Construindo Mutantes na Cepa 519/43 do Streptococcus pneumoniae do Serotipo 1

Resumo

Aqui, descrevemos uma cepa 519/43 do sorotipo 1 de S. pneumoniae que pode ser geneticamente modificada usando sua capacidade de adquirir naturalmente DNA e um plasmídeo suicida. Como prova de princípio, um mutante isogênico no gene da pneumolisina (plys) foi feito.

Resumo

O sorotipo 1 do Streptococcus pneumoniae continua sendo um enorme problema em países de baixa e média renda, particularmente na África Subsaariana. Apesar de sua importância, os estudos nesse sorotipo têm sido dificultados pela falta de ferramentas genéticas para modificá-lo. Neste estudo, descrevemos um método para modificar geneticamente um isolado clínico do sorotipo 1 (cepa 519/43). Curiosamente, isso foi conseguido explorando a capacidade do pneumococo de adquirir DNA naturalmente. No entanto, ao contrário da maioria dos pneumococos, o uso de DNA linear não foi bem sucedido; para mutar essa importante cepa, um plasmídeo suicida teve que ser usado. Essa metodologia forneceu os meios para uma compreensão mais profunda desse sorotipo indescritível, tanto em termos de biologia quanto de patogenicidade. Para validar o método, a principal toxina pneumocócica conhecida, a pneumolisina, sofreu mutação por ter um fenótipo bem conhecido e fácil de seguir. Mostramos que o mutante, como esperado, perdeu sua capacidade de lisar glóbulos vermelhos. Ao sermos capazes de mutar um gene importante no sorotipo de interesse, pudemos observar fenótipos diferentes para a perda de função mutantes em infecções intraperitoneais e intranasais daqueles observados para outros sorotipos. Em resumo, este estudo prova que a estirpe 519/43 (serotipo 1) pode ser geneticamente modificada.

Introdução

Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, o pneumococo) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Até recentemente, cerca de 100 sorotipos de S. pneumoniae foram descobertos 1,2,3,4,5,6,7. Anualmente, a doença pneumocócica invasiva (DPI) reivindica cerca de 700.000 mortes, de crianças menores de 5 anos⁸. S. pneumoniae é a principal causa de pneumonia bacteriana, otite média, meningite e septicemia em todo o mundo⁹.

No cinturão africano de meningite, o sorotipo 1 é responsável por surtos de meningite, onde o tipo de sequência (ST) ST217, um tipo de sequência extremamente virulento, é dominante 10,11,12,13,14,15. Sua importância na patologia da meningite tem sido comparada à de Neisseria meningitidis no cinturão africano de meningite¹⁶. O sorotipo 1 é frequentemente a principal causa de DPI; no entanto, é muito raramente encontrado em carruagens. De fato, na Gâmbia, esse sorotipo é responsável por 20% de todas as doenças invasivas, mas só foi encontrado em 0,5% dos portadores saudáveis^14,17,18,19. A troca genética e a recombinação em pneumococos competentes ocorrem geralmente no transporte e não na doença invasiva²⁰. Além disso, o sorotipo 1 demonstrou ter uma das taxas de transporte mais curtas descritas entre os pneumococos (apenas 9 dias). Portanto, tem sido proposto que esse sorotipo pode ter uma taxa de recombinação muito menor do que outros²¹.

Estudos aprofundados são necessários para entender a razão por trás da baixa taxa de transporte das cepas do sorotipo 1 e sua importância na doença invasiva na África Subsaariana.

