Entrega intramiocárdica atrasada de células-tronco após lesão de reperfusão de Isquemia em um modelo murino

Resumo

As células-hastes são continuamente investigadas como tratamentos potenciais para indivíduos com danos do miocárdio, no entanto, sua diminuição da viabilidade e retenção dentro do tecido lesionado pode afetar sua eficácia a longo prazo. Neste manuscrito descrevemos um método alternativo para a entrega de células-tronco em um modelo murino de lesão de reperfusão de isquemia.

Resumo

Há um interesse significativo no uso de células-tronco (SCs) para a recuperação da função cardíaca em indivíduos com lesões do miocárdio. Mais comumente, a terapia de células-tronco cardíacas é estudada através do parto de SCs simultaneamente com a indução de lesão miocárdia. No entanto, essa abordagem apresenta duas limitações significativas: o ambiente isquêmico pró-inflamatório hostil precoce pode afetar a sobrevivência de SCs transplantadas, e não representa o cenário de infarto subagutado onde as SCs provavelmente serão utilizadas. Aqui descrevemos uma série de dois procedimentos cirúrgicos para a indução de lesão de isquemia-reperfusão e entrega de células-tronco mesenquimais (MSCs). Este método de administração de células-tronco pode permitir a maior viabilidade e retenção em torno do tecido danificado, contornando a resposta imune inicial. Um modelo de lesão de reperfusão de isquemia foi induzido em camundongos acompanhados da entrega de células-tronco mesenquimais (3,0 x 10⁵), expressando com estoquá-lo sob o promotor de CMV expresso constitutivamente, intramiocardialmente 7 dias depois. Os animais foram imagens por ultrassom e bioluminescente para confirmação de lesão e injeção de células, respectivamente. É importante ressaltar que não houve taxa adicional de complicação ao realizar essa abordagem de dois procedimentos para o parto em SC. Este método de administração de células-tronco, coletivamente com a utilização de genes repórteres de última geração, pode permitir o estudo in vivo de viabilidade e retenção de SCs transplantados em uma situação de isquemia crônica comumente vista clinicamente, ao mesmo tempo em que contorna a resposta inicial pró-inflamatória. Em resumo, estabelecemos um protocolo para a entrega atrasada de células-tronco no miocárdio, que pode ser usado como uma nova abordagem potencial na promoção da regeneração do tecido danificado.

Introdução

As doenças cardiovasculares continuam sendo a causa mais comum de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Eventos isquêmicos cardíacos têm sido prejudiciais para a função geral do miocárdio e células circundantes¹. Apenas 0,45-1,0% dos cardiomiócitos se regenerarão a cada ano após a ocorrência de danos no miocárdio². Apesar da crescente demanda e do foco inerente no desenvolvimento de tratamentos, as terapias que auxiliam na regeneração do tecido lesionado têm sido difíceis de estabelecer e ainda requerem maior otimização^3,4,5. As terapias com células-tronco foram introduzidas como um caminho alternativo para rejuvenescer o tecido danificado após um evento isquêmico; no entanto, o avanço dessas terapias tem sido desafiado pela sobrevivência limitada e retenção das células para uma área ferida⁶.

O microambiente do coração após um evento isquêmico pode ser caracterizado como hipoxico, pró-oxidante e pró-inflamatório, apresentando condições hostis para células-tronco terapêuticas se adaptarem à sobrevivência^7,,8. Como uma resposta imune é desencadeada após lesões, linfócitos ingênuos, macrófagos, neutrófilos e células de mastro tentam reparar o dano removendo células moribundas e modulando o processo de remodelação tecidual^9,,10,,11. Nos primeiros 3 dias pós-isquemia, a inflamação está no seu auge com a liberação de citocinas pró-inflamatórias com alto número de neutrófilos e monócitos na área^10,12. Após 7 dias, grande parte da inflamação diminuiu e a transição para células reparados começa, continuando até que a cascata remodelante esteja completa, aproximadamente 14 dias em camundongos¹³. Nosso método cirúrgico é uma abordagem alternativa potencial para a introdução de biológicos no miocárdio para contornar o pico de resposta imune inata após lesão de reperfusão de isquemia. Ao mesmo tempo, permitirá o estudo de quaisquer tratamentos em condição de isquemia subacute/crônica onde possa haver diferentes variáveis a considerar em comparação com o infarto agudo do miocárdio.

