Um modelo biomimético para câncer de fígado para estudar interações tumorais-estroma em um ambiente 3D com propriedades biofísicos incapazes

Resumo

Este protocolo apresenta um modelo biomimético 3D com compartimento estrommal fibroso que acompanha. Preparado com hidrogéis fisiologicamente relevantes em proporções que imitam as propriedades biofísicas da matriz extracelular estrominal, mediador ativo de interações celulares, crescimento tumoral e metástase.

Resumo

Carcinoma hepatocelular (HCC) é um tumor hepático primário que se desenvolve na esteira de uma doença hepática crônica. Doença hepática crônica e inflamação leva a um ambiente fibroso apoiando e conduzindo hepatocarcinogênese. A percepção sobre hepatocarcinogênese em termos da interação entre o microambique do tumor e as células tumorais é, portanto, de considerável importância. Modelos tridimensionais (3D) de cultura celular são propostos como o elo perdido entre os modelos atuais in vitro de cultura celular 2D e modelos in vivo animal. Nosso objetivo era projetar um novo modelo HCC biomimético 3D com compartimento estromático e vasculatura fibrosa. Hidrogéis fisiologicamente relevantes, como colágeno e fibrinogênio, foram incorporados para imitar as propriedades biofísicas do tumor ECM. Neste modelo, as células LX2 e HepG2 embutidas em uma matriz de hidrogel foram semeadas na inserção transmembrana invertida. As células HUVEC foram então semeadas no lado oposto da membrana. Três formulações constituídas por hidrogéis ECM incorporados com células foram preparadas e as propriedades biofísias foram determinadas pela reologia. A viabilidade celular foi determinada por um ensaio de viabilidade celular ao longo de 21 dias. O efeito da droga quimioterápica daxorubicina foi avaliado tanto na cocultura 2D quanto no nosso modelo 3D por um período de 72h. Os resultados da reologia mostram que as propriedades biofísicas de um fígado fibroso, cirrítmico e HCC podem ser imitadas com sucesso. No geral, os resultados indicam que este modelo 3D é mais representativo da situação in vivo em comparação com as culturas 2D tradicionais. Nosso modelo de tumor 3D mostrou uma resposta reduzida à quimioterapia, imitando a resistência medicamentosa normalmente vista em pacientes com HCC.

Introdução

O carcinoma hepatocelular (HCC) compreende 90% de todos os cânceres hepáticos primários^1,2. Com 810.000 mortes e 854.000 novos casos relatados anualmente, ele é atualmente classificado como o quinto câncer mais comum em todo o mundo com uma das maiores incidências de mortalidade¹. O desenvolvimento do CCS é predominantemente atribuído à inflamação associada a doenças hepáticas crônicas, ou seja, hepatite viral, ingestão crônica excessiva de álcool, síndrome metabólica, obesidade e diabetes^1,3,4.  A inflamação associada a essas condições patológicas resulta em lesão hepatocitária e secreção de várias citocinas que ativam e recrutam células estelares hepáticas e células inflamatórias para iniciar a fibrose⁵. As células estelares hepáticas são conhecidas por seu papel fundamental na iniciação, progressão e regressão da fibrose hepática. Após a ativação, eles se diferenciam em myofibroblast como células com propriedades contractile, pró-inflamatórias e pró-fibrinogênicas^6,7,8. A fibrose resultante, por sua vez, provoca a desregulação da atividade enzimante de remodelação da matriz extracelular, criando um ambiente caracterizado por um aumento geral da rigidez acompanhado da secreção de fatores de crescimento, o que contribui ainda mais para a patogênese HCC^9,10. É este ciclo de feedback patogênico contínuo entre hepócitos e o ambiente estroma, que alimenta a iniciação do câncer, a epitelial às transições mesenquimais (EMT), a angiogênese, o potencial metastático e a resposta alterada da droga^11,12,13.  A percepção da hepatocarcinogênese em termos da interação entre o tumor e o microambique tumoral é, portanto, de considerável importância não apenas de uma perspectiva mecanicista, mas também de uma perspectiva de tratamento.

Modelos bidimensionais (2D) de cultura celular in vitro são predominantemente usados por 80% dos biólogos de células^{cancerosas 14}. No entanto, esses modelos não são representativos do verdadeiro microambi ambiente tumoral, que afeta as respostas quimioterápicas^14,15,16. Atualmente, 96% dos medicamentos quimioterápicos falham durante os ensaios clínicos¹⁴.  Essa alta incidência nas taxas de atrito de medicamentos pode ser atribuída ao fato de que os modelos de pré-triagem in vitro disponíveis não representam totalmente nossa visão atual e compreensão da complexidade do HCC e do microambiente¹⁶. Por outro lado, os modelos animais in vivo apresentam sistemas imunológicos comprometidos e discrepâncias nas interações entre o tumor e o microambiente quando comparados aos humanos^16,17. Em média, apenas 8% dos resultados obtidos a partir de estudos em animais podem ser traduzidos de forma confiável do pré-clínico para o quadro clínico^16,17. Portanto, fica claro que a avaliação do CCH requer o desenvolvimento de uma plataforma in vitro que recapitula efetivamente a complexidade não só do tumor, mas também do microambiente. As plataformas complementariam os modelos de triagem pré-clínica in vitro atualmente disponíveis e reduziriam a quantidade de estudos em animais no futuro^7,14.

