Mitigação do apego de células transmitidas sanguíneas a implantes metálicos através da imobilização de peptídeos derivados do CD47

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para anexar peptídeo CD47 (pepCD47) a stents metálicos usando química polifosfosfonato. A funcionalidade dos stents metálicos utilizando pepCD47 impede o apego e ativação de células inflamatórias, melhorando assim sua biocompatibilidade.

Resumo

As principais complicações associadas com stents metálicos nus e stents de eluição de drogas são restenose de stent e trombose do stent tardio, respectivamente. Assim, melhorar a biocompatibilidade dos stents metálicos continua sendo um desafio significativo. O objetivo deste protocolo é descrever uma técnica robusta de modificação da superfície metálica por peptídeos biologicamente ativos para aumentar a biocompatibilidade de implantes médicos de contato sanguíneo, incluindo stents endovasculares. CD47 é um marcador de auto-doença específico de espécies imunológicas e tem propriedades anti-inflamatórias. Estudos mostraram que um peptídeo de 22 aminoácidos correspondente ao domínio Ig de CD47 na região extracelular (pepCD47), tem propriedades anti-inflamatórias como a proteína de comprimento total. Estudos in vivo em ratos, e estudos ex vivo em sistemas experimentais de coelhos e sangue humanos do nosso laboratório demonstraram que a imobilização pepCD47 em metais melhora sua biocompatibilidade, impedindo a fixação e ativação de células inflamatórias. Este artigo descreve o protocolo passo a passo para a funcionalização de superfícies metálicas e acessório de peptídeo. As superfícies metálicas são modificadas usando bisfosfato de poliallavina com grupos de tiol latente (PABT), seguidos de desproteção de tiais e amplificação de sítios de tiol-reativos via reação com polietileneimina instalada com grupos piridyldithio (PEI-PDT). Finalmente, pepCD47, incorporando resíduos de cisteína terminal conectados à sequência de peptídeos do núcleo através de um espaçador duplo 8-amino-3,6-dioxa-octanoyl, são anexados à superfície metálica através de ligações de dissulfeto. Esta metodologia de apego de peptídeo à superfície metálica é eficiente e relativamente barata e, portanto, pode ser aplicada para melhorar a biocompatibilidade de vários biomateriais metálicos.

Introdução

A intervenção coronária percutânea é a primeira linha de terapia para tratar doenças da artéria coronária (CAD) e envolve principalmente o stent das artérias doentes. No entanto, a restenose do stent (ISR) e a trombose do stent são complicações comuns associadas à implantação do stent¹. A interação sanguínea na interface sangue-stent é caracterizada por uma adsorção quase imediata de proteínas plasmáticas na superfície metálica, seguida por apego e ativação celular plaquetária e inflamatória². A liberação das citocinas inflamatórias e quimiocinas de células inflamatórias ativadas leva à modificação fenotípica das células musculares lisas vasculares (VSMCs) na mídia tunica e desencadeia sua migração centrípeta para o compartimento intimal. A proliferação de VSMC ativado na intimação resulta em espessamento de camada intimal, estreitamento do lúmen e restenose in-stent³. Os stents de eluição de drogas (DES) foram desenvolvidos para evitar a proliferação do VSMC; no entanto, essas drogas têm um efeito citotóxico fora do alvo nas células endoteliais^4,5. Portanto, trombose do stent tardio é uma complicação comum associada ao DES^6,7. Stents feitos de polímeros biodegradáveis, como o poli-L-lactide, mostraram muita promessa nos experimentos animais e ensaios clínicos iniciais, mas acabaram sendo lembrados quando o uso clínico "da vida real" demonstrou sua inferioridade à^3ª geração do DES⁸. Portanto, é necessário melhorar a biocompatibilidade dos stents metálicos nus para melhores resultados do paciente.

