Imagem celular ao vivo super-resolução de estruturas subcelulares

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para imagens de células vivas de super-resolução em tecido intacto. Nós padronizamos as condições para a imagem de uma população de células-tronco adultas altamente sensíveis em seu ambiente de tecido nativo. Esta técnica envolve o equilíbrio da resolução temporal e espacial para permitir a observação direta de fenômenos biológicos no tecido vivo.

Resumo

Há muito tempo há uma troca crucial entre a resolução espacial e temporal na imagem. Imagens além do limite de difração de luz têm sido tradicionalmente restritas a serem usadas apenas em amostras fixas ou células vivas fora do tecido rotulado com forte sinal fluorescente. As técnicas atuais de imagem de células vivas de super-resolução exigem o uso de sondas especiais de fluorescência, alta iluminação, múltiplas aquisições de imagens com processamento pós-aquisição ou muitas vezes uma combinação desses processos. Esses pré-requisitos limitam significativamente as amostras biológicas e contextos aos os que essa técnica pode ser aplicada.

Aqui descrevemos um método para executar a super-resolução (~140 nm XY-resolução) fluorescência de fluorescência de fluorescência ao vivo de imagem em si. Esta técnica também é compatível com baixa intensidade fluorescente, por exemplo, EGFP ou mCherry etiquetada em genes humildemente expressos. Como prova de princípio, usamos este método para visualizar múltiplas estruturas subcelulares no teste de Drosophila. Durante a preparação tecidual, tanto a estrutura celular quanto a morfologia tecidual são mantidas dentro dos testíficos dissecados. Aqui, usamos essa técnica para a dinâmica dos microtúbulos de imagem, as interações entre microtúbulos e a membrana nuclear, bem como a fixação de microtúbulos aos centromeres.

Esta técnica requer procedimentos especiais na preparação da amostra, montagem de amostras e imobilização de amostras. Além disso, os espécimes devem ser mantidos por várias horas após a dissecção sem comprometer a função e a atividade celular. Embora tenhamos otimizado as condições para imagens de super resolução viva especificamente em células-tronco germinais machos Drosophila (GSCs) e células germinativas progenitoras em tecido de testíase dissecado, esta técnica é amplamente aplicável a uma variedade de diferentes tipos de células. A capacidade de observar células sob suas condições fisiológicas sem sacrificar resolução espacial ou temporal servirá como uma ferramenta inestimável para pesquisadores que buscam abordar questões cruciais na biologia celular.

Introdução

Visualizar estruturas subcelulares e dinâmicas proteicas em células vivas com resolução além do limite de difração de luz é tipicamente muito desafiador^1-3. Enquanto várias técnicas de super-resolução como A Microscopia Estocástica-Óptica-Reconstrução (STORM), Foto-Ativada-Localização-Microscopia (PALM) e Esgotamento de Emissões Estimuladas (STED)^4,5,6 microscopia foram desenvolvidas, complicações na preparação de amostras ao vivo, limitando o uso de microscopia de super resolução convencional para imagens ao vivo. A microscopia confocal convencional não pode alcançar a resolução espacial além da resolução XY de ~230 nm e muitas vezes é insuficiente para observar subestruturas celulares intrincadas^5,6. No entanto, um desenvolvimento recente em microscopia confocal, imagem de super-resolução airyscan, é capaz de alcançar aproximadamente 140 nm (resolução XY)^7,8 e tem uma preparação amostral relativamente simples que é compatível com imagens vivas. Uma vez que este sistema de detecção de imagens requer um longo tempo de aquisição, sua alta resolução espacial vem ao custo da resolução temporal⁹. Portanto, é necessário um método para garantir que a imagem de células vivas seja estendida com alta resolução espacial.

Aqui, desenvolvemos um método para observar células vivas em tecido intacto em sua resolução ideal para decifrar estruturas subcelulares com informações espaciais detalhadas. Este método é projetado como tal para que as amostras possam ser montadas de forma estável por um longo período de tempo (~ 10 h) sem se mover ou degenerar. A mídia de células vivas usada nesta técnica pode suportar a função celular e evitar fotobleaching por até 10 horas sob um microscópio de super resolução. Finalmente, este protocolo minimiza a maioria das tensões causadas pela iluminação constante de lasers ao longo de longos períodos de tempo, como hipóxia, mudanças na umidade e temperatura, bem como exaustão de nutrientes.

Utilizando este protocolo para imagem de células-tronco germinais machos Drosophila (GSCs), pudemos observar como a atividade assimétrica dos microtúbulos permite a interação preferencial com cromátides irmãs epigenéticamente distintas^10,11,12,13. Esses tipos de eventos celulares são altamente dinâmicos e são muito difíceis de visualizar em células vivas usando outros métodos de imagem de super-resolução, como STORM, PALM ou STED. Prevemos que esse método se tornará altamente útil para os biólogos celulares, pois eles visam entender as estruturas subcelulares dinâmicas das células vivas residentes em tecidos. Existem muitas áreas em que esse método pode ser aplicado, como estudar a dinâmica das proteínas; compreender o movimento das células; e rastreamento de linhagem e processos de diferenciação celular, entre outras possíveis aplicações.