Protocolo

Os experimentos foram realizados em camundongos C57BL/6 femininos, idade de 10-12 semanas e 20-25 g de peso corporal. Todos os procedimentos animais cumpriram as normas indicadas no Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Institute of Laboratory Animal Resources, National Academy of Sciences, Bethesda, MD, USA) e foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso Institucional de Animais (IACUC) da Mayo Clinic College of Medicine.

1. Preparação e entubação

1. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia. Se várias cirurgias forem realizadas em uma sessão, limpe os instrumentos após cada animal e reesterirei usando um esterilizador de contas quentes.
2. Anestesia os camundongos com 3,5-4% de isoflurano a 1 L/min O₂ em uma câmara de indução.
3. Administre Buprenorfina SR 1 mg/kg (analgésico) subcutâneo, pese o animal e insira o peso no ventilador.
4. Raspe o lado esquerdo do peito do esterno até o nível do ombro e aplique creme depilatório para remover o excesso de pele.
5. Para o procedimento de reperfusão da isquemia mantenha a pressão final-expiratória positiva (PEEP) no ventilador a 2 cmH₂O. Para a injeção retardada do procedimento de células mude o PEEP para 3 cmH₂O para evitar o colapso pulmonar.
6. Entubar o animal usando um tubo endotraqueal de 20 G, transfira para uma almofada de aquecimento controlada para manter uma temperatura corporal de 35-37 °C.
7. Coloque o mouse sobre um ventilador em recumbência lateral com extremidade craniana à esquerda e caudal na direita.
8. Mantenha a anestesia em 2-2,5% de isoflurane a 1 L/min O₂ para o restante do procedimento.
9. Esfregue a área cirúrgica alternando entre cotonetes de povidona-iodo e álcool três vezes e aplique pomada oftálmica em ambos os olhos.

2. Lesão de reperfusão de isquemia

1. Usando um bisturi de lâmina #10 faça uma incisão vertical de 2,5 mm para a direita do mamilo mais à esquerda no campo de visão.
2. Usando uma tesoura corta as camadas musculares superficiais até que os músculos intercostais e costelas sejam visíveis.
3. Enquanto levanta as costelas e o tecido circundante, corte o espaço intercostal entre as costelas 4 e 5, em seguida, insira o retrátil das pálpebras no espaço aberto.
4. Retraia o pericárdio usando fórceps curvos, movendo o pulmão para cima e para fora da vista.
5. Visualize a artéria LAD e, usando uma sutura de nylon 9-0, passe pelo miocárdio sob a artéria 2,5 mm distal até a aurícula esquerda e amarre um nó quadrado solto.
6. Corte 1 cm de tubos de polietileno e coloque-o dentro do nó solto.
7. Fixar a sutura ao redor da tubulação, confirmar isquemia e depois soltar após 35 min.
   NOTA: Confirme a isquemia por palidez e arritmia ventricular.
8. Depois de liberar a ligadura e remover a tubulação, espere 5 minutos para confirmar a reperfusão do miocárdio.
9. Coloque um tubo de cateter intravenoso de 24 G I.V. na cavidade torácica um espaço intercostal à direita da abertura.
10. Feche a incisão intercostal com uma sutura absorvível de 6-0 em um padrão simples interrompido.
11. Feche a camada muscular com uma sutura absorvível de 6-0 em um padrão de sutura contínua.
12. Após fechar a camada muscular superficial, remova o tubo torácico enquanto retira o ar da cavidade torácica usando uma seringa tuberculina de 1 mL.
13. Feche a incisão da pele com uma sutura absorvível de 6-0 em um padrão de colchão horizontal contínuo
    NOTA: Suturas de nylon e um padrão de sutura descontínua também podem ser usados para a camada de pele.
14. Administre 1,5 mL de soro fisiológico quente subcutâneamente e aplique pomada com antibiótico triplo no local de incisão para prevenir a infecção.
15. Desligue isoflurane e deixe o animal respirar através do ventilador em 100% O₂ até que possa respirar continuamente sem ajuda.
16. Transfira o mouse para uma gaiola sem roupa de cama ou para uma gaiola com roupa de cama coberta (papel toalha ou cortina) em uma almofada quente com uma temperatura de 35-37 °C até que esteja totalmente recuperada.