Uma dessas plataformas são modelos avançados de cultura celular tridimensional (3D). Uma infinidade desses modelos 3D avançados para estudar o HCC surgiram na última década e várias revisões foram publicadas. Os modelos 3D disponíveis para estudar HCC incluem esferoides multicelulares, organoides, modelos à base de andaimes, hidrogéis, microfluidos e bioimvistos. Destes, os esferoides multicelulares são um dos modelos mais conhecidos utilizados no estudo do desenvolvimento de tumores. Os spheroids são um modelo barato e com baixa dificuldade técnica e, ao mesmo tempo, imitam efetivamente a arquitetura do tumor in vivo^18,19,20. Eferóides multicelulares contribuíram para uma riqueza de informações sobre hcc^17,21,22. No entanto, o tempo de cultura padronizado é carente, pois os esferoides multicelulares são mantidos na cultura entre 7 e 48 dias. O aumento do tempo de cultura é de considerável importância. Eilenberger descobriu que as diferenças na idade esferoide influenciam profundamente o Sorafenib (inibidor de quinase usado para o tratamento de cânceres de fígado) difusividade e toxicidade²³. Enquanto Wrzesinski e Fey descobriram que os spheróides hepatocitos 3D requerem 18 dias para restabelecer as principais funções fisiológicas do fígado após a tentação e continuam a exibir a funcionalidade estável por até 24 dias após esta^{recuperação 24,25}.

Alguns dos modelos 3D HCC mais avançados incluem o uso de andaimes de fígado descelularizados humanos e andaimes bio-impressos. Mazza e colegas criaram um andaime 3D natural para modelagem HCC usando fígados humanos descelularizados inadequados para transplante²⁶. Estes andaimes naturais poderiam ser repovoados com sucesso por 21 dias com uma co-cultura de células hepáticas estelares e hepatoblastoma, mantendo a expressão de componentes da matriz extracelular chave, como colágeno tipo I, III, IV e fibronectina. Além da modelagem da doença, este modelo também oferece a vantagem do transplante funcional de órgãos e do rastreamento pré-clínico de medicamentos e toxicidade²⁶. Com os avanços na bioimprimem 3D, andaimes de matriz extracelular 3D agora também podem ser bio-impressos.  Ma e colegas, andaimes de matriz extracelular bio-impresso com propriedades mecânicas variáveis e microarquitetura biomimética utilizando engenheiro de hidrogéis da matriz extracelular²⁷descelularizada . Sem dúvida, todos estes são excelentes modelos 3D HCC. No entanto, a indisponibilidade dos fígados humanos e o custo envolvido na aquisição dos equipamentos e materiais necessários colocam esses modelos em desvantagem. Além disso, esses métodos são tecnicamente avançados, exigindo treinamento extensivo que pode não estar prontamente disponível para todos os pesquisadores.

Com base na complexidade do HCC e atualmente disponíveis modelos 3D, nos esforçamos para desenvolver um modelo 3D HCC abrangente. Buscamos um modelo capaz de recapitular tanto o microambiente pré-maligno quanto o tumor, incorporando valores de rigidez hidrogel ajustáveis.  Além disso, incluímos também linhas celulares associadas ao hepatocelular e estroma, que desempenham um papel fundamental na patogênese do HCC. Estes incluem células endoteliais, células estelares hepáticas e hepatócitos malignos, cultivados em um microambiente composto por hidrogéis fisiologicamente relevantes. Com os hidrogéis escolhidos, colágeno tipo I e fibrinogênio, incorporados em proporções comparáveis às alterações biofísias vistas na rigidez hepática durante a iniciação e progressão do HCC.  Além disso, buscamos um modelo que pudesse ser mantido na cultura por um período prolongado. Vislumbramos um modelo modular e econômico que pode ser configurado com equipamentos básicos, treinamento mínimo e experiência e materiais prontamente disponíveis.

Protocolo

Figura 1: Representações gráficas da criação do modelo HCC biomimético 3D Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

NOTA: O fluxo de trabalho global deste protocolo está definido nas ilustrações da Figura 1