Protocolo

1. Preparação de coquetel de imagem celular ao vivo (mídia celular ao vivo)

1. Suplemento O meio Drosophila de Schneider com 15% de soro bovino fetal (FBS) e penicilina/estreptomicina de 0,6x. Ajuste o pH para aproximadamente 7,0.
2. Pouco antes de usar o meio, adicione insulina a uma concentração final de 200 μg/mL.
   NOTA: Esta mídia é fundamental para manter a divisão celular normal e o desenvolvimento da testíase Drosophila durante a imagem de lapso de tempo^10,14.

2. Preparação de prato de cultura celular de fundo de vidro

1. Use um prato de cultura de célula de vidro revestido de poli L-lysine com um diâmetro de 35 mm para o teste de Drosophila. O poço interno do prato tem um fundo de vidro com diâmetro de 23 mm e um lado com uma elevação de 1 mm(Figura 1A-a).
   NOTA: Escolha um prato de fundo de vidro que permita uma distância de trabalho mais curta, maior abertura numérica e maior objetivo de ampliação; esses recursos são cruciais para obter uma imagem de super resolução.
2. Use uma membrana de diálise (MWCO: 12-14kD) que permite a troca gasosa. Corte a membrana em pequenos pedaços.
   NOTA: As peças de membrana devem ser menores que a área de vidro do prato, mas grandes o suficiente para cobrir o espécime.
3. Mergulhe a membrana com 100 μL de mídia celular ao vivo por ~5 min. Não use uma membrana seca na amostra, pois pode danificá-la. A membrana ajuda a prevenir o estresse hipóxico.
4. Prepare 2-3 peças de vidro leve ou plástico para colocar na membrana para que o tecido não flutue. Para fazer isso, primeiro pegue o anel externo do tubo centrífuga de 50 mL e corte-o em pequenos pedaços. Em seguida, esterilize as peças com 70% de etanol antes de usar.
   NOTA: Esta etapa garante que a amostra permaneça na superfície durante a imagem e não flutue, o que é crucial para obter resultados ideais.
5. Prepare um anel de ~25 mm de diâmetro e coloque-o no lado elevado do prato. Coloque uma mancha nele para gerar duas câmaras. A câmara inferior conterá a amostra, enquanto a câmara superior servirá como uma câmara de umidade para evitar que a amostra seque.
   1. Para fazer este anel, corte o anel externo de um tubo centrífuga de 50 mL, o que permitirá que ele se encaixe firmemente no lado elevado da antena de 35 mm. Um anel semelhante pode ser feito de outras formas, por exemplo, usando um elástico ou uma gravata de plástico para caber no lado elevado do prato para segurar corretamente a mancha sem interferir na amostra.
      NOTA: Este passo é crítico, especialmente para amostras sensíveis a estresses como condições hipóxiis, e mudanças de temperatura e umidade.

