Nanofios de Silício e Estimulação Óptica para Investigações de Acoplamento Elétrico Intra e Intercelular

Resumo

Este protocolo descreve o uso de nanofios de silício para bio modulação óptica intracelular de células em um método simples e fácil de executar. A técnica é altamente adaptável a diversos tipos de células e pode ser usada para aplicações in vitro e in vivo.

Resumo

Myofibroblasts pode internalizar espontaneamente nanofios de silício (SiNWs), tornando-os um alvo atraente para aplicações bioeletrônicas. Esses híbridos de silício celular oferecem capacidades de modulação óptica sem chumbo com perturbação mínima ao comportamento celular normal. As capacidades ópticas são obtidas pelas propriedades fototérmicas e fotoelétricas dos SiNWs. Esses híbridos podem ser colhidos usando técnicas padrão de cultura tecidual e, em seguida, aplicados a diferentes cenários biológicos. Demonstramos aqui como esses híbridos podem ser usados para estudar o acoplamento elétrico das células cardíacas e comparar como os miofibroblasts se casam uns com os outros ou com cardiomiócitos. Este processo pode ser realizado sem equipamento especial além de um microscópio fluorescente com linha laser acoplada. Também é mostrado o uso de uma rotina MATLAB personalizada que permite a quantificação da propagação de cálcio dentro e entre as diferentes células da cultura. Myofibroblasts são mostrados ter uma resposta elétrica mais lenta do que a de cardiomiócitos. Além disso, a propagação intercelular myofibroblast mostra velocidades ligeiramente mais lentas, embora comparáveis às suas velocidades intracelulares, sugerindo propagação passiva através de junções de lacunas ou nanotubos. Essa técnica é altamente adaptável e pode ser facilmente aplicada a outras arenas celulares, tanto para investigações in vitro quanto in vivo ou ex vivo.

Introdução

Todos os organismos biológicos usam eletricidade, na forma de íons, para regular o comportamento celular. As membranas celulares contêm vários tipos de canais de íons específicos permitindo o transporte passivo e ativo de íons. Esses íons regem as funções das células excitáveis, como atividade neuronal e contratude muscular esquelética e cardíaca. No entanto, a bioeletricidade também desempenha um papel importante em células não excitáveis, regendo muitas funções celulares como a proliferação celular¹, neuroimunidade^2,3,4, e diferenciação de células-tronco⁵.

Nas últimas décadas, o campo da bioeletricidade tem atraído um nível crescente de interesse, o que tem contribuído para o desenvolvimento de inúmeras tecnologias para interfaces bioeletrônicas. Pipetas de patch de microeletrodo são o padrão ouro de gravação intracelular e estimulação⁶. Nesta metodologia, uma pipeta de vidro é puxada em condições específicas para formar uma borda afiada com um tamanho de poros de poucos mícrons. Esta pipeta é preenchida com um tampão e a pipeta permite o contato direto do buffer com o volume intracelular. Isso resulta em uma interface bioelétrica que produz relações de sinal a ruídos extremamente altas, controle preciso sobre a atividade elétrica celular e resolução temporal extremamente alta. Embora essa metodologia seja uma ferramenta extremamente poderosa, que recentemente foi desescalada para uma configuração de nano-pipeta^7,está associada a várias limitações técnicas importantes. O efeito de diluição do citosol^8,bem como vibrações mecânicas, limita sua utilidade a interrogatórios de curto prazo, e requer equipamentos especializados caros e um alto nível de habilidade técnica. Além disso, sua volumosidade limita o número de células que podem ser registradas ou estimuladas simultaneamente, e devido à sua invasividade, não pode ser reconfigurada ao longo de um experimento. Para superar essas limitações, foram desenvolvidas matrizes de microeletrodos, mas o tamanho dos eletrodos limita a resolução espacial, bem como o acesso intracelular. As matrizes nanoeletríndulas permitem gravação e estimulação intracelulares, mas requerem eletroporação abrasiva para acessar o citosol^9,10. Além disso, todas essas metodologias são ligadas a substratos e, portanto, estão limitadas a culturas celulares in vitro, ou a células superficiais externas, sem acesso a células que estão dentro de um tecido tridimensional (3D).

A optogenética¹¹ é amplamente utilizada para lidar com essas limitações 3D e in vivo. No entanto, os métodos optogenéticos são baseados nas perturbações dos canais de íons de membrana plasmática ativados pela luz que são distribuídos na membrana plasmática, limitando a resolução espacial 3D¹² e as capacidades intracelulares.