1. Preparação da solução de estoque fibrinogênico

1. Prepare uma solução de estoque de 1 M de cloreto de cálcio (CaCl_2),pesando 2,21 g CaCl₂ e adicionando-a a 20 mL de água destilada (dH₂O). A solução de estoque pode ser armazenada à temperatura ambiente (RT).
2. Prepare uma solução de estoque de aprotinina de 20 mL (1218,75 KIU/mL) pesando 5 mg de aprotinina e adicionando-a a 20 mL dH₂O. Solução de estoque aliquot em alíquotas de 1 mL e armazenar a -20 °C.
3. Prepare uma solução de estoque fibrinogênico de 10 mL de 80 mg/mL.
   1. Em um tubo de 50 mL adicione 7.849 mL de salina tamponada de fosfato (PBS), 2,051 mL aprotinina (1218,75 KI LU/mL) para uma concentração final de aprotinina de 250 KIU/mL e 100 μL CaCl₂ (1M) para uma concentração final de CaCl₂ de 10 mM.
   2. Pesar 800 mg de fibrinogênio.
   3. Pesar 200 mg de cloreto de sódio (NaCl) para que a solução de estoque contenha 2% de c/v NaCl.
   4. Adicione o fibrinogênio e o NaCl em incrementos ao tubo de 50 mL contendo o PBS, aprotinína e CaCl₂. Não mexa ou agite vigorosamente, pois isso resultará em gelagem de fibrinogênio e emperramentos se formando na solução.
   5. Coloque o tubo de 50 mL da solução de caldo fibrinogênico horizontalmente em um agitador e agite a uma configuração baixa de 300 rpm.
4. Uma vez que a solução tenha dissolvido, filtre-a usando um filtro de seringa de 0,22 μm ou um filtro de topo de garrafa, dependendo do volume. É importante ressaltar que não autoclave a solução fibrinogênio, pois isso destruirá o fibrinogênio.
   NOTA: Esta parte do protocolo pode levar entre 2 a 5 h, dependendo da quantidade de solução de estoque, este tempo deve ser levado em consideração durante a configuração experimental.

2. Revestimento insere com colágeno antes de semear os hidrogéis nas pastilhas

1. Em uma capa de fluxo laminar ou uma capa de cultura de tecido, usando pinças esterilizadas, remova as pastilhas da placa e coloque invertido na tampa da placa.
2. Prepare uma solução de estoque de ácido acético glacial de 100 mL adicionando 115 μL de ácido acético glacial a 25 mL de dH₂O e ajuste a um volume final de 100 mL com dH₂O. Filtre a solução usando um filtro de seringa de 0,22 μm. A solução de estoque pode ser armazenada na RT.
3. Prepare 2 mL de uma solução de colágeno de 100 μg/mL a partir de uma solução de colágeno de 5 mg/mL adicionando 40 μL da solução de colágeno de 5 mg/mL a 1.960 mL da solução de 20 mM de ácido acético glacial preparada em 2,2.
4. Cubra as pastilhas com a solução de colágeno de 100 μg/mL preparada em 2,3 por pipetação de 100 μL da solução em cada inserção. Deixe inserir ar seco dentro da capa de fluxo laminar ou da capa de cultura de tecido por 2 a 3 horas.
5. Uma vez que as pastilhas tenham lavado seco cada inserção 3x com PBS. Adicione 1 mL de PBS a cada poço de uma placa de 12 poços, coloque as pastilhas com revestimento de colágeno voltado para baixo nos poços, retire o PBS do poço e repita o procedimento. Deixe inserir ar seco dentro do capô de fluxo laminar de 1 a 2 h.
   ATENÇÃO: O ácido acético é tóxico para as células e as pastilhas devem ser lavadas completamente com PBS.
6. Adicione um espaçador impresso 3D personalizado sobre as pastilhas, isso será necessário uma vez que os géis estejam pendurados na pastilha para evitar que toquem no poço inferior da placa(Figura 2).

Figura 2: Espaçador impresso 3D personalizado Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. Cubra as pastilhas invertidas com a parte inferior da placa e coloque na incubadora até que as células estejam embutidas nos hidrogéis e prontas para serem semeadas.

3. Células de semeadura embutidas em hidrogéis em pastilhas

NOTA: A Tabela 1 fornece uma descrição de 3 formulações com concentrações variadas fibrinogenas que serão preparadas. Formulação uma corresponde ao fígado durante o início da fibrose, duas cirrose e três HCC, os valores de rigidez para cada uma dessas formulações foram determinados com reologia durante a otimização do protocolo.

Formulação	Concentração final de fibrinogênio (mg/mL)	Concentração final de colágeno (mg/mL)	Células (LX2 + HepG2 Co-cultura 1:1)	Estágio do fígado	Valores de rigidez hepática da literatura (kPa)	Valor de rigidez do modelo de Reologia (kPa)	Formulação	Fibrinogen para adicionar (mL)	Colágeno para adicionar (mL)	10 % DMEM (mL)	Trombina (μL)	Referências
1	10	2	2 x 106 células/mL	Fibrose	≥2	3	1	1	0.8	0.2	4	28; 29; 30
2	30	2	2 x 106 células/mL	Cirrose		6	2	0.75	0.8	0.45	3
3	40	2	2 x 106 células/mL	Hcc	≥10	10	3	0.25	0.8	0.95	1	28; 31; 32

Tabela 1: Descrição das formulações para células semeadas embutidas em hidrogéis em pastilhas