3. Dissecção de testículos de moscas machos e montagem

1. Pegue ~10 jovens moscas machos (2-3 dias de idade) e disseca os testículos na mídia de células vivas para obter ~10 pares de testículos adultos Drosophila.
   1. Dissecar as moscas sob um microscópio de dissecção em um prato de dissecção usando fórceps finos.
      NOTA: A cepa Drosophila melanogaster (mosca-das-frutas) carrega transgene UAS-α-Tubulin-GFP conduzido por um driver de células germinativas primitivas nanos-Gal4.
   2. Gere as seguintes cepas de melanogaster de Drosophila usando a tecnologia CRISPR-Cas9: Lamin-mCherry (tag terminal C) e CENP-A-Dendra2-CENP-A [tag no local interno (entre 118º e 119º codon)].
      NOTA: Embora apenas um testíase de excelente qualidade seja necessário para cada experimento, a montagem de um número suficiente de tecidos (15-20) ou células garantirá que haverá pelo menos uma amostra saudável com excelentes sinais de fluorescência para imagens de lapso de tempo.
2. Lave os testículos duas vezes na mídia celular ao vivo no prato de dissecção.
   1. Use uma pipeta para adicionar mídia seguida removendo a mídia de células ao vivo como um passo de lavagem.
   2. Remova o excesso de tecido usando fórceps. Qualquer tecido extra interferirá com a imagem.
      NOTA: Não use soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) para lavagem, pois pode afetar a dinâmica de certos componentes celulares.
3. Adicione 100-150 μL de mídia de célula ao vivo no prato (preparado na etapa 2.1) e espalhe-o na superfície do vidro usando uma ponta de pipeta. A disseminação da mídia na superfície permitirá que o tecido grude adequadamente no prato.
4. Transfira os testículos para o prato usando fórceps finos e leve-os para o centro do prato (Figura 1A-b).
   NOTA: Evite transferir detritos porque vai interferir com a imagem e pode reduzir a qualidade da imagem.
5. Remova o excesso de mídia celular ao vivo (deixe aproximadamente 10 μL de mídia) para permitir que o tecido se achate e grude corretamente no prato. Execute esta etapa rapidamente para evitar secar a amostra.
6. Coloque a membrana pré-úmida (preparada na etapa 2.2 e 2.3) em cima dos testículos(Figura 1A-c).
7. Coloque 2-3 pequenos pesos plásticos (preparados na etapa 2.4) na membrana para que a amostra não flutue e adicione rapidamente 100-150 μL de mídia celular ao vivo(Figura 1A-d).
   NOTA: Adicionar mídia de forma rápida e suave garante que a amostra não seque ou se desaloja.
8. Coloque o anel de plástico (preparado na etapa 2.5) no lado elevado do prato(Figura 1B-a).
9. Coloque uma tampa de 22 mm x 22 mm na parte superior do anel(Figura 1B-b). Isso gera duas câmaras.
10. Pegue um pedaço de papel de tecido, umedeça-o com água, depois gire-o e coloque-o na tampa, para criar uma câmara úmida(Figura 1B-c). Feche a tampa do prato(Figura 1B-d) e comece a imagem de células vivas.
    NOTA: Se a amostra estiver sensível à luz, realize a seção 3 no escuro.

4. Imagem celular viva de células-tronco germinais machos Drosophila (GSC) in situ

1. Coloque o prato sob o microscópio de super resolução e fixe-o com os grampos de palco.
   1. Abra o software de imagem, ligue a luz transmitida e use 63x objetivo para focar no tecido testíase com o botão de foco.
      NOTA: Se houver dificuldade em localizar uma amostra com o objetivo de 63x, primeiro use o objetivo de 40x ou 20x antes de mudar para o 63x.
   2. Ligue os lasers, clique em Livee encontre o GSC com a posição e condição ideais. Evite testículos que tenham um sinal de baixa fluorescência ou tenham o hub (nicho) longe da superfície.
      NOTA: Em testículos de Drosophila, os GSCs são anexados ao hub.
2. Ajuste o foco para os GSCs e identifique as configurações certas para a amostra, incluindo energia laser, ganho de multiplicação de elétrons (EM), média e zoom para o modo Airyscan. Use as seguintes configurações como exemplo para testes de Drosophila expressando egfp marcado α-tubulina em células germinativas em estágio inicial.
   1. Defina o tamanho do quadro entre 512 x 512 pixels e 1024 x 1024 pixels clicando no Tamanho do Quadro.
   2. Defina a média do quadro para 1 ou 2 clicando em Média.
      NOTA: Aumentar o tamanho do quadro (>1024 x 1024 pixels) e realizar mais média (ou seja, mais de 2) pode resultar em fotobleaching ou fototoxicidade.
   3. Defina a potência laser para 1%-2% clicando em Lasers.
      NOTA: Aumentar a potência do laser também pode levar a fotobleaching ou fototoxicidade.
   4. Defina o ganho EM abaixo do nível recomendado (< 800) clicando em Ganho Mestre.
      NOTA: Um maior ganho em em pode gerar artefatos.
   5. Amplie a região ou célula de interesse para reduzir o tempo de aquisição da imagem e reduzir o fotobleaching. Isso também permite que o espécime sobreviva por mais tempo.
3. Inicie a captura de imagem de lapso de tempo usando o modo Airyscan clicando em Iniciar Experimento.
   1. Antes de clicar em Iniciar Experimento,certifique-se de que a aquisição está configurada de forma ideal.
   2. Se ele exibir um aviso com o aviso "A aquisição airyscan não está configurada de forma ideal", clique em Ideal na seção tamanho do quadro, clique em Ótimo na seção z-stack e clique em Ideal para seção de área de varredura (um zoom mínimo de 1,3 é necessário para imagens de super resolução).
4. Otimize o intervalo de tempo, o número de fatias z e a duração da imagem de lapso de tempo de acordo com o desenho experimental e o tipo de espécime, de modo que a qualidade da imagem não seja comprometida e as células não sejam presas em estágios específicos do ciclo celular.
   1. Como exemplo, os parâmetros para a imagem de lapso de tempo de testículos de Drosophila expressando α-tubulina marcado por EGFP na linha germinal inicial são mostrados nas etapas seguintes.
   2. Para mais de 5h de imagem de lapso de tempo, imagem em um intervalo de 10 minutos com 1% de potência laser e tomar até 30 z-slices em cada ponto de tempo.
   3. Para processos celulares altamente dinâmicos, como a dinâmica dos microtúbulos, defina um intervalo de 2 minutos entre os pontos de tempo, realize imagens de 1-2 h de lapso de tempo a 1% de potência laser e leve até 30 z-slices em cada ponto de tempo.
   4. Para eventos celulares raros, como anafase à dinâmica de cromatina telophase precoce (eventos de 2-3 min), configure imagens de células vivas com um intervalo de 1 minuto entre os pontos de tempo, realize imagens de 30 minutos de lapso de tempo a 1% de potência laser e leve até 30 z-slices em cada ponto de tempo.
      NOTA: Esses parâmetros podem variar para diferentes amostras, por isso serão necessárias alterações para o uso ideal para a amostra específica.
5. Realize imagens de lapso de tempo ou imagens de instantâneos ao vivo, dependendo da sensibilidade da amostra e do design experimental.
   NOTA: Um curta-metragem tem de 15 a 30 minutos, e um filme longo é mais de 5 h.
6. Se a amostra for muito sensível e não puder ser estudada por imagens de lapso de tempo com um microscópio de super resolução, como é frequentemente o caso dos GSCs masculinos de Drosophila, realize um instantâneo vivo de super resolução (SRLS) da amostra em diferentes estágios de ciclo celular (como mostrado na Figura 2, Figura 3, Figura 4).
   1. Se um evento biológico de células raras está sendo capturado ou a proteína de interesse tem baixo nível de expressão, então realize o SRLS.
   2. Para SRLS, encontre uma célula no estágio específico do ciclo celular que você está interessado. Por exemplo, se focar na ligação microtúbulos-kinetochore, use uma célula em prometaphase ou metafase.
      NOTA: Isso ajudará a garantir que você obtenha uma imagem de alta qualidade da célula de interesse no momento certo sem arriscar a fototoxicidade para a amostra ou branqueamento dos fluoroforos, o que pode ocorrer durante um filme mais longo.
   3. Se usar SRLS, imagem diferentes estágios de ciclo celular de interesse em várias células e organizar essas imagens em ordem cronológica.
      NOTA: Isso pode ser usado para construir uma ordem temporal de eventos, maximizando a saúde do sinal e do tecido, para obter excelente resolução temporal do evento para amostras particularmente sensíveis ou com baixo sinal.