CD47 é uma proteína transmembrana onipresentemente expressa que inibe a resposta imune inata quando vinculada ao seu receptor cognato Signal Regulatory Protein alfa (SIRPα)⁹. O receptor SIRPα possui um motivo inibidor de tyrosina de células imunes (ITIM) e os eventos de sinalização sobre a interação SIRPα - CD47 acabam resultando na queda da ativação celular inflamatória^{10,,11,,12,13}. Pesquisas em nosso laboratório mostraram que cd47 recombinante ou seu derivado peptídeo, correspondente ao domínio de 22 aminoácidos Ig da região extracelular de CD47 (pepCD47), pode reduzir a resposta imune do hospedeiro a uma gama de biomateriais clinicamente relevantes^14,,15,,16. Recentemente, demonstramos que o pepCD47 pode ser imobilizado para superfícies de stent de aço inoxidável e reduzir significativamente a resposta fisiopatológica associada à restenose. Note-se que as superfícies modificadas pepCD47 são favoráveis a condições de uso relevantes, como armazenamento a longo prazo e esterilização de óxido de etileno¹⁷. Para isso, o pepCD47 pode ser um alvo terapêutico útil para lidar com as limitações clínicas dos stents endovasculares.

A estratégia para a fixação covalente de pepCD47 a uma superfície metálica envolve uma série de novas modificações químicas da superfície metálica. As superfícies metálicas são primeiro revestidas com bisfosfonato de poliallavina com grupos de tiol latentes (PABT), seguidos pela desproteção dos tiols e apego da polietileneimina (PEI) com grupos piridyldithio instalados (PDT). Grupos de PDT de PEI não consumidos na reação com thiols PABT desprotegidos são então reagidos com pepCD47 incorporando thiols nos resíduos de cisteína terminal, resultando em pepCD47 de ligação à superfície metálica através de uma ligação de dissulfeto^14,,17,18. Utilizamos um pepCD47 conjugado fluoróforo (TAMRA-pepCD47) para determinar a concentração de entrada de peptídeo que resulta na imobilização máxima da superfície do peptídeo. Finalmente, avaliamos a capacidade anti-inflamatória aguda e crônica das superfícies metálicas revestidas de pepCD47, ex vivo, utilizando o aparelho de loop Chandler, e o ensaio de expansão de apego/macrófago monócito/ macrófago, respectivamente.

Este artigo fornece um protocolo sistemático para a fixação de peptídeos tiaolados à superfície metálica; determinando a densidade máxima de imobilização do peptídeo; e avaliando as propriedades anti-inflamatórias das superfícies metálicas revestidas pepCD47 expostas a sangue inteiro e monócitos isolados.

Protocolo

Todas as amostras humanas para este experimento foram obtidas de acordo com o IRB do Hospital Infantil da Filadélfia. Todos os experimentos em animais foram realizados mediante aprovação do IACUC do Hospital Infantil da Filadélfia.

1. Revestimento de superfícies metálicas nuas com PEI-PDT

1. Lave os cupons de papel alumínio inoxidável (1 cm x 1 cm ou 0,65 cm x 1 cm) ou discos de malha de aço inoxidável com 2 isopropanol em um shaker (60 °C, velocidade de 200 rpm) por 5 min. Realize esta etapa 2x. Em seguida, lave 2x com clorofórmio (60 °C, velocidade de 200 rpm) por 10 min cada.
2. Coloque as amostras de aço inoxidável limpas em um forno a 220 °C por 30 minutos.
3. Prepare 5 mL de 0,5% da solução PABT dissolvendo 25 mg de bisfosfonato de poliallavina com grupos de tiol latente (PABT) e 5 mg de bicarbonato de potássio (KHCO₃) em 5 mL de DDW e incubar a 72 °C em um shaker a 200 rpm por 30 min.
   NOTA: Para a síntese de PABT consulte a literatura publicada anteriormente¹⁸.
4. Mergulhe as folhas assadas ou discos de malha em solução aquosa de 0,5% de PABT e incuba em um shaker (72 °C, velocidade de 200 rpm) por 1h.
5. Lave as amostras modificadas pelo PABT com água destilada desionizada (DDW) por 5x, transfira as amostras em um novo frasco e lave novamente com DDW por 5x.
6. Prepare um total de 5 mL de solução DE TCEP (12 mg/mL) dissolvendo 60 mg de Tris (2-carboxyethyl) cloridrato de fosfina (TCEP) em 5 mL de 0,1 M tampão acético (0,57 mL de ácido acético glacial, 820 mg de acetato de sódio em 100 mL de DDW).
7. Trate as amostras modificadas pelo PABT com TCEP por 15 minutos em temperatura ambiente (RT) em um agitador.
   NOTA: O TCEP é usado para desprotetor os grupos de thiol.
8. Degas DDW em um frasco de fundo redondo usando um dispositivo gerador de vácuo, como um liofilizador e lavar as folhas tratadas TCEP ou discos de malha com DDW desgassed por 5x. Transfira as amostras em um novo frasco e, adicionalmente, lave 5x com DDW desgaseado.
   NOTA: É primordial trabalhar rápido para evitar a oxidação de tiais na superfície metálica pelo oxigênio atmosférico.
9. Prepare 5 mL de solução PEI-PDT de 1% diluindo 212,5 μL de estoque PEI-PDT e 125 μL de acetato de sódio de 0,4 M em DDW desgaseado. Realizar a etapa 1.9 simultaneamente com a etapa 1.8 para minimizar a exposição das amostras ao ar atmosférico.
   NOTA: A síntese do PEI-PDT está descrita na literatura publicada anteriormente¹⁸.
10. Incubar as amostras de aço inoxidável lavadas com 1% PEI-PDT. Substitua o ar por gás argônio, sele os frascos de ar apertado e misture em um shaker no RT por 1h. Ou proceda imediatamente com a conjugação do peptídeo ou armazene a 4 °C até 1 semana.