1. Prepare a solução de caldo hidróxido de sódio de 1 M adicionando 3,99 g de NaOH a 100 mL de dH₂O.  A solução pode então ser filtrada usando um filtro de seringa de 0,22 μm. Armazene a solução de estoque na RT.
2. Coloque o colágeno de 5 mg/mL e 10 mL de 1 M NaOH no gelo.
3. Pré-aqueça 50 mL PBS, 15 mL trypsin, 70 mL 10% DMEM, e solução de estoque fibrinogênico, preparada na seção 1, a 37 °C por 20 minutos em banho-maria.
4. Prepare as suspensões das células.
   1. Lave células estelares hepáticas (LX2) e carcinoma hepático (HepG2) em frascos de cultura T175 duas vezes com 10 mL de PBS.
   2. Células de trypsinize com trippsina de 6 mL por 4 min a 37 °C.
   3. Inativar trippsina com 6 mL de 10% de DMEM.
   4. Colete a suspensão celular em tubo de 15 mL e centrífuga por 3 min a 300 x g.
   5. Após a centrifugação, aspire o supernaspe e resuspenda cada linha celular em 5 mL de 10% DMEM.
   6. Conte as células usando um contador automático de células: Adicione 10 μL de cada suspensão celular ao slide da câmara de contagem e insira o slide no balcão da célula. A contagem de células é exibida como células/mL.
   7. Diluir as células de cada linha celular para 1 x 10⁶ células por mL usando a contagem de células na etapa 3.4.6 em tubos claramente marcados de 15 mL. Centrifugar as diluições por 3 min a 300 x g.
5. Após a centrifugação, aspire o supernasce e adicione 10% de DMEM a cada tubo de 15 mL de acordo com a Tabela 1, os valores fornecidos na Tabela são para 2 mL de cada formulação.
6. Neutralizar a quantidade de colágeno com 10 μL/mL NaOH (1 M), e adicionar o colágeno neutralizado à suspensão da célula, o presente de 10% DMEM ficará amarelo, uma vez que a suspensão é completamente misturada por pipetação com uma ponta de corte ele vai ficar um rosa brilhante.
7. Adicione fibrinogênio à suspensão da célula de colágeno de acordo com a Tabela 1, usando uma ponta de pipeta cortada, misture bem a suspensão.
8. Por fim, adicione trombina à suspensão de células de colágeno-fibrinogênio, trombina KIU de 0,1 KIU para cada 10 mg de fibrinogênio.
9. Remova as pastilhas invertidas pré-revestidas preparadas na seção 2 da incubadora e utilizando uma ponta de pipeta de 200 μL cortada, pipeta 200 μL da suspensão preparada nas pastilhas designadas. Deixe os géis atravessarem por 15 minutos dentro do capô de fluxo laminar.
10. Depois de 15 min, coloque suavemente a parte inferior da placa sobre os géis e mova-os para a incubadora para permitir que os géis cruzem a 37 °C por 45 min.
11. Uma vez que os géis tenham cruzado, inverta as pastilhas novamente e adicione 2 mL de 10% DMEM a cada um dos poços inferiores da placa.

4. Semeando células endoteliais

1. Solução de sal balanceada de 25 mL hanks (HBSS), 10 mL trypsin, 10 mL inibidor de trippsina e 50 mL de crescimento endotelial médio, até 37°C por 20 minutos em banho-maria .
2. Prepare a suspensão celular endotelial (HUVEC).
   1. Lave as células HUVEC em frascos de cultura T175 duas vezes com HBSS de 10 mL.
   2. Células de trypsinize com trippsina de 6 mL por 4 min a 37 °C. Inativar trippsina com inibidor de trippsina de 6 mL. Colete a suspensão celular em 15 mL de tubo e centrífuga por 3 min a 200 x g.
   3. Após a centrifugação aspirar o supernasciente e suspender as células em meio de crescimento endotelial de 5 mL.
   4. Conte as células como descrito anteriormente em 3.4.6 usando um contador de células automatizado.
   5. Usando a contagem de células do contador celular, prepare a densidade de semeadura de 1,0 x 10⁴ células/mL em meio de crescimento endotelial.
3. Semente 500 μL da suspensão da célula HUVEC em cada poço da parte superior da inserção para ter um volume final de 5,0 x 10³ células por inserção.

5. Manutenção

1. Substitua o meio de crescimento a cada dois dias, aspirado ao meio de crescimento gasto tanto do poço quanto da inserção. Adicione 2 mL 10% DMEM aos poços que contêm o gel e meio de crescimento endotelial de 0,5 mL às pastilhas que contêm as células HUVEC.
2. Mantenha o modelo por 21 dias antes da experimentação.

6. Reologia

1. Medir o moduli de armazenamento das formulações de gel para indicar valores de rigidez usando um reômetro, realizando varreduras de frequência de 0,1-20 Hz a 0,267% e 37°C, com uma força axial constante de 0,1N usando uma geometria de aço inoxidável de placa paralela de 8 mm de diâmetro.