Recentemente mostramos que os nanofios de silício (SiNWs) podem ser usados para realizar interrogatórios bioelétricos intracelulares com resolução espacial submicron com diferentes células não excitáveis, ou seja, miofibroblasts cardíacos e oligodenrócitos¹³. Além disso, usamos esses SiNWs para realizar interrogatórios específicos de células ex-vivo dentro de um tecido cardíaco 3D, para investigar como as células cardíacas se acoplam eletricamente in vivo¹⁴. Uma grande vantagem dessa metodologia é sua simplicidade; não requer qualquer modificação genética ou instrumentação volumosa. Muitas células internalizarão espontaneamente SiNWs foto-responsivos sem necessidade de sônica ou eletroporação¹⁵. Além disso, eles escaparão espontaneamente do encapsulamento endosomal e formarão uma integração perfeita com as organelas citosol e intracelular^13,15. Esses compostos célula-SiNWs, denominados híbridos de silício celular, possuem a natureza dinâmica, suave e versátil da célula original, bem como as capacidades optoelétricas dos SiNWs. Após a hibridização, o híbrido celular-SiNW pode ser colhido utilizando técnicas padrão de cultura tecidual e usado para diversas aplicações, como estimulação bioelétrica intracelular; estudar o acoplamento bioelétrico intercelular in vitro; e para interrogatório específico de célula in vivo. Como uma estimulação eficaz requer a co-localização de altas densidades de energia óptica e SiNWs, pode-se alcançar alta resolução espacial tanto em 2D quanto em 3D. Neste protocolo descrevemos detalhadamente a metodologia, bem como como os resultados podem ser analisados. O foco é colocado na investigação intra e intercelular in vitro, mas a implementação in vivo dessa metodologia pode ser utilizada diretamente para muitos outros cenários biológicos.

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Protocolo

Para garantir o cumprimento das normas éticas, todos os procedimentos animais relacionados à isolação de cardiomiócitos de corações de roedores foram aprovados pela Primeira Vez pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Chicago (IACUC). Além disso, todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com a orientação da Universidade de Chicago IACUC.

1. Preparação de híbridos de Células SiNWs

1. Isole os cardiomiócitos primários (CMs) utilizando um kit comercial seguindo as diretrizes do fabricante.
2. Prepare dMEM completo para isolamento celular primário suplementado com soro bovino fetal inativado 10%, 1% penicilina-estreptomicina e 1% L-glutamina.
3. Para isolar o miofibroblast (MFs) da suspensão MFs-CMs, pré-emplaque as células isoladas em um prato de cultura tecidual (células isoladas de 2 corações a partir do passo 1.1. por prato de 100 mm) por 1 h. Como os CMs precisam de uma superfície tratada com fibronectina ou colágeno para aderir, apenas os MFs se ligarão à superfície da cultura tecidual.
4. Aspire a suspensão da célula CMs enriquecida. Estes CMs podem ser usados para experimentos de acoplamento heterocelular, conforme descrito na seção 3. Enxágüe os MFs com DMEM para eliminar quaisquer CMs restantes do prato MFs.
5. Adicione meio de cultura fresco aos MFs e permita que eles se proliferem até que sejam ~80% confluentes (2-4 dias). Mude o meio dia não.
6. Quando as células estiverem prontas (80% confluentes), prepare siNWs para a etapa de hibridização abaixo (passo 1.7).
   NOTA: Muitos tipos de SiNWs podem ser usados para isso. Neste experimento, siNWs que foram cultivados por deposição de vapor químico (DCV) com uma configuração de junção p-i-n de concha central foram usados como descrito anteriormente¹⁶. Durante o crescimento da DCV, os SiNWs são cultivados em um substrato de wafer de silício, e eventualmente são mantidos como chips de silício cobertos com SiNWs.
7. Corte um chip de 3 mm x 3 mm de um wafer com SiNWs cultivados em DCV usando um escriba de diamante. Use fórceps afiados para manusear o wafer e minimizar a área de superfície que é tocada com os fórceps, pois isso pode quebrar os SiNWs.
8. Esterilize o chip enxaguando-o com 70% de etanol e permitindo que o etanol seque por 30 minutos sob luz UV em uma capa de fluxo laminar de biossegurança.
9. Transfira o chip para um tubo de microcentrifus e enxágue o excesso de etanol usando mídia de cultura completa.
10. Adicione 1 mL de mídia cultural e sonicar o chip no banho de sônica por 1-10 min. A mídia deve ficar turva à medida que os SiNWs são lançados na mídia.
    NOTA: O tempo e a energia da sônicação devem ser otimizados para diferentes sonicadores ou células diferentes, uma vez que durações mais curtas e potências mais baixas produzirão SiNWs mais longos.
11. Adicione a suspensão do SiNWs em 5 mL de mídia cultural e semeeá-la no prato de cultura de tecido de 100 mm com MFs. Permita que os SiNWs internalizem por 4h e enxágue o excesso de SiNWs fora 5x com mídia. Permita que os SiNWs parcialmente internalizados completem a internalização, permitindo que eles se sentem por mais 1h antes de usar.
    NOTA: Diferentes tipos de células podem precisar de diferentes tempos de concentração e/ou internalização de SiNWs.
12. Prepare a solução de revestimento de colágeno diluindo a solução de estoque de colágeno (3 mg/mL) com ácido acético estéril de 20 mM a uma razão de 1:50. Adicione a solução de revestimento de 0,5 mL a uma antena de fundo de vidro de 35 mm e deixe descansar por 1h em 37 °C. Retire a solução e enxágue o prato com PBS estéril.
13. Colher os híbridos cell-SiNWs tratando as células com 3 mL de trippsina por 2 min a 37 °C. Adicione 10 mL de mídia cultural e enxágue os híbridos vigorosamente por pipetação. Centrifugar as células suavemente a 200 x g por 5 min para evitar danificar as células com os SiNWs internalizados. Remova o excesso de mídia, suspenda as células com mídia de 1 mL e semeie-as no prato de fundo de vidro tratado com colágeno.
    NOTA: Os híbridos podem ser semeados sozinhos, para investigar o acoplamento intracelular ou intercelular ou com CMs para investigar o acoplamento heterocelular in vitro.
14. Realize uma verificação final da internalização do SiNW rotulando o citosol das células (calcein-AM, 4 μM) e membrana (marcador de membrana, 2 μM) por 30 min a 37 °C, e imagem da célula usando microscopia confocal. Como os SiNWs são altamente reflexivos, a luz refletida pode ser usada em vez de fluorescência para visualizá-los.

