Microdissection laser RNA-Sequenciamento para Análise de Expressão Genética Espacial e Temporal-Específica do Tecido em Plantas

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para microdisseção de captura a laser (LCM) de tecidos vegetais. LCM é uma técnica microscópica para isolar áreas de tecido de forma livre de contaminação. O procedimento inclui fixação tecidual, incorporação de parafina, secção, LCM e extração de RNA. O RNA é usado na análise temporalmente resolvida do tecido a jusante dos transcriptomes.

Resumo

O desenvolvimento de um complexo organismo multicelular é regido por tipos de células distintas que têm diferentes perfis transcricionais. Para identificar redes regulatórias transcricionais que regem os processos de desenvolvimento é necessário medir os perfis de expressão genética espacial e temporal desses tipos de células individuais. Portanto, a visão sobre o controle espóvio-temporal da expressão genética é essencial para obter a compreensão de como os processos biológicos e de desenvolvimento são regulados. Aqui, descrevemos um método de microdissecção de captura a laser (LCM) para isolar um pequeno número de células de três órgãos de embrião de cevada durante um curso de tempo durante a germinação seguido de perfil de transcrição. O método consiste em fixação tecidual, processamento de tecidos, incorporação de parafina, secção, LCM e extração de RNA seguido de PCR em tempo real ou RNA-seq. Este método nos permitiu obter perfis espaciais e temporais de transcritos de órgãos de sementes de diferentes números de células (dezenas a centenas), fornecendo uma especificidade tecidual muito maior do que as análises típicas de tecido a granel. A partir desses dados, conseguimos definir e comparar redes regulatórias transcricionais, bem como prever fatores de transcrição regulatória de candidatos para tecidos individuais. O método deve ser aplicável a outros tecidos vegetais com otimização mínima.

Introdução

O desenvolvimento e o crescimento das plantas envolvem a ação coordenada de redes reguladoras transcricionais dentro de diferentes células que existem em um ambiente celular complexo. Para entender a atividade dessas redes regulatórias, exigimos o conhecimento da expressão genética espacial e temporal dentro de diferentes tipos de células em estágios de desenvolvimento. No entanto, as análises da expressão genética são mais comumente conduzidas em órgãos inteiros ou amostras de tecido a granel devido ao desafio técnico de isolar e analisar um pequeno número de células. O método que descrevemos aqui permitiu a obtenção de análises de transcriptome espacial e temporal específicas do tecido, acoplando LCM com RNA-seq.

O LCM foi desenvolvido há duas décadas pela Emmert-Buck e pelos colegas¹. A técnica permitiu aos pesquisadores isolar precisamente células únicas ou aglomerados de células de seu ambiente usando visualização e manipulação microscópica direta com um laser de feixe estreito¹. Desde então, o método tem sido amplamente utilizado em biologia do câncer e patologia^2,3. Muitos grupos de pesquisa vegetal também adaptaram LCM para uso com diferentes espécies de plantas e diferentes tipos de tecidos^{4,,5,,6,,7,8,,9,,10,,11}. Recentemente, vários artigos também utilizaram LCM em sementes de eudicot e monocot para estudar embriões, endospermos e outras estruturas de sementes durante o desenvolvimento de sementes e germinação^10,,12,,13. A maioria dos outros métodos de isolamento unicelular comumente usados, como micro-pipetação, classificação celular, separação magnética e plataformas microfluidas dependem da digestão enzimática ou homogeneização mecânica para dissociar células. Isso pode perturbar a expressão genética, introduzindo artefatos técnicos que confundem a interpretação dos dados^14,15. Esses métodos também requerem conhecimento prévio de genes marcadores para cada tipo de célula para relacionar as células dissociadas à sua localização espacial e ao verdadeiro tipo celular. Um outro grupo de técnicas depende do isolamento baseado em afinidade de estruturas subcelulares em vez de células inteiras, como INTACT (Isolamento de Núcleos Marcados em Tipos de Células) e TRAP (Traduzindo Purificação de Afinidade Ribossome)^16,17. No entanto, a rotulagem e purificação de núcleos ou ribossomos são tecnicamente desafiadoras em espécies vegetais que não possuem protocolos de transformação bem estabelecidos. O LCM aproveita a fixação rápida do tecido para preservar os níveis de transcrição e a identificação histológica convencional por visualização direta das células dentro de seu contexto normal de tecido/órgão, o que permite que células discretas sejam isoladas em um curto período de tempo^18,19.