2. Fixação e avaliação qualitativa/quantitativa da retenção de pepCD47 conjugado fluoroforeiro na superfície metálica usando microscopia de fluorescência e fluoremetria

1. Lave cupons de papel alumínio ou discos de malha preparados conforme descrito na seção 1, etapas 1.1-1.10 acima com DDW 5x. Transfira as amostras para um novo frasco e lave com DDW por mais 5x. Por fim, lave 2x com etanol desgaseado e 2x com dimetil formamemida desgaseada (DMF).
2. Prepare a solução de estoque pepCD47 conjugada por tetrametilrhodamina (TAMRA)-conjugada, dissolvendo o pó pepCD47 conjugado por TAMRA em dimetilaformamida desgasegada (DMF) a uma concentração final de 1 mg/mL. Aliquot a solução de ações em loteamentos de 1 mL. Armazene em tubos bem selados sob atmosfera de argônio a -20 °C.
3. Diluir 1 mg/mL da solução de estoque de pepCD47 conjugado por TAMRA usando DMF desgaseada para preparar as seguintes concentrações de pepCD47 conjugado fluorforo - 10, 30, 100 e 200 μg/mL.
   NOTA: Se o pepCD47 conjugado por TAMRA parecer precipitado, reduza o estoque da solução pepCD47 conjugada por TAMRA usando contas DEP na proporção 1:1, em RT por 20 minutos. Observe que antes de adicionar o pepCD47 conjugado tamra às contas TCEP, gire a solução de contas TCEP, remova o supernatante e, em seguida, proceda com a adição do pepCD47 conjugado por TAMRA.
4. Incubar os cupons de folha modificados PEI-PDT com 10, 30, 100 ou 200 μg/mL de pepCD47 conjugados por TAMRA em triplicados para cada condição em um shaker na RT sob atmosfera de argônio por 1 hora. Incubar discos de malha modificados PEI-PDT, bem como disco de malha não modificado além da etapa 1.2 (controles metálicos nus) com 100 μg/mL de pepCD47 conjugado tamra em triplicados na RT sob atmosfera de argônio em um shaker por 1 h.
   NOTA: A partir deste passo, os frascos são embrulhados em papel alumínio para proteger o conteúdo da luz.
5. Lave as superfícies conjugadas de pepCD47 conjugadas fluorohore para remover o peptídeo não covalente na seguinte ordem: DMF (3x), DMF/DDW em 1:1, DDW (3x), 0,3% SDS em 20 mM Tris pH 7.4 (3x, 5 min cada a 70 °C em um shaker), DDW (3x), frascos de troca e uma lavagem DDW final.
6. Coloque o controle e os discos de malha conjugados em um vidro microscópio, adicione 50 μL de PBS e coloque uma mancha de cobertura. Discos de malha de imagem usando um microscópio de fluorescência invertida equipado com um conjunto de filtro de rhodamina. Tire imagens representativas na ampliação de 100x.
7. Prepare 15 mL de solução DE 12 mg/mL TCEP dissolvendo 180 mg de TCEP em mistura de 1:1 v/v de metanol e tampão acético de 0,1 M.
8. Incubar cada folha lavada com 1 mL de solução TCEP em um shaker em RT por 15 minutos.
9. Prepare as seguintes normas diluindo em série o estoque pepCD47 conjugado pela TAMRA (1 mg/mL) – 100 μg/mL, 10 μg/mL, 1 μg/mL, 0,1 μg/mL e 0,01 μg/mL. Use a solução TCEP como diluente.
10. Analise o pepCD47 conjugado por TAMRA liberado da superfície metálica contra a curva de calibração gerada utilizando os padrões por fluoremetria a 544/590 nm excitação e comprimentos de onda de emissão.