Aqui relatamos um protocolo que permite a mutagênese em todo o genoma de uma cepa específica do sorotipo 1, 519/43. Esta estirpe pode facilmente adquirir e recombinar novo ADN no seu genoma. Este método ainda não é inter-tensão, mas é muito eficiente quando feito em fundo 519/43 (outros alvos foram mutados, manuscritos em preparação). Simplesmente usando a cepa 519/43 e explorando sua competência natural, bem como substituindo a maneira como o DNA exógeno é fornecido, fomos capazes de mutar o gene da pneumolisina (ply) nesta cepa do sorotipo 1. Esse método representa uma melhoria em relação ao apresentado por Harvey et ^al.22 , pois é feito em uma única etapa, sem a necessidade de passar o DNA por um sorotipo diferente. No entanto, e devido à variabilidade entre as cepas, nenhum método foi padronizado para todas as cepas. A capacidade de mutar genes específicos e observar seus efeitos permitirá uma compreensão profunda das cepas de S. pneumoniae do sorotipo 1 e fornecerá respostas para o papel dessas cepas na meningite na África Subsaariana.

Protocolo

1. Geração do amplificador mutante por SOE-PCR²³ e amplificação do de espectinomicina

1. Comece realizando a PCR para a amplificação dos braços de homologia (ply 5' (488 pb) e ply3' (715 bp) respectivamente) das regiões de flanco do gene da camada da cepa 519/43. Use primers plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACCC GGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTCTGGATCC GCGTCCTTTGGTCTATATTTCG) e plyRv2_NotI (TTTGCGGCCCCATTTTCTCTATTCTATTCTATTCTATTCTATTCTCTCT).
2. Utilizar as seguintes condições de PCR para a ply5': desnaturação a 94 °C durante 60 s, passo 2: desnaturação a 94 °C durante 30 s, passo 3: recozimento a 58 °C durante 30 s, passo 4: extensão a 72 °C durante 30 s, passo 5: voltar ao passo 2 e repetir durante 35 ciclos, passo 6: extensão final a 72°C durante 30 s.
   1. Use as mesmas condições de PCR para ply3', com exceção do tempo de extensão na etapa 4 e na etapa 6, onde deve ser de 60 s.
3. Analise os produtos de PCR por eletroforese em gel e extirpe o amplificão do gel.
4. Purificar os amplificadores de PCR seguindo o protocolo descrito nas instruções do fabricante (Tabela de Materiais).
5. Use quantidades equimolares de ambos os braços de homologia como modelos no SOE-PCR. Fundir os dois amplificadores usando primers plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) e plyRv2_NotI (TTTGCGGCCCCATTTTCTACCTTATCCTCTACC).
6. Utilize as seguintes condições SOE-PCR (passo 1: desnaturação a 94 °C durante 2 min, passo 2: desnaturação a 94 °C durante 30 s, passo 3: recozimento a 58 °C durante 30 s, Passo 4: extensão a 68 °C durante 60 s, passo 5: voltar ao passo 2 e repetir durante 25 ciclos, passo 6: extensão final a 68 °C durante 90 s).
7. Analisar o produto SOE-PCR por eletroforese em gel. Retire-o do gel usando um kit de extração de gel e siga as instruções fornecidas.
8. Amplificar o de espectinomicina do plasmídeo pR412 utilizando as seguintes condições de PCR: passo 1: desnaturação a 94 °C durante 60 s, passo 2: desnaturação a 94 °C durante 30 s, passo 3: recozimento a 55 °C durante 30 s, passo 4: extensão a 68 °C durante 60 s, passo 5: voltar ao passo 2 e repetir durante 25 ciclos, passo 6: extensão final a 68 °C durante 60 s.
   1. Use primers BamHI_SP2F2 (GGATCC CTA GAA CTA GTG GAT CCC CC) e BamHI_SP2R2 (GGATCC AAT TCT GCA GAT TTT AC ATG ATC). O Plasmid pR412 foi adquirido do Dr. Marc PrudHomme (CNRS-Universite Paul Sabatier Toulouse França).
9. Analisar os amplificadores de PCR por eletroforese em gel. Aumentar e purificar o amplificador de PCR resultante, conforme descrito acima.