O protocolo aqui apresentado é um método otimizado para o isolamento de células específicas ou tipos celulares das seções teciduais das sementes de cereais, que podem ser aplicadas à maioria das células que podem ser histologicamente identificadas. O LCM fornece um método livre de contatos de isolamento celular, reduzindo consideravelmente a contaminação e aumentando a integridade do RNA recuperado. Além disso, o método ilustra o poder do LCM em estudos de grande escala de genomas, começando com pequenas quantidades de materiais biológicos. Também descrevemos a amplificação linear do RNA para gerar material de entrada suficiente para análises de transcrição/transcriptome a jusante.

Existem dez etapas principais neste protocolo LCM RNA-seq para transcriçãos espaciais e temporais específicas do tecido, incluindo fixação de amostras de tecido, desidratação, infiltração de parafina, incorporação, secção, LCM, extração de RNA, amplificação de RNA, quantificação de RNA e qRT-PCR e/ou RNA-seq(Figura 1).

Figura 1: Fluxograma de LCM seguido por RNA-seq ou qRT-PCR. LCM é uma técnica espacialmente precisa e livre de contatos para coletar células de seções de tecido fixo usando um raio laser sob visualização microscópica. O processo começa com fixação de amostras de tecido, seguido de desidratação usando uma série gradiente de etanol e xileno, e finalizado com infiltração de parafina. O processo pode ser totalmente automatizado usando um processador de tecido. Uma vez que o tecido é infiltrado com parafina, ele é incorporado em um molde com parafina derretida usando uma estação de incorporação. A secção é realizada utilizando-se microtoma definido para a espessura desejada. Slides são preparados e LCM conduzido imediatamente antes do RNA deve ser extraído das células capturadas. A extração de RNA é seguida diretamente por duas rodadas de amplificação de RNA antes do qRT-PCR e/ou RNA-seq. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

Como o produto final é RNA, tome cuidado para evitar contaminar o trabalho com RNases. Usar luvas é imperdível. Use pirocarbonato dietil (DEPC) -água tratada, tampões, etc. Tampões de autoclave e assar vidros antes de usar.

1. Fixação de tecidos

1. Preparar fixação de escolha dependendo das espécies e tipos de tecidos; para sementes de cevada, use o fixador do Farmer (75% de etanol, 25% ácido acético glacial (v/v)).
2. Esfrie o fixador no gelo antes de colher tecidos.
3. Colete o material vegetal de interesse e, se necessário, disseca-o em pedaços de tamanho apropriado para caber no molde de incorporação selecionado. Para a semente de cevada, corte a semente em meio longitudinalmente para ajudar a penetração da solução fixativa e para caber no molde de incorporação.
4. Submergir o tecido em pelo menos 10x de fixação gelada. Para a semente de cevada, submergir a semente cortada ao meio no fixador.
5. Use infiltração a vácuo para acelerar a penetração de fixação. Os tecidos devem afundar após a infiltração a vácuo do fixador. Para sementes de cevada, use 30 minutos de infiltração a vácuo.
6. Substitua o fixador e incubar a 4 °C para permitir que o fixador penetre totalmente o tecido. Para sementes de cevada, incubar as amostras durante a noite (~12-16 h).
   NOTA: Tecidos mais finos ou pequenos exigirão menor tempo de fixação devido à maior taxa de difusão de fixação no tecido.
7. Remova o tecido de fixação e transfira o tecido em fitas e, em seguida, inicie o processamento tecidual.
   NOTA: Tecidos pequenos ou frágeis, como o tecido da folha, podem ser colocados em fitas para fixação para garantir que não seja danificado durante a fixação. Sacos de biópsia, almofadas ou embalagens podem ser usados para manter o tecido firmemente dentro das fitas durante as etapas de fixação tecidual e processamento de tecidos.