5. Processamento airyscan das imagens de células ao vivo

1. Após a aquisição de imagens com o software de imagem, selecione Processamento,clique em Batche selecione Processamento Airyscan.
   1. Selecione as imagens a serem processadas e clique em Executar/Processar para obter as imagens de super-resolução.
   2. Execute o processamento usando a configuração padrão.
      NOTA: O processamento airyscan só funcionará se as configurações de imagem forem devidamente estabelecidas para imagens airyscan.

Resultados

Imagens de células vivas além do limite de difração no tecido Drosophila, especialmente para GSCs, fornecem uma oportunidade para investigar a dinâmica dos eventos subcelulares no contexto da progressão do ciclo celular. Recentemente, um estudo utilizando esse protocolo mostrou que as atividades de microtúbulos no centro da mãe versus a filha são temporalmente assimétricas em GSCs¹⁰. O centro-casal materno emana microtúbulos aproximadamente 4 horas antes da entrada mitótica, e...

Discussão

Métodos de microscopia de super resolução fornecem resolução espacial de até 10s de nanômetros^4,5,6. Os métodos de microscopia STORM e PALM permitem resolução de até 20 a 50 nm (resolução XY), enquanto a microscopia STED oferece resolução de 20 a 100 nm (resolução XY). A resolução espacial da microscopia SIM é limitada a 100 a 130 nm¹⁵. No entanto, devido à sua alta densidade de fótons e ao longo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe Illustrator CS6 (figure making software)	Adobe	N/A
Dialysis membrane	Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane	Cat No. 08-67121
FBS	Thermo Fisher Scientific	Cat. no. 26140079	15% (V/V)
Fiji (analysis software)	NIH	N/A	Image fluorescence intensity quantification
Glass bottom cell culture dishes (FluroDish)	World Precision Instrument, Inc.	FD35PDL-100
Imaris (image reconstruction software)	Bitplane	N/A	3D image reconstruction
Imerssion oil	Zeiss	Immersol 518F/30 °C
Insulin	Sigma	Cat. No. 15550	200 µg/ml
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	Cat No. - 15140-122	0.6x
Schneider Drosophila media	Invitrogen	Cat No. - 11720-034
Spinning disc confocal microscope	Zeiss	N/A	equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA).
Tissue paper	Kimwipe	N/A	Wet to form humid chamber
LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module	Zeiss	N/A	equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA)
ZEN (imaging software)	Zeiss	N/A