2. Preparação de células para investigações intra e intercelulares

1. Prepare a solução de revestimento de colágeno como em 1.12
2. Para estimulação elétrica intracelular, híbridos de cultura com baixas densidades de semeadura. Use um hemótmetro padrão para contar células da seção 1.11. e sementes 50.000 células em um prato de fundo de vidro de 35 mm na mídia cultural. Para investigações intercelulares, use densidades celulares mais altas (500.000 células por prato). Para o acoplamento intercelular entre CMs e MFs, co-cultura os híbridos com CMs recém-isolados.
3. Permitir que as células se conectem durante a noite antes de realizar experimentos de estimulação óptica. Para investigações intercelulares, permita 48 h a 37 °C para que as células expressem junções intercelulares antes que o experimento seja realizado.
4. Prepare a solução de estoque de corante sensível ao cálcio (pode ser mantida em -20 °C) adicionando 50 μL de DMSO a 50 μg Fluo-4 AM. Prepare a solução de coloração diluindo 1 μL de corante em 1 mL de DMEM.
5. Aspire o meio de cultura das células e adicione 1 mL de solução de coloração. Deixe o corante internalizar nas células por 20-30 min a 37 °C. Aspire o corante e enxágue duas vezes com PBS estéril.
6. Por fim, adicione 1 mL de DMEM Media livre de fenol-vermelho pré-aquecido e permita que o Fluo-4 intracelular se submeta à desestificação por 30 minutos em 37 °C.
7. Transferir células para microscópio para imagem e estimulação.

3. Imagem óptica e estimulação

1. Pré-aqueça um microincubador umidificado a 37 °C e a mistura de ar-CO₂ bolha (95:5).
2. Use um microscópio com uma linha laser colidida acoplada no caminho da luz para imagem de cálcio e estimulação óptica.
   NOTA: Um microscópio confocal de digitalização é a opção mais simples devido às suas capacidades de estimulação de ponto. No entanto, este procedimento pode ser feito usando qualquer microscópio de floresnce padrão acoplando um raio laser colidido no espaço infinito do caminho de luz usando um divisor de feixe. Qualquer objetivo de microscópio é projetado para que um laser colidido passou por ele será focado em um ponto laser limitado de difração no plano focal. O comprimento de onda laser deve estar próximo da luz de excitação, por isso será refletido pelo espelhodicróico e passado pelo filtro de excitação.
3. Visualize os SiNWs e determine o local de estimulação usando microscopia de campo brilhante, luz transmitida ou luz reflexiva. Em seguida, reconfigure o caminho da luz para o modo fluorescência, mantendo o ponto de estimulação na localização predefinida do SiNW.
4. Validar o poder de estimulação ideal e o comprimento do pulso para cada tamanho sinw e tipo de célula, para minimizar danos fototérmicos às células estimuladas. Para um protocolo típico de estimulação, realize um registro de linha de base de 2-10 da atividade de cálcio intracelular. Em seguida, aplique um único pulso laser de 1-10 mW de potência e 1-10 ms de duração (correspondente a 30-300 kW/mm²) para estimular o SiNW, e registrar a onda de cálcio resultante para outros 2-10 s.
   NOTA: É essencial otimizar a potência óptica e o comprimento do pulso para cada tamanho e células do SiNW. Isso é necessário para minimizar os danos fototérmicos às células estimuladas.
5. Transfira os filmes gravados da estimulação óptica, se necessário, para análise posterior.