7. Viabilidade e resposta a medicamentos

1. Determine a resposta e viabilidade da droga em co-culturas 2D e modelo 3D.
   1. Seed HepG2 (5.0 x 10³ células/mL) e LX2 (5,0 x 10³ células/mL) em uma proporção de 1:1 para a cocultura 2D em um fundo preto claro 96-well placas a uma densidade semeada de 1,0 x 10⁴ células/mL.  Permitir que as células se conectem durante a noite.
   2. Configure o modelo 3D para corresponder a um ambiente cirrótico com um valor de rigidez de 6 kPa.  Mantenha o modelo por 21 dias antes do tratamento com Doxorubicina.
2. Duas horas antes do tratamento da doxorubicina, aspire o meio de cultura tanto do modelo 2D quanto 3D. Lave os dois modelos duas vezes com PBS. Adicione o meio de fome (DMEM suplementado com solução antimíctica antimíctica de 1% v/v) à cocultura 2D (200 μL por poço) e ao modelo 3D (2 mL aos poços que contêm o hidrogel e 500 μL à inserção).
3. Administre a doxorubicina tanto no modelo 2D quanto no 3D.  As doses são as seguintes: 0,5, 1 e 1,5 mM correspondentes aos valores IC25, 50 e 75, respectivamente.  Trate ambos os modelos por 72 h.
   NOTA: A doxorubicina, inibidora de topoisomerase II, é uma das primeiras drogas quimioterápicas utilizadas para o HCC e também é um dos agentes quimioterápicos mais ativos no tratamento do HCC^33,34.
4. Após 72 h, média de cultura aspirada tanto do modelo 2D quanto 3D. Certifique-se de que qualquer meio de cultura restante seja removido lavando ambos os modelos duas vezes com PBS.
5. Prepare a AlamarBlue de acordo com as recomendações do fabricante e adicione aos poços do modelo 2D e 3D. Adicione 150 μL por poço para a cultura 2D e 2 mL por poço e 500 μL por inserção para cultura 3D.  Incubado durante a noite a 37°C.
6. Após a transferência de incubação 150 μL do AlamarBlue de cada poço da configuração 3D em uma placa de fundo claro preto de 96 poços. AlamarBlue pode ser lido diretamente da placa para o modelo 2D.
7. Leia a fluorescência com um leitor de microplaca no comprimento de onda de excitação e comprimento de onda de emissão de 485 e 550 nm, respectivamente.
8. Calcule a viabilidade celular percentual em ambos os modelos usando a seguinte fórmula:
   

Resultados

Faixas de concentração e volume de semeadura
A otimização do protocolo para obtenção do protocolo de funcionamento final ocorreu de acordo com o diagrama esquemático apresentado na Figura 3. Dois hidrogéis fisiologicamente relevantes, Colágeno tipo I e Fibrinogen, foram identificados por meio de pesquisa bibliologia^35,36.  Começando com o colágeno de cauda de rato tipo I, uma gama de concentrações (4, 3, 2 e 1 mg/mL) foi semeada em inserções invertidas para determinar sua capacidade de aderir com sucesso à inserção uma vez invertida novamente. Todas as concentrações dentro desta faixa foram capazes de formar géis, porém os géis de colágeno pareciam achatados e tinham várias bolhas de ar presas dentro deles por causa do manuseio e pipetação, ver Figura 4 e Figura 5. Para determinar o volume ideal de semeadura para melhorar a qualidade do gel de colágeno, uma gama de volumes de semeadura (100, 150 e 200 μL), foi semeada em pastilhas invertidas, ver Figura 5.  O volume de semeadura não teve influência no aparecimento do gel ou na presença de bolhas dentro do gel. Assim, decidiu-se que 200 μL era o volume de semeadura ideal produzindo os géis mais completos. A fibrinogen também foi avaliada por sua capacidade de produzir um gel que pudesse aderir a uma inserção por um período prolongado.  Foi preparada e semeada uma faixa de concentração (70, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1 mg/mL) e semeada a um volume de 200 μL na tampa de uma placa de 12 poços, ver Figura 6. Dentro de 20 min após semeadura todas as concentrações foram capazes de formar com sucesso um gel. No entanto, as concentrações 5 e 1 mg/mL foram excluídas, pois os géis formados tinham uma consistência fluida e começaram a se desprender da tampa após serem mantidos durante a noite a 37 °C.