2. Geração de plasmídeo pSD1 e Transformação química de E. coli Dh5α

1. Realizar uma ligadura seguindo as instruções do fabricante do sistema pGEMT I (Tabela de Materiais). Em um tubo de microcentrífuga, adicione 5 μL de tampão de ligadura 2x, 1 μL de pGEMTeasy, 2 μL do produto ply_SOE, 1 μL de ligase de DNA T4 e água a um volume total de 20 μL. Incubar durante a noite a 4 °C. Isso gera o plasmídeo pSD1.
2. Transformar E. coli Dh5α quimicamente competente com pSD1. Comece incubando 50 μL de E. coli Dh5α quimicamente competente com 3 μL de reação de ligadura pSD1 por 15 min no gelo. Em seguida, continue expondo as células ao choque térmico (42 °C, 30 s). Coloque as células no gelo por 2 min.
3. Remova as células do gelo e adicione 350 μL de meio S.O.C. Incubar a cultura por 2 h a 37 °C, 120 rpm.
4. Placa de transformação em ágar Luria Bertani (LBA) suplementado com 0,4 mM IPTG, 0,24 mg/mL X-Gal para seleção azul/branca e 100 μg/mL de ampicilina para garantir que todas as colônias que crescem na placa tenham a espinha dorsal do plasmídeo. As colônias brancas contêm pSD1.
5. Escolher três colónias brancas e estabelecer crescimentos durante a noite em 10 ml de LB, suplementados com 100 μg/ml de ampicilina. Incubar as culturas durante a noite a 37 °C com agitação.
6. No dia seguinte, centrifugar as culturas a 3.082 x g e usar o pellet para extração de plasmídeos.

3. Extração de DNA plasmídico, digestão de restrição de pSD1 e gene de espectinomicina e montagem de pSD2

1. Extraia o DNA plasmídico seguindo as instruções fornecidas com o kit comercial (Tabela de Materiais).
2. Configure uma digestão de restrição de BamHI para o plasmídeo pSD1 e o de espectinomicina previamente amplificado e purificado. Utilizar as seguintes condições e quantidades descritas no quadro 1.
3. Incubar as reações de digestão de restrição e os controles a 37 °C por 3 h.
4. Analisar o digesto de restrição por eletroforese, extirpar a banda e purificar seguindo as instruções fornecidas com o kit comercial (Tabela de Materiais).
5. Em seguida, prepare uma reação de ligadura seguindo as instruções do fabricante (Tabela de Materiais) usando o pSD1 digerido por BamHI e a espectinomicina (a partir da etapa 3.2). Num tubo de microcentrífuga, adicionar os seguintes componentes de reacção: 5 μL de tampão de ligadura 2x, 2 μL pSD1, 2 μL de de espectinomicina, 1 μL de DNA ligase T4 e incubar durante a noite a 4 °C. Isso gera o plasmídeo pSD2.
6. Transformar o plasmídeo pSD2 em E. coli Dh5α quimicamente competente, conforme descrito no passo 2.2.
7. Selecione os transformadores portadores de plasmídeo pSD2 com base em sua capacidade de crescer em LBA suplementado com 100 μg/mL de espectinomicina e ampicilina.
8. Realizar uma extração de DNA plasmídico (pSD2) conforme descrito acima e seguindo as instruções do fabricante (μL).