4. Processamento de vídeo

1. Visualize alterações na fluorescência fluo-4 usando o macro "dF over F"¹⁷ disponível para ImageJ¹⁸, que calcula a mudança na contagem de fluorescência para cada pixel, e normaliza pelo valor médio da linha de base de repouso. Converta a saída (formato de ponto flutuante) em 8 bits para posterior processamento.
2. Processe o filme dF/F ainda mais usando o filtro mediano seletivo "Remove outliers" disponível no ImageJ. Defina parâmetros para remover pixels onde seu valor é mais de 10 acima do valor médio em um raio de 2 pixels e substitua esse valor de pixel pela mediana.
3. Calcule o fluxo óptico em cada quadro através do algoritmo Lucas-Kanade, conforme implementado na caixa de ferramentas Matlab Computer Vision. A saída desta função foi um campo vetorial contendo os componentes x e y do fluxo óptico em cada ponto de cada imagem (o código está disponível no Arquivo Suplementar 1).
   NOTA: O fluxo óptico médio dentro de uma célula, <ν>, corresponde ao desenvolvimento do fluxo de cálcio dentro de uma célula. O diferencial do fluxo óptico, Δ<ν> fornece o ponto de tempo em que a sinalização de cálcio foi ativada, identificando onde o sinal foi maximizado. Além disso, a magnitude de Δ<ν> no seu máximo está correlacionada com a taxa em que a frente de onda de cálcio progride através da célula.
4. Calcule a velocidade intercelular da transmissão de cálcio de acordo com a seguinte equação.
   v_Ca²⁺ = r_ij / ( t_max,j − t_max,i ),
   onde t_max,j e t_max,i são os tempos de ativação para células j e i, respectivamente, e r_ij é a distância entre os centroides das células.

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Resultados

A capacidade dessa metodologia de permitir o acesso direto ao citosol intracelular depende da internalização espontânea do SiNW nas células. Embora os SiNWs sejam submetidos à internalização espontânea em muitos tipos de células¹⁵, algumas células, como cardiomiócitos e neurônios, precisarão que os SiNWs sejam tratados para permitir sua internalização¹⁹. Neste protocolo descrevemos o processo de internalização de P-i-n SiNWs com 200-300 nm de diâmetro e ~1...

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Discussão

Nós demonstramos aqui uma maneira simples de realizar estimulação elétrica intracelular das células. Nesta demonstração, usamos MFs que foram pré-fabricados com SiNWs, depois co-cultivados com CMs. Em geral, a maioria das células que proliferam tem a tendência de internalizar SiNWs, o que permite o uso dessa metodologia com muitos outros tipos de células. Além disso, enquanto demonstramos a estimulação intracelular das células, os mesmos princípios podem ser usados para realizar estimulação extracelular...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Glass bottom dishes	Cellvis	D35-10-0-N
3i Marianas Spinning Disk Confocal	3i
Calcein-AM	Invitrogen	C1430
CellMask Orange Plasma membrane Stain	Invitrogen	C10045
Collagen I, rat tail	Gibco	A1048301
Deluxe Diamond Scribing Pen	Ted Pella	54468
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine	Gibco	10313039
DMSO, Anhydrous	Invitrogen	D12345
Falcon Standard Tissue Culture Dishes	Falcon	08-772E
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated,	Gibco	10082147
Fibronectin Human Protein, Plasma	Gibco	33016015
Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner	Fisher Scientific	FB11201
Fluo-4, AM, cell permeant	Invitrogen	F14201
FluoroBrite DMEM Media	Gibco	A1896701
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030081
OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2)	OKO
PBS, pH 7.4	Gibco	10010023
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit	Thermo Scientific	88281
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056