Figura 3: Diagrama esquemático de otimização do protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Géis de colágeno 4 mg/mL contendo 1,0 x 10⁵ células/mL semeadas em pastilhas mostrando bolhas presentes no gel. A inserção à esquerda foi desgaseada no gelo por 15 minutos, enquanto a inserção à direita não foi desgaseada. A desgaseamento não teve qualquer efeito sobre as bolhas presentes nos géis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Géis de colágeno 4 mg/mL contendo 1,0 x 10⁵ células/mL semeadas em pastilhas em volumes variados. (A) Insira no esquerdo 100 μL, médio 150 μL e direito 200 μL, logo após a semeadura. Bolhas nos géis ainda estavam presentes. (B) Insira no 200 μL esquerdo, médio 150 μL e direito 100 μL, após 60 min crosslinking. Todos os géis, independentemente do volume, ainda parecem planos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Fibrinogen (200 μL) em uma faixa de concentração de 70 a 1 mg/mL semeada na tampa de uma placa de 12 poços. (A) Géis logo após a semeadura. (B) Géis 20 min após a semeadura. (C)Géis mantidos durante a noite. Todos os géis parecem bem arredondados, os géis de 5 mg/mL e 1 mg/mL foram excluídos, pois pareciam ter uma consistência mais fluida 20 min após a semeadura e começaram a se desprender da tampa depois de serem mantidos durante a noite. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Colágeno e fibrinogênio de combinação
Com base nos resultados da concentração de colágeno e fibrinogênio, foi avaliado o efeito da combinação do colágeno e fibrinogênio. Três pastilhas foram configuradas com o seguinte, colágeno de 4 mg/mL, fibrinogen de 20 mg/mL e uma ração 1:1 de colágeno (4 mg/mL) e fibrinogen (20 mg/mL), ver Figura 7. Logo após a semeadura dos hidrogéis, observamos que a inserção apenas com colágeno ainda tinha uma aparência plana combinada com a ocorrência de bolhas dentro do gel. As pastilhas com fibrinogênio produziram um gel completo e arredondado, assim como a inserção com a combinação de colágeno e fibrinogênio. Após a ligação cruzada a 37 °C por 60 min, todos os géis se fixaram na pastilha e permaneceram anexados após a incubação durante a noite a 37 °C.

Figura 7: Efeito da combinação de colágeno e fibrinogênio. (A) Colágeno 4 mg/mL semeado na inserção à esquerda, fibrinogen 20 mg/mL semeado na inserção no meio e colágeno 4 mg/mL, fibrinógeno 20 mg/mL (1:1 ração) semeado na inserção à direita. Todos os géis semeados em um volume de 200 μL contendo 1,0 x 10⁵ células/mL, todos os géis foram cruzados por 60 min a 37 °C.(B) Colágeno 4 mg/mL 60 min após crosslinking, gel parecia plano e tinha bolhas. (C) Insira no fibrinênio esquerdo 20 mg/mL, o gel apareça arredondado, sem bolhas presentes, insira no colágeno direito 4 mg/mL, fibrinogen 20 mg/mL gel, gel é bem arredondado sem bolhas. (D) Gel de colágeno 4 mg/mL depois de ser mantido durante a noite a 37 °C, o gel ainda continha uma grande quantidade de bolhas, algum inchaço do gel ocorreu. (E) Fibrinogen 20 mg/mL mantido durante a noite a 37 °C. (F) Colágeno 4 mg/mL, fibrinogen 20 mg/mL gel mantido durante a noite a 37 °C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Determinando a densidade de semeadura celular
Com base na experiência anterior de trabalhar com hidrogéis, foi configurado um experimento para determinar a densidade ideal de semeadura celular (dados não mostrados)³⁷. As células foram incorporadas em uma combinação de colágeno e fibrinogênio na seguinte faixa de concentração (7,5 x 10⁵, 8,5 x 10⁵, 9,5 x 10⁵, 1.0 x 10⁶, 1,5 x 10⁶ e 2,0 x 10⁶ células/mL), 2,0 x 10⁶ células/mL foi encontrada como a densidade ideal de semeadura.

Reologia
Dez formulações das combinações de hidrogel fibrinogênio e colágeno foram avaliadas por meio de reologia, ver Tabela 2. O objetivo era determinar qual dessas formulações poderia imitar a rigidez hepática vista durante o desenvolvimento do HCC. A literatura forneceu valores conhecidos de rigidez hepática para ratos, camundongos e seres humanos durante a fibrose, cirrose e HCC e o objetivo era chegar o mais próximo possível desses valores^{28,29,30,31,32}. As dez formulações estabelecidas na Tabela 2 foram preparadas em triplicado e o módulo de armazenamento de cada um foi determinado por meio de um reômetro, resultados mostrados na Figura 8.

Formulação	Fibrinogênio (mg/ml)	Colágeno (mg/ml)
1	60	2
2	50	2
3	40	2
4	30	2
5	20	2
6	10	2
7	20	5
8	20	4
9	20	3
10	20	1

Tabela 2: Combinações de colágeno e fibrinogênio em várias concentrações avaliadas com Reologia para determinar valores de rigidez

Figura 8: Valores de rigidez de hidrogel para combinações de colágeno e fibrinogênio em várias concentrações avaliadas com Reologia. O módulo de armazenamento e o módulo de perda foram determinados a 37 °C e 1Hz por meio de um Reômetro Híbrido Discovery HR-2 (n = 3, Barras de Erro = SD). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Dessas dez fórmulas, três foram escolhidas para prosseguir. Estes incluíram 2 mg/mL colágeno tipo I e fibrinogen de 10 mg/mL correspondentes aos valores de rigidez hepática no início da fibrose, 2 mg/mL de colágeno tipo I e fibrinogen de 30 mg/mL correspondente à cirrose e 2 mg/mL de colágeno tipo I e 40 mg/mL fibrinogen correspondente ao HCC, ver Figura 9.