2. Processamento de tecidos

1. Use um processador de tecido automatizado na etapa 2 com um mínimo de 10 câmaras de solução e 2 câmaras de parafina aquecidas (ver Tabela de Materiais).
2. Verificar se há quantidades adequadas de solução em cada câmara; substituir soluções após cada pouco uso do processador de tecido.
3. Coloque com tecido na cesta de metal. Coloque a cesta de metal ao seu suporte acima da câmara 1. O titular irá girar e "mergulhar e mergulhar" as fitas nas câmaras, seguindo o programa designado.
4. Defina o programa executando cliques de botão nos painéis de controle do processador de tecido que envolvem a definição do tempo para cada câmara.
5. Pressione o botão "Iniciar" para iniciar o programa de processamento. O programa a seguir é projetado para sementes de cevada e funciona durante a noite (~18 h)
   1. Realizar a desidratação mergulhando o por 1h 30 min cada na série gradiente de etanol (75%, 85%, 100%, 100% e 100% (v/v) etanol).
   2. Realizar a compensação utilizando etanol: gradiente de xileno para 1 h 30 min cada às 75:25, 50:50, 25:75 (etanol: xileno %, v/v). Em seguida, mergulhe o por 1 h 30 min cada um de 100% xileno e 100% xileno.
   3. Realize a infiltração de parafina a 55-60 °C por 1 h 30 min duas vezes em parafina derretida.
      NOTA: A temperatura das câmaras de aquecedor de parafina pode ser fixada na parte de trás do processador de tecido.
6. Na manhã seguinte, remova as fitas do processador de tecido e prossiga para a incorporação da parafina.
   NOTA: O tempo do programa pode variar entre diferentes tipos de tecido. O vácuo e/ou agitação podem ser usados durante o processamento de tecidos para acelerar a infiltração de soluções selecionadas pressionando botões "V" e/ou "agitação" no painel de controle do processador de tecido.

3. Incorporação de parafina

1. Use uma máquina de incorporação nesta etapa (ver Tabela de Materiais).
2. Predefinir a máquina de incorporação para ligar pelo menos algumas horas antes da incorporação para dar tempo para que a parafina nos reservatórios derreta completamente.
3. Ligue a placa fria antes de começar.
4. Incorpore amostras em moldes, mantendo as amostras em posição usando fórceps finos e distribuindo parafina derretida no molde. Assegure a orientação adequada das amostras para cada final experimental. Para a semente de cevada, oriente a semente longitudinal à direção de corte para obter seções longitudinais.
   NOTA: Os moldes de incorporação vêm em tamanhos diferentes. Selecione um tamanho apropriado para permitir que a amostra seja posicionada e incorporada corretamente. A orientação das amostras deve ser considerada dependendo das necessidades experimentais. Se forem necessárias seções longitudinais, a amostra deve ser orientada longitudinal à direção de corte, enquanto para seções transversais a amostra deve ser orientada paralelamente à direção de corte.
5. Coloque um limpo sobre o molde e certifique-se de que a parafina suficiente cubra todo o para segurar a amostra no.
6. Coloque o molde sobre a placa fria e deixe que a parafina se coloque totalmente (10-20 min) antes de liberar o bloco do molde.
7. Proceda à secção ou transfira os blocos para 4 °C para armazenamento.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Os blocos embutidos podem ser armazenados a 4 °C por até três meses.

4. Preparação de lâminas de membrana de naftalina de polietileno (PEN)

1. Slides de membrana PEN submersa na solução desativação RNase para 3 s seguido por duas lavagens breves em água tratada com DEPC para remover RNases nas lâminas. Seque as lâminas em uma incubadora de 37 °C para remover a solução que sobrou.
2. UV-treat os slides usando uma lâmpada UV em um gabinete de fluxo laminar por 30 minutos para melhorar as propriedades hidrofílicas para melhor adesão à parafina.