3. Anexando pepCD47 humano a superfícies modificadas PEI-PDT

1. Lave amostras revestidas PEI-PDT formuladas conforme descrito na seção 1, etapas 1.1-1.10 acima, com DDW 5x desgaseadas, alterem o frasco e lavem com DDW 5x desgassed.
2. Prepare a solução de estoque pepCD47 humana (1 mg/mL) dissolvendo o pó pepCD47 humano em ácido acético desgaseado de 50% para alcançar uma concentração de 1 mg/mL.
3. Prepare a concentração de trabalho do pepCD47 humano (100 μg/mL) dissolvendo 500 μL do estoque de pepCD47 humano em 4.500 μL de salina tamponada de fosfato desgaseada 1x (PBS).
4. Incubar as amostras revestidas PEI-PDT lavadas com 100 μg/mL de pepCD47 no RT com agitação por 1 h.
5. Lave as amostras revestidas de pepCD47 humanos para remover o excesso de peptídeos na seguinte ordem PBS (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, 5 min cada), DDW (3x), frascos de mudança e lavagem final de DDW.
   NOTA: Superfícies revestidas de pepCD47 humanos podem ser armazenadas secas a 4 °C por até 6 meses.

4. Revestindo as superfícies modificadas PEI-PDT com sequência mexida (Scr)

1. Dissolva o pó de sequência mexida em ácido acético desgaseado de 0,1% para preparar uma solução de estoque de 1 mg/mL.
2. Prepare uma solução de 100 μg/mL de peptídeo mexido dissolvendo 500 μL do em 4.500 μL de ácido acético desgassed 0,1%.
3. Cubra os espécimes PEI-PDT lavados com 100 μg/mL de peptídeo mexido em RT com agitação por 1 h.
4. Para remover peptídeo mexido não ligado, lave as superfícies na seguinte ordem 0,01% de ácido acético (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, 5 min), DDW (3x), frascos de mudança e uma lavagem DDW.

5. Loop chandler para analisar o apego celular a superfícies metálicas

1. Cubra as folhas metálicas (0,65 cm x 1cm) com pepCD47 humano ou peptídeo mexido conforme a descrição na seção 1 seguida de 3 ou 4.
2. Corte tubos de PVC de 1/4" em três pedaços de 38 cm de comprimento.
3. Insira até 8 peptídeos não modificados ou pepCD47 em três tubos diferentes.
4. Coletar 30 mL de sangue de doadores humanos saudáveis livres de quaisquer medicamentos anti platelet, de acordo com o protocolo institucional do IRB. Seringa pré-carga com 1 mL de 4% de citrato de sódio para evitar coagulação de sangue coletado.
5. Coloque 10 mL de sangue em cada tubo usando uma seringa de 10 mL e conecte as extremidades com adaptadores metálicos. Coloque os tubos cheios de sangue nas rodas do aparelho de loop chandler.
6. Passe o sangue ao longo das folhas metálicas por rotação da roda a 37 °C na velocidade calculada para produzir a tesoura de 25 dyns/cm² por 4h.
7. Drene o sangue dos tubos e elimine o sangue de acordo com os requisitos do IRB.
8. Corte os tubos usando o bisturi para recuperar as folhas de cada tubo.
9. Prepare 2% de solução de glutaraldeído diluindo os 10 ml de solução de glutaraldeído de 4% utilizando 10 mL de tampão de cacodilato de sódio com cloreto de sódio de 0,1 M.
10. Incubar as folhas em solução de glutaraldeído de 2% por 15 min e armazenar a 4 °C durante a noite. Antes de analisar, lave as folhas metálicas 3x com PBS.