Figura 9: Valores de rigidez de hidrogel para várias formulações de hidrogel fibrinogênio/colágeno escolhidos para continuar.  O módulo de armazenamento e o módulo de perda foram determinados a 37 °C e 1 Hz (n = 3, barras de erro = SD). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Viabilidade, resposta a medicamentos e potencial metastático
Os resultados do ensaio alamarblue mostraram uma viabilidade celular global reduzida dentro da cocultura 2D, menor do que o esperado com base nos valores conhecidos relatados ic 25, 50 e 75, quando comparado com o controle não tratado, ver Figura 10. Isso pode ser atribuído às células LX2 em nossa co-cultura que são mais sensíveis ao tratamento da Doxorubicina. No entanto, em nosso modelo 3D notamos e aumentamos a resistência à doxorubicina, confirmando a diminuição do potencial quimioterápico frequentemente visto em sistemas de modelos 3D. A significância estatística em relação aos controles foi avaliada utilizando-se o teste T Estudantil (duas caudas), com P<0,05 considerado significativo.

Figura 10: Viabilidade celular percentual de um modelo de cocultura 2D em comparação com o modelo 3D após o tratamento com Doxorubicina em várias concentrações por um período de 72h. Os resultados normalizados em relação ao controle não tratado (n=3, barras de erro = SD) (* = p<0,0001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os construtos de gel foram inspecionados visualmente diariamente usando um microscópio de luz para acompanhar o crescimento celular dentro de diferentes concentrações dos hidrogéis. As células encheram os hidrogéis de forma homogênea e compacta, a partir do dia 7 os esferoides começaram a se reunir dentro da matriz.

Discussão

Este protocolo descreve o desenvolvimento de um método para criar um modelo biomimético para hcc. Um fluxo de trabalho claro foi estabelecido e as etapas críticas envolvidas foram identificadas. Essas etapas críticas incluem a preparação da solução de estoque de fibrinogênio, o revestimento das pastilhas com colágeno e a semeadura das células embutidas no hidrogel. Durante a preparação da solução de estoque de fibrinogênio é importante adicionar o fibrinogênio em incrementos menores em concentrações mais altas. Isso não só reduzirá o tempo necessário para que o fibrinogênio se dissolva, mas também impedirá que o fibrinogênio de geleia de forma inconsistente e prematura, como visto na Figura 11. A preparação do gel de fibrinogênio leva um tempo considerável e isso pode influenciar o sucesso experimental global. Os resultados indicam que uma vez que o gel de fibrinogênio começa a gelar inconsistentemente é melhor descartá-lo. As pastilhas devem ser revestidas com colágeno, lavadas com PBS e secas dentro da coifa de fluxo laminar antes de semear as células embutidas em hidrogéis. A falha em garantir que as pastilhas estejam secas resultará no derramamento de hidrogéis sobre as bordas da pastilha, resultando em um gel irregular. A irregularidade do gel influenciará, em última análise, os resultados onde a difusão é um fator.

Figura 11: Preparação de gel de fibrinogênio para formulações de hidrogel fibrinogênio/colágeno. (A) Solução de gel de fibrinogen que formou aglomerados e começou a gelar prematuramente com fibrinogênio não resolvido aderindo ao tubo. (B) Solução de gel de fibrinogen que se dissolveu completamente, a solução é clara e ligeiramente mais viscosa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Recomenda-se trabalhar o mais rápido possível enquanto semeia a suspensão da célula de hidrogel nas pastilhas, pois o componente fibrinogênio começará a cruzar com a adição de trombina.  Prepare volumes de trabalho menores ao trabalhar com suspensões de gel em concentrações mais altas para evitar que o gel entre em tração cruzada durante a semeadura. Este último terá um efeito sobre a distribuição e a quantidade de gel semeado em cada poço. A ordem de adição dos componentes é fundamental, neste protocolo fornecemos um fluxo de trabalho simplificado para evitar que os géis cruzem prematuramente.  Devido à viscosidade da suspensão do gel de hidrogel que trabalha com uma ponta de pipeta cortada é aconselhável durante a mistura e medição.  Ao misturar a suspensão certifique-se de que isso seja feito de forma rápida e uniforme para criar uma suspensão homogênea. A mistura desigual resultará em um gel heterogêneo que afetará negativamente os resultados, ver Figura 12.

Figura 12: Géis de colágeno/fibrinogênio semeados em 12 placas de poço. Todos os géis semeados em um volume de 200 μL contendo colágeno de 2mg/mL e fibrinogen de 20 mg/mL com 2,0 x 10⁶ células/mL. (A) Gel de hidrogel com consistência heterogênea, distribuição irregular visível dos hidrogéis. (B) Hidrogels homogeneamente misturados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Após a otimização do protocolo, o modelo foi avaliado para determinar as propriedades biofísias dos modelos. Dados de reologia mostraram que nosso modelo, composto por componentes da matriz extracelular fisiologicamente relevantes, ou seja, colágeno tipo I e fibrinogênio, foi capaz de imitar as propriedades biofísicas de um fígado fibroso, cirrítmico e HCC^{28,29,30,31,32}. Recapitular a rigidez hepática em modelos 3D para HCC é de considerável importância e muitas vezes é negligenciado durante o desenvolvimento do modelo. O aumento da rigidez hepática está relacionado à resistência quimioterápica, à proliferação, migração e dormência no HCC³⁸. Enquanto a ativação de células estelares hepáticas no HCC está associada ao aumento da rigidez da matriz extracelular, com várias vias de sinalização associadas a essas células estelares hepáticas mostrando mecanosensibilidade³⁹.