5. Secção

1. Use um microtome na etapa de secção (ver Tabela de Materiais).
2. Coloque uma nova lâmina no porta-faca, e mantenha sempre a guarda da faca para cima quando não secionar ativamente
   ATENÇÃO: As lâminas de microtome são extremamente afiadas e podem causar danos significativos quando tratadas de forma inadequada.
   NOTA: Existem dois mecanismos de travamento no microtome, um está ao lado da máquina e o outro está na alça da roda. Ambos devem ser engajados quando não se seccionar ativamente.
3. Ajuste o bloco da faca para estar o mais próximo possível da amostra sem tocar. Certifique-se de que o braço de microtoma nunca entra em contato total com o bloco da faca, pois isso causará danos estruturais catastróficos ao microtome.
4. Ligue a placa fria antes de começar. Mantenha os blocos de parafina na placa fria antes de seccionar e re-esfriar os blocos quando necessário durante a secção para evitar que os blocos amoleçam.
5. Encha o banho de água com água tratada com DEPC e aqueça até 42 °C antes de começar.
6. Corte blocos à profundidade desejada (onde a seção você está interessado) e blocos de parafina de seção na espessura desejada (6-10 μm) usando o microtome; um bloco bem seccionado formará uma 'fita' na borda da lâmina. Para sementes de cevada, seção com espessura de 8 μm.
7. Transfira suavemente as fitas do microtome para o banho de água usando pincel fino ou fórceps finos, garantindo que a fita esteja plana na superfície da água.
8. Segure um slide em um ângulo de 45°, usando um movimento ascendente, levante uma fita da água sobre o escorregador e remova cuidadosamente o excesso de água com um tecido livre de fiapos.
9. Lâminas secas por 30 min a 37 °C para eliminar qualquer água restante sob a parafina.
10. Proceda à remoção de parafina ou armazenar a 4 °C em uma caixa fechada em condições de desidratação (a ser usada dentro de vários dias).
11. Remova a parafina lavando as lâminas 3x por 20 s cada em xileno, seguida por lavagens 2x de 30 s em 100% (v/v) etanol e 2x lavadores de 30 s em 70% (v/v) etanol.
12. Prossiga imediatamente para microdisseção de captura a laser após a remoção da parafina.
    NOTA: O cryosectioning é um método alternativo que foi acoplado com sucesso com o LCM. A preparação da amostra para a crioseção difere.

6. Microdisseção de captura a laser

1. Use um microscópio de microdissecção de captura a laser (ver Tabela de Materiais) para células de microdissto de seções de tecido desofinado e seco.
2. Carregue slides nos três slots disponíveis.
3. Use as tampas adesivas especiais dos tubos de coleta para coletar as amostras capturadas. A captura sem coleta líquida ("seca") minimiza a atividade da RNase. Coloque os tubos de coleta nos slots disponíveis.
4. Mova o palco para localizar a região da amostra que precisa ser cortada. Isso pode ser feito usando mouse ou joystick da máquina LCM, ou as teclas de seta no teclado.
5. Para otimizar a velocidade de corte, cortando energia e foco, a energia e o foco da catapultação de pressão a laser (LPC), primeiro corte em um segmento em branco livre de tecido na lâmina da membrana. Para sementes de cevada, velocidade de corte = 18, CutEnergy = 52 CutFocus = 63, LPCEnergy = 78, foco LPC = 61 a 10x de ampliação.
   NOTA: O foco de corte e a energia devem ser ajustados para diferentes lâminas, diferentes tecidos e área capturada, mas as regras gerais são que o poder catapultante é maior do que a potência de corte e o laser tem que ser desfocado para catapultar. Quanto maior a ampliação da lente objetiva, menor o foco do laser e maior a energia.
6. Use as ferramentas de desenho para selecionar células, delineando a área de interesse.
7. Selecione a função RoboLPC da barra de ferramentas da função para catapultar células para as tampas adesivas com base nos parâmetros otimizados obtidos pelo corte em um segmento preto acima.
   NOTA: Os parâmetros de LCM variam entre os tipos de tecido, bem como a espessura da seção, dureza tecidual e lentes objetivas. Portanto, é melhor otimizar cada slide em uma área de membrana simples sem amostra de tecido antes de cortar a amostra real.
8. Use as ferramentas Flag para marcar regiões de interesse para localizá-las imediatamente, selecionando essa bandeira da lista de elementos.
9. Verifique pelo botão "CapCheck" para inspecionar a tampa adesiva para confirmar que as amostras foram capturadas. Normalmente, lcm de 10-15 seções (~200 células) por tampa é necessário para extração de RNA.
10. Mantenha as amostras capturadas no gelo. Proceda imediatamente para a extração de RNA para evitar a degradação do RNA.
    NOTA: Algumas microscopias LCM são equipadas com luz fluorescente que permite a captura de células rotuladas com marcadores fluorescentes.

