que criam artefatos e deriva indesejada, pois são extremamente sensíveis à superagação e mudanças de temperatura. É essencial que uma linha de base estável seja alcançada quando os eletrodos são colocados na solução de banho HBSS antes de prosseguir com a gravação do mouse. Pequenas bolhas tendem a ser coletadas na base do eletrodo capilar ou ao redor da junta de sil...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ag/AgCl (mouth) Electrode	WPI Inc	EP1	Mouth reference electrode for mouse
Ceramic Tile	Sutter Instrument	CTS	Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size
Cotton Tipped Cleaning Stick	Puritan Medical Products	867-WC No Glue	To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly
Electroretinogram (ERG) System	Diagnosys LLC	E3 System	Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials
Bunsen Burner	Argos Technologies	BW20002460	Or equivlaent to shape glass under flame
Glass Capillary Tube (1.5 mm)	Sutter Instruments	BF150-75	For filling with HBSS and making contact to the cornea
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS)	Thermo Fisher Scientific Inc	14175-095	Commercially available. Maintain at RT
In-Line Filter	Whatman	6722-5001	To protect vacuum pump from aerosols
Low Noise Cable for Microelectrode Holders	WPI Inc	5372	Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies
Magnetic Ball Joint	WPI Inc	500871	For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage
MatLab	Mathworks		MatLab: For editing the analysis software
MatLab Curvefit Toolbox	Mathworks		Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software)
MatLab Compiler	Mathworks		Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software)
MatLab Runtime version 9.5	Mathworks	R2018b (9.5)	Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Microelectrode Holders (45 degrees)	WPI Inc	MEH345-15	For holding the capillaries
Needle (25 ga)	Covidien	8881250313	For filling the capillary tubes with HBSS
Needle (ground) Electrode	Rhythmlink	13mm - one elctrode	Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire)
Regulator/Power Conditioner	Furman	P-1800	Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line
Syringe (12 mL)	Monoject	1181200777	For filling the capillary tubes with HBSS
T-clip	Cole-Parmer	06852-20	For electrode holder assembly
Vacuum Desiccator	Bel-Art	420120000	Clear polycarbonate bottom & cover
Pharmacological treatment
Lubricant eye gel	Alcon	0078-0429-47	Helps lubricate corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes
Phenylephrine Hydrochloride 2.5%	Akorn	17478-201-15	Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
Proparacaine Hydrochloride 0.5%	Akorn	17478-263-12	Local anesthetic for ophthalmic instillation
Tropicamide 0.5%	Akorn	17478-101-12	Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
Xylazine	AnaSed	sc-362949Rx	Analgesic and muscle relaxant
Zetamine (Ketamine HCl)	VetOne	501072	Anesthetic for intramuscular injections