4. Transformação da estirpe 519/43 de S. pneumoniae

1. Preparar uma cultura noturna de S. pneumoniae 519/43 em BHI e permitir que ela cresça estaticamente a 37 °C, 5% de CO₂.
2. No dia seguinte, diluir as culturas 1:50 e 1:100 em 10 mL de caldo BHI fresco. Incubar as culturas estaticamente a 37 °C até que a OD_595nm esteja entre 0,05 e 0,1 (aquisição ótima de DNA mais próxima de 0,1 OD).
3. Uma vez que uma OD de 0,1 é atingida, pegue 860 μL e transfira para um tubo de microcentrífuga. Neste mesmo tubo de microcentrífuga adicionar: 100 μL de 100 mM de NaOH, 10 μL de 20% (p/v) BSA, 10 μL de 100 mM CaCl 2,₂ μL de 50 ng/mL CSP1²⁴ e 500 ng de pSD2.
4. Incubar a reacção estaticamente a 37 °C durante 3 h.
5. Placa de 330 μL em placas de ágar sangue (BA) a 5% suplementadas com 100 μg/mL de espectinomicina, a cada hora durante as 3 horas de incubação.
6. Incubar as placas durante a noite a 37 °C, 5% de CO₂. Colomendo colônias resistentes à espectromicina em outra placa de BA suplementada com 100 μg/mL de espectinomicina, bem como em placas de BA suplementadas com 100 μg/mL de ampicilina. Incubar ambos os conjuntos de placas durante a noite sob as condições indicadas acima. As placas de ampicilina devem testar a presença da espinha dorsal do plasmídeo.
7. Confirmar a presença do de espectinomicina por PCR utilizando primers plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) e SPEC_REV (TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG). Confirme a mutação por PCR usando os primers plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA) e plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT) que se ligam fora da região mutada.
8. Confirmar a integração na localização correta do genoma por sequenciamento usando primers plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA), plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT), bem como primers com seu local de ligação no de espectinomicina sqr1 (CCTGATCCAAACATGTAAGTACC) sqf2 (CGTAGTTATCTTGGAGAGAATA) spec_sqf1 (GGTACTTACATGTTTGGATCAGG ) e spec_sqr2 TATTCTCTCCAAGATAACTACG.

Resultados

O protocolo descrito aqui começa usando a PCR para amplificar os braços de homologia esquerdo e direito, enquanto simultaneamente exclui 191 pb da região média do gene da dobra . Durante a realização da PCR, um sítio BamHI é introduzido no 3' do braço de homologia esquerdo e no final de 5' do braço de homologia direito (Figura 1A). Segue-se a PCR-SOE, onde os braços de homologia esquerdo e direito são fundidos em um amplicon (Figura 1B). Est...

Discussão

O Streptococcus pneumoniae, em particular o sorotipo 1, continua a ser uma ameaça global que causa doença pneumocócica invasiva e meningite. Apesar da introdução de várias vacinas que deveriam ser protetoras contra o sorotipo 1, na África, esse sorotipo ainda é capaz de causar surtos que levam a alta morbidade e mortalidade¹³. A capacidade de manipular geneticamente este sorotipo é de importância crítica devido à sua relevância clínica. O método descrito neste estudo permit...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuPrime Pfx DNA polymerase	Invitrogen	12344024	Used for amplification of the fragments
Ampicillin sodium salt	Sigma Aldrich	A9518	Used for bacterial selection on stage 1(pSD1)
Blood Agar Base	Oxoid	CM0055	Used to plate S. pneumoniae transformants
Bovine Serum Albumine	sigma	55470	used for S. pneumoniae Transformation
Brain Heart Infusion	Oxoid	CM1135	used to grow S. pneumoniae cells
Calcium Chloride Cacl2	Sigma	449709	used for S. pneumoniae Transformation
Competence stimulating peptide 1	AnaSpec	AS-63779	used for S. pneumoniae Transformation
Luria Broth Agar	Gibco	22700025	used for plating and selection of pSD1 and pSD2
Luria Broth Base (Miller's formulation)	Gibco	12795027	used for plating and selection of pSD1 and pSD2
Monarch Gel Extraction Kit	NEB	T1020S	Used to extract the bands from the DNA gel
Monarch Plasmid Miniprep Kit	NEB	T1010S	Used to extract plasmid from the cells
pGEM T-easy	Promega	A1360	used as suicide plasmid
S.O.C.	Invitrogen	15544034	used for recovery of cells after transformation
Sodium Hydroxide (NaOH)	Sigma	S0899	used for S.pneumoniae Transformation
Spectinomycin Hydrochloride	SigmaAldrich	PHR1426	Used for bacterial selection
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Invitrogen	18265017	used for the creation of pSD1 and pSD2