6. Analisando o apego celular às superfícies metálicas usando corante CFDA

1. Aqueça 8 mL de PBS em tubo de 15 mL em um banho de água definido para 37 °C.
2. Prepare a solução de corante CFDA (carboxy-fluorescein diacetate, éster succinimidyl) da seguinte forma - adicione 90 μL de DMSO a um frasco de corante CFDA para alcançar uma concentração de estoque de 10 mM. Em seguida, prepare a concentração de trabalho de 93,75 μM adicionando 75 μL do estoque CFDA a 8 mL de PBS quente. Misture invertendo os tubos algumas vezes e cubra o tubo com papel alumínio.
   NOTA: É aconselhável preparar recentemente o corante CFDA antes de cada uso.
3. Incubar cada folha com 1 mL de corante CFDA em uma placa de 24 poços. Cubra a placa com papel alumínio e incubar a placa a 37 °C por 15 min.
4. Lave as folhas metálicas 3x com PBS para remover o excesso de corante. Imagem usando o microscópio de fluorescência invertida.

7. Fixação monócito e expansão de macrófagos nas superfícies metálicas modificadas e nuas e modificadas pepCD47

1. Colete 10 mL de sangue periférico através do acesso vena cava durante o sacrifício de um rato Sprague-Dawley masculino de 400-450 g. Misture imediatamente com 1.000 UI de heparina de sódio para evitar a coagulação.
2. Pipeta 10 mL de gradiente de densidade em um tubo cônico de 50 mL. Misture o sangue com 5 mL de PBS, e cuidadosamente camada de sangue diluído sobre o meio gradiente de densidade usando uma pipeta Pasteur. Centrifugar em um rotor de balde balançando a 800 x g e 18-25 °C por 20 min com configurações mínimas de aceleração e desaceleração.
3. Usando uma pipeta Pasteur, colete uma camada opaca de casaco buffy na interface entre plasma e Ficoll. Reveste de buffy diluir 1:3 com PBS e centrífuga a 550 x g e 4 °C por 10 min para células de revestimento buffy.
4. Suspenda des suspenda as células do casaco buffy em 3 mL de tampão de lise ACK para lise contaminando eritrócitos. Incubar no gelo por 4 minutos. Adicionar 12 mL de tampão de separação celular (CSB; 0,5% BSA, 0,5% FBS, 2 mM EDTA/PBS).
5. Centrifugar a 550 x g e 4 °C por 10 min. Suspenda a pelota em 10 mL de CSB.
6. Centrifugar a 200 x g e 4 °C por 10 min para eliminar plaquetas. Repita duas vezes.
7. Suspenda a pelota em 500 μL de CSB. Adicione 10 μg de cada um dos seguintes anticorpos anti-rato do mouse: CD8a (clone OX-8), anti-CD5 (clone OX-19), anti-CD45RA (clone OX-33) e anti-CD6 (clone OX-52).
8. Incubar a 4 °C em uma rotadora vertical por 1 h. Adicione 9,5 mL de CSB. Centrifugar a 300 x g e 4 °C por 10 min. Descarte o supernasce, suspenda a pelota em 10 mL de CSB e repita a centrifugação.
9. Suspenda a pelota em 500 μL de CSB. Adicione 150 μL de microesferas IgG anti-rato de cabra. Incubar a 4 °C em uma rotadora vertical por 20 min. Adicione 9,5 mL de CSB. Centrifugar a 300 x g e 4 °C por 10 min.
10. Descarte o supernaspeso. Suspenda a pelota em 1 mL de CSB.
11. Coloque uma coluna LS em um separador magnético.  Prime a coluna LS com 3 mL de CSB. Descarte o rendimento da coluna. Adicione 1 mL de pelota de célula suspensa da etapa 7.10. Comece a coletar o throughput. Após o fluxo parar, adicione 5 mL de CSB e continue coletando o throughput da coluna até que o fluxo pare.
12. Centrifugar o rendimento da coluna (6 mL) contendo monócitos selecionados negativamente a 300 x g e 4 °C por 10 min. Suspenda a pequena pelota resultante em 2 mL de RPMI-1640 médio suplementado com 10% de FCS, 1% caneta/estreptococo e 100 ng/mL fator estimulante da colônia de ratos de rato (M-CSF).
13. Conte os monócitos usando hemócito. Ajuste a concentração de monócitos para 5 x 10⁵ células/mL.
14. Adicione 1 mL de volumes de suspensão de monócito aos poços individuais de uma placa de 12 poços com as amostras de papel alumínio inoxidável (N=3) ou amostras de aço inoxidável modificadas com pepCD47 (N=3) de 1,1-1,10 e 3,1-3,6.
15. Troque o meio nos dias 3 e 5 pós-semeadura. No dia 6, lave as células com PBS e fixe com 4% de paraformaldeído à temperatura ambiente por 15 minutos. Lave duas vezes com PBS por 5 minutos.
16. Remova as folhas de aço inoxidável e coloque-as individualmente em uma nova placa de 12 poços. Não vire as folhas.
17. Incubar em 0,5% Tween-20/PBS por 15 min para permeabiliizar as células. Lave duas vezes com PBS por 5 minutos.
18. Bloqueie em 10% soro de cabra/PBS por 20 min. Aspire o soro. Não lave. Adicione anticorpo cd68 anti-rato do mouse (diluído 1:100 em 1%BSA/PBS). Incubar em temperatura ambiente por 1h. Lave 3x em PBS por 5 min cada.
19. Adicione o anti-mouse de cabra IgG Alexa Fluor 546 (diluído 1:200 em 1% BSA/PBS). Incubar no escuro à temperatura ambiente por 45 minutos. Lave na PBS por 5 minutos. Contra-mancha com 1 μg/mL Hoechst 33342 corante no escuro à temperatura ambiente por 10 minutos. Lave 3x em PBS por 5 min cada.
20. Vire as folhas e a imagem usando um microscópio fluorescente com a óptica invertida. Capture imagens em ampliação de 200x com configurações de filtro azul e vermelho.
21. Conte os monócitos anexados nas imagens individuais e calcule as médias do grupo e os desvios padrão.