A inclusão de células associadas ao estroma, como células estelares hepáticas e células endoteliais no desenvolvimento de modelos 3D para HCC, tornou-se cada vez mais relevante. Estudos mostram que esferoides multicelulares compostos por células estelares hepáticas e HCC resultaram em aumento da resistência quimioterápica e migração invasiva, ao mesmo tempo em que imitavam a aparência do tumor HCC in vivo, quando comparados a um modelo de camundongos PXT e amostras de tecido HCC humano¹⁷. Estudo semelhante de Jung et al., 2017 encontrou esferoide multicelular composto por células de carcinoma hepatocelular (Huh-7) e endotelial (HUVEC) promovida vascularização e agressividade²². Estes esferoides mostraram viabilidade em concentrações significativamente maiores de doxorubicina e sorafenib quando comparados com esferoides monocultura Huh-7²². A avaliação da viabilidade e resposta do nosso modelo à doxorubicina, com valores de rigidez correspondentes ao de HCC e a inclusão de células associadas ao stroma (LX2 e HUVEC), mostrou uma diminuição semelhante em resposta à quimioterapia quando comparada a um modelo de cocultura 2D.  Assim, imitando efetivamente a resistência medicamentosa tipicamente observada em pacientes e outros modelos 3D HCC.

Por se trata de um sistema modular, o modelo pode ser fortificado pela adição de outros componentes da matriz extracelular, ou seja, laminina e ácido hialurônico. Alternativamente, os hidrogéis atuais utilizados neste modelo podem ser substituídos por hidrogéis sintéticos, como alginato de sódio ou quitosan. Outras modificações no modelo atual podem ser a substituição das linhas celulares por culturas celulares primárias para produzir um modelo ainda mais fisiologicamente relevante ou usando combinações de outras linhas tumorais e células estromicas.

Desenvolvemos com sucesso um modelo 3D com propriedades biofísias tunable para estudar interações tumorais-estroma no HCC.  Descobrimos que nosso modelo é mais representativo da situação in vivo quando comparado com as culturas 2D tradicionais em resposta à doxorubicina. No entanto, ainda há muito a ser feito, esperamos caracterizar extensivamente esse modelo e explorar o modelo como uma possível plataforma metastática para responder a questões mais complexas e urgentes que permanecem no estudo HCC.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AlamarBlue (Resazurin sodium salt)	Sigma	211-500	Prepare according to manufacturesr recommendations
Antibiotic Antimycotic Solution (100×), Stabilized	Sigma	A5955-100ML
Aprotinin Protease Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	78432
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C1016-2.5KG	Anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0%
CO2 Incubator	Kebo Biomed Sweden
Corning Black, clear flat bottom 96-well plate	Sigma	CLS3904-100EA
Corning HTS Transwell-24 well permeable supports	Sigma	CLS3396-2EA	HTS Transwell-24 units w/ 0.4 μm pore polycarbonate membrane and 6.5 mm inserts, TC-treated, sterile, 2/cs
Discovery Hybrid Rheometer 2	TA instruments, Sollentuna, Sweden
DMEM, high glucose, GlutaMAX supplement (LX2 and HepG2 cells)	Thermo Fisher Scientific	61965059	Supplemented with 10% v/v FBS and 1% v/v antibiotic antimycotic solution
Endothelial Cell Growth Medium (500 ml) (HUVEC)	Cell Applications, Inc	211-500
Fetal Bovine Serum, qualified, One Shot format, New Zealand	Thermo Fisher Scientific	A3160902
Fibrinogen type I-S from bovine plasma	Sigma	F8630-10G
FLUOstar Omega plate reader	BMG Labtech
Hanks' balanced salt solution	Sigma	H9394-500ML	Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride and magnesium sulfate
Labogene scanspeed 416 centrifuge	Labogene, Sweden
Laminar flow hood	Kebo Biomed Sweden
Mettler Toledo AG245 Analytical Balance	Mettler Toledo
Nikon TMS Light microscope	Nikon, Japan
Phosphate buffered saline tablet	Sigma	P4417-100TAB	Prepare according to manufacturers recommendation
Rat tail Collagen Type I 5 mg/mL	Ibidi	50201
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S7653-1KG
Sodium Hydroxide (NaOH)	Merck	B619298
TC20 Automated cell counter	BioRad
TC20 cell counter counting slides	BioRad
Thrombin from bovine plasma	Sigma	T9549	Powder, suitable for cell culture, ≥1,500 NIH units/mg protein (E1%/280 = 19.5)
Trypsin (2.5%) 10x	Thermo Fisher Scientific		Dilute to 1x in PBS
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)	Sigma	T6414-100ML	Solution, sterile-filtered