3. Entrega de células-tronco mesenquimais do rato

NOTA: A variedade de camundongos utilizados para o procedimento é uma linha de raça e são considerados geneticamente idênticos. As células-tronco mesenquimais foram obtidas de animais da mesma cepa e, pelo projeto do protocolo, a imunossupressão não foi induzida¹.

1. Complete as etapas de preparação e entubação, conforme feito anteriormente para o primeiro procedimento.
2. Remova a sutura da camada da pele usando tesouras e fórceps.
3. Com um bisturi #10, faça uma incisão no mesmo local da cirurgia anterior.
4. Continue a usar o bisturi para cortar o tecido cicatricial até que a sutura da camada muscular seja visível
5. Usando a tesoura e fórceps, remova a sutura e corte a camada muscular aberta.
6. Visualize e remova as suturas segurando as costelas juntas e continue cortando o músculo intercostal da incisão anterior.
   NOTA: Os pulmões podem ter aderido à parede torácica, se isso ocorrer, usar fórceps bruscos ou curvos para separá-los cuidadosamente e soltá-los.
7. Coloque o retrátil das pálpebras no espaço intercostal e localize a área da ligadura anterior.
8. Carregue as células-tronco mesenquimais (3.0 x 10^5),suspensas em 20 μL PBS, em uma seringa de insulina de 30 G, dobre a agulha ligeiramente conforme necessário para o ângulo adequado para injetar.
   NOTA: As células-tronco mesenquimais (MSCs) foram isoladas do tecido adiposo de 4-6 semanas de idade C56BL/6 camundongos. As células de passagem precoce (p3) foram transduzidas com um vetor expressando o gene da luciferase de vagalume sob o promotor do CMV para permitir o monitoramento da viabilidade celular in vivo. O MSC do camundongo derivado do adiposo foi caracterizado pela citometria de fluxo e as células foram positivas para CD44, CD29, CD90 e CD105, mas negativas para o marcador hematopoiético CD45¹⁴. Antes da injeção, os MSCs foram cultivados por pelo menos uma passagem para evitar a perda de células do processo de descongelamento.
9. Movendo-se na direção do ápice em direção à base do coração insira a seringa na região peri-infarto até que a abertura da agulha esteja completamente dentro do miocárdio.
10. Uma vez dentro injete lentamente as células no miocárdio, espere 3 s e, em seguida, remova a agulha.
11. Observe o coração de perto por 3 minutos para ter certeza de nenhuma reação anormal às células, como fibrilação ventricular.
12. Coloque um tubo de cateter de 24 G IV na cavidade torácica um espaço intercostal à direita da abertura.
13. Feche as camadas intercostal, muscular e de pele e remova o tubo torácico no mesmo método do primeiro procedimento.
14. Administre 1,5 mL de soro fisiológico quente subcutâneamente e aplique pomada com antibiótico triplo no local de incisão para prevenir a infecção.
15. Desligue isoflurane e deixe o animal respirar através do ventilador em 100% O₂ até que ele seja capaz de respirar continuamente sem ajuda.
16. Transfira o mouse para uma gaiola sem roupa de cama ou para uma gaiola com roupa de cama coberta (papel toalha ou cortina) em uma almofada quente com uma temperatura de 35-37 °C até que esteja totalmente recuperada.

4. Cuidados pós-operatórios seguindo ambos os procedimentos

1. Observe o animal continuamente até que a respiração espontânea, a recumência severa e o movimento normal se estabeleçam.
2. Continue a observação a cada 15-30 min por pelo menos 3 h no dia da cirurgia.
3. Verifique os camundongos se há deshiscência ou dor anormal uma vez por dia durante 5 dias, depois 2-3 vezes por semana.
4. Se o animal apresentar sinais de dor (ou seja, costas arqueadas, movimento mínimo, grimacing ou pele desajeitada) após 72 h de pós-operatório, forneça uma dose adicional do analgésico Buprenorphine SR.