Resultados

As superfícies metálicas são renderizadas thiol-reativas para fixação de peptídeos através de uma série de modificações químicas, conforme ilustrado na Figura 1. A incubação pabt seguida pelo tratamento PEI-PDT torna a superfície metálica favorável ao acessório de peptídeo. Peptídeo CD47 (pepCD47) contendo resíduo de cisteína no C-terminus juntou-se à sequência pepCD47 do núcleo através de uma ponte AEEAc dupla flexível é covalentemente anexada às superfícies de ...

Discussão

Demonstramos e descrevemos uma estratégia química relativamente nova para anexar moieties de peptídeos terapêuticos a uma superfície de aço inoxidável com o objetivo abrangente de reduzir a reatividade da superfície com células inflamatórias encontradas no sangue. A química de bisfosfonato aqui descrita envolve a formação de vínculos coordenados entre os óxidos metálicos e os grupos de bisfosfonato de PABT. A espessura da monocamada de polifosfosfonato formada na superfície metálica não excede 5 nm

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCL	Invitrogen	15567-027	pH - 7.5
4% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16539-07
4% Sodium Citrate	Sigma	S5770
ACK lysing buffer	Quality Biologicals	118-156-721
anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)	Biolegend	202301
anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)	Biolegend	203501
anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52)	BD Biosciences	550979
anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1)	BioRad	MCA341
anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8)	Biolegend	201701
Chloroform Certified ACS	Fisher Chemical	C298-500
Dimethyl Formammide (DMF)	Alfa Aesar	39117
Embra stainless steel grid	Electron Microscopy Sciences	E200-SS	stainless steel mesh mesh disks
Ficoll Hypaque	GE Healthcare	17-1440-02
Glacial acetic acid	ACROS organic	148930025
goat anti-mouse IgG Alexa Fluor	ThermoFisher	A11030
Heparin sodium	Sagent Pharmaceuticals	402-01
Human pepCD47	Bachem	4099101
Isopropanol	Fisher Chemical	A426P-4
Metal adapters	Leur Fitting	6515IND	1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end
Methanol	RICCA chemical company	4829-32
Microscope	Nikon Eclipse	TE300
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	14190-136
Pottasium Bicarbonate (KHCO3)	Fisher Chemical	P184-500
PVC tubes	Terumo-CVS	60050	1/4" X 1/16 8'
sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride	Electron Microscopy Sciences	11653
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Bio-Rad laboratories	161-0302
Sodum actetate (C2H3NaO2)	Alfa Aesar	A13184
Src peptide	Bachem	4092599
Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen	Microgroup, Medway, MA	20097328	1 cm X 6 mm OD
Stainless steel foils (AISI 316L)	Goodfellow, Coraopolis, PA		100 mm X 100 mm X 0.05 mm
Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47)	Bachem	4100277
TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)	Thermo Scientific	PG82089
Tween-20	Bio-Rad laboratories	170-6531
Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit	Invitrogen	V12883