7. Extração de RNA

1. Use um kit de isolamento de RNA de baixa entrada (ver Tabela de Materiais) para extração de RNA após LCM. Tais kits são projetados para recuperar RNA total de alta qualidade consistentemente de menos de dez células.
2. Isole o RNA total dos tipos de células capturadas de acordo com as instruções do fabricante, incluindo o tratamento DNase na coluna.
   NOTA: O primeiro passo da extração de RNA onde o tubo é invertido e arremessado é crucial para garantir que as amostras capturadas na tampa estejam em contato com o tampão de extração adicionado.

8. Amplificação de RNA

1. Use um kit de amplificação de RNA (aRNA) antissense (ver Tabela de Materiais) para amplificação de aRNA do RNA extraído por transcrição in vitro para produzir aRNA suficiente para síntese de biblioteca RNA-seq.
2. Realize duas rodadas de amplificação usando o kit de amplificação aRNA de acordo com as instruções do fabricante.
   NOTA: É importante pré-aqueça o termociclador e a tampa até a temperatura instruída pelo fabricante do kit (ver Tabela de Materiais). Uma abordagem alternativa em vez da amplificação do RNA é usar um kit de preparação de biblioteca de entrada baixa para sintetizar a biblioteca diretamente do RNA extraído.

9. Quantificação de RNA

1. Quantifique e qualifique o ARNA usando um sistema automatizado de eletroforese (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Um sistema automatizado de eletroforese é preferido, pois requer menos amostra (1-2 μL) e fornece uma imagem e eletroferograma semelhantes a gel para cada amostra individual.

10. qRT-PCR e/ou RNA-seq

1. Sintetizar cDNA do aRNA para qRT-PCR ou para fazer bibliotecas RNA-seq usando kits de biblioteca RNA-seq padrão.

Resultados

Geramos transcrições espaciais e temporais específicas de tecidoes a partir de sementes de cevada durante a germinação usando nosso protocolo LCM RNA-seq¹⁰. O estudo foi realizado aplicando LCM RNA-seq a um pequeno número de células de três órgãos embrionários (plumule, ponta de radículo, scutellum) a cada 8 h durante um curso de tempo de 48h durante a germinação (0-48 h, 7 pontos de tempo)(Figura 2A,B).

Discussão

Muitos estudos de expressão genética específicos do tecido têm sido limitados pela dissecação manual de amostras, que é demorado, trabalhoso, tem um alto risco de contaminação e só pode utilizar amostras que um agente humano é suficientemente hábil para colher. LCM é uma técnica precisa e livre de contatos para coletar células de seções de tecido fixo usando um raio laser operado mecanicamente sob visualização microscópica.

Uma boa preparação amostral é fundamental para ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid 100 % ACS/R.	AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)	VWRC20104.323
AdhesiveCap 200 opaque	Zeiss	415190-9181-000
Clear base moulds 8 X 10	Leica	3803015
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	40718-25ML
High Sensitivity RNA ScreenTape	Agilent	5067-5579
Low­profile disp.blades DB80LS	Leica	14035843489
MembraneSlide 1.0 PEN	Zeiss	415190-9041-000
MessageAmp II aRNA Amplification Kit	Ambion (ThermoFisher)	AMB17515
On-Column DNase I Digestion Set	Sigma-Aldrich	DNASE70
Ovation RNA-Seq System V2	NuGen (Integrated Science)	7102-08
Paraffin (Surgipath Paraplast)	Leica	39601006
PicoPure RNA Isolation Kit	ABI (ThermoFisher)	KIT0214
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Ambion (ThermoFisher)	AM9780
Xylene	AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)	VWRC28975.360
Leica Benchtop Tissue Processor	Leica Biosystems	TP1020
Leica Heated Paraffin Embedding Module	Leica Biosystems	EG1150H
Leica Cold Plate	Leica Biosystems	EG1150C
Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets	LAF Technologies Pty Ltd	Safemate 1.5
Leica Fully Automated Rotary Microtome	Leica Biosystems	RM2265	with PALMRobo v 4.6 software
Zeiss PALM MicroBeam LCM system	Zeiss miscroscopy
TapeStation	Agilent	TapeStation 2200