Resultados

A lesão de reperfusão de isquemia foi induzida em camundongos no dia 0, seguida de um ecocardiograma pós-operatório e eletrocardiograma no dia anterior à implantação de células-tronco. A análise de ultrassom e eletrocardiograma confirmou o infarto e diminuiu a função contratil ventricular(Figura 1A-D). Um exame mais aprofundado dos dados mostrou que a fração de ejeção e o encurtamento fracionado foram diminuídos em camundongos que receberam lesão isquêmica,...

Discussão

Mais de 85 milhões de pessoas em todo o mundo são afetadas por doenças cardiovasculares³. A alta prevalência desses eventos isquêmicos garante o desenvolvimento e a expansão de terapias alternativas para promover a regeneração do tecido danificado. Os métodos tradicionais utilizam o procedimento de reperfusão da isquemia em um ambiente agudo com posterior administração terapêutica¹. As reações inflamatórias estão no seu auge entre 3 e 4 dias após um evento...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% NaCl Irrigation, USP	Baxter	0338-0048-04
11x12" Press n' Seal surgical drape, autoclavable	SAI Infusion Technologies	PSS-SD
24G 3/4" IV catheter tube	Jelco	4053
28G x 1/2" 1mL allergy syringe	BD	305500	Injection of analgesic
30G x 1/2" 3/10cc insulin syringe	Ulticare	08222.0933.56	Injection of stem cells
6-0 S-29, 12" Vicryl suture	Ethicon	J556G	Intercostal, superficial muscle and skin layer incision closure
9-0 BV100-4, 5" Ethilon suture	Ethicon	2829G	Ligation of the LAD artery
Absorbent underpad	Thermo Fischer Scientific	14-206-64	For underneath the animal
Alcohol prep pads, 2 ply, medium	Coviden	6818
Anti-fog face mask	Halyard	49235
Bonn Strabismus scissors, curved, blunt	Fine Science Tools	14085-09
Buprenorphine HCL SR LAB 1mg/ml, 5 ml	ZooPharm Pharmacy		Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hours duration of activity).
Castroviejo needle holders, curved	Fine Science Tools	12061-01
Curity sterile gauze sponges	Coviden	397310
Delicate suture tying forceps, 45 angle bent	Fine Science Tools	11063-07
Electric Razor	Wahl		Fur removal
Isoflurane 100 ml	Cardinal Health	PI23238	Anesthetic
Lab coat
Monoject 1 mL hypodermic syringe	Coviden	8881501400
Moria iris forceps, curved, serrated (x2)	Fine Science Tools	11370-31
Moria speculum retractor	Fine Science Tools	17370-53
Mouse endotracheal intubation kit	Kent Scientific
Nair depilatory cream	Johnson & Johnson		Fur removal
Optixcare eye lube plus	Aventix		Sterile ocular lubricant
Physiosuite ventilator	Kent Scientific
PolyE Polyethylene tubing	Harvard Apparatus	72-0191	Temporary compression of LAD artery
Povidone-iodine swabs	PDI	S41125
Scalpel, 10-blade	Bard-Parker	371610
Sterile 3" cotton tipped applicators	Cardinal Health	C15055-003
Sterile 6" tapered cotton tip applicators	Puritan	25-826-5WC
Sterile gloves	Cardinal Health	N8830
Sterilization pouches	Medline	MPP100525GS
Surgery cap
Surgical Microscope	Leica	M125
Suture tying forceps, straight (x2)	Fine Science Tools	10825-10
Transpore surgical tape	3M	1527-1
Triple antibiotic ointment	G&W Laboratories	11-2683ILNC2	Topical application to prevent infection
Vannas-Tübingen Spring Scissors, curved	Fine Science Tools	15004-08
Vetflo vaporizer	Kent Scientific