Geração livre de células neuronais derivadas do sangue

Resumo

Apresentamos um método geneticamente livre de modificações (livre de GM) para obter células com um fenótipo neuronal de células sanguíneas periféricas reprogramadas. A ativação de uma via de sinalização ligada à nova proteína ligada ao GPI humano revela um método eficiente livre de GM para a obtenção de células-tronco pluripotentes humanas.

Resumo

Muitas doenças neurológicas humanas são causadas pela degeneração de neurônios e células gliais no cérebro. Devido a limitações em estratégias farmacológicas e outras terapêuticas, atualmente não há cura disponível para o cérebro ferido ou doente. A substituição celular aparece como uma estratégia terapêutica promissora para condições neurodegenerativas. Até hoje, as células-tronco neurais (NSCs) foram geradas com sucesso a partir de tecidos fetais, células embrionárias humanas (ES) ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC). Um processo de desdiferente foi iniciado pela ativação da nova glicoproteína ligada ao GPI humano, que leva à geração de células-tronco pluripotentes. Essas células-tronco pluripotentes derivadas do sangue (BD-PSCs) diferenciam in vitro em células com um fenótipo neural, como mostrado por microscopia de campo brilhante e imunofluorescência. A análise ultraestrutural dessas células por meio da microscopia eletrônica confirma sua estrutura primitiva, bem como morfologia neuronal e características subcelulares.

Introdução

O desenvolvimento de métodos básicos e pré-clínicos de pesquisa de células-tronco incentiva a aplicação clínica de terapias baseadas em células-tronco para doenças neurológicas. Tal terapia potencial depende criticamente do método de geração de células neurais humanas que leve à recuperação funcional¹.

As células-tronco neurais (NSCs) se auto-renovam e se diferenciam em novos neurônios ao longo da vida em um processo chamado neurogênese adulta. Apenas áreas cerebrais muito restritas abrigam NSCs competentes para gerar neurônios recém-nascidos na idade adulta. Tais NSCs podem dar origem a neurônios maduros, que estão envolvidos no aprendizado e na memória, substituindo assim neurônios perdidos ou danificados. Infelizmente, essas NSCs estão presentes em quantidades restritas e essa neurogênese limitada diminui rapidamente durante o desenvolvimento juvenil². Portanto, outras fontes de células neurais devem ser consideradas em um objetivo de terapia celular.

Doenças neurológicas degenerativas são difíceis de curar usando abordagens farmacológicas padrão. Novas estratégias terapêuticas para abraçar muitas doenças neurológicas imensuráveis são baseadas em terapias de substituição celular de tecido doente e ferido. O transplante de NSC pode substituir células danificadas e fornecer efeitos benéficos. Outras fontes para a substituição de células neurais incluem células-tronco embrionárias humanas (ESC), que são derivadas da massa celular interna dos blastocistos^3,bem como iPSCs^4,que têm ampla capacidade de auto-renovação como eSCs e são capazes de se diferenciar em várias linhagens celulares. Os NSCs também podem ser gerados pela reprogramação direta de fibroblastos humanos evitando o estado pluripotente⁵.

A terapia de reposição celular ainda é uma questão desafiadora. Embora a ESC, fetal ou iPS possa ser uma fonte para a geração de células neuronais para o tratamento de muitas doenças neurológicas incuráveis, a substituição celular de SCs adultos autólogos de tecidos danificados é uma alternativa melhor que contorna preocupações imunológicas, éticas e de segurança.

Ativação da proteína ligada ao GPI humano por ligação de anticorpos via fosforilação de PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN inicia uma dediferenciação de células progenitoras sanguíneas e geração de células-tronco pluripotentes derivadas do sangue (BD-PSCs)⁶. Essas células se diferenciam in vitro em relação às células neuronais, como confirmado por meio de análise de campo brilhante, imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão (TEM).

Neste trabalho descrevemos a geração livre de BD-PSCs e sua diferenciação bem sucedida em células com fenótipo neuronal.

Protocolo

As aprovações éticas foram obtidas na realização dos experimentos.

1. Isolamento das células mononucleares de sangue periféricos humanos (PBMNCs)

1. Certifique-se de que todos os doadores assinaram consentimento informado antes da retirada de sangue em conformidade com as diretrizes institucionais.
2. Tome 30 mL de sangue de doadores saudáveis por pessoal médico treinado de acordo com o protocolo padrão.
3. Isole pbmncs por mídia gradiente de densidade. Use 10 mL de mídia com 25 mL de 1:1 sangue diluído com soro fisiológico tampão de fosfato (PBS) e centrífuga a 300 x g por 30 min.
4. Isole a camada interfase entre o plasma e a mídia gradiente de densidade por pipetação. Lave as células isoladas com 5 mL de PBS estéril e centrífuga a 300 x g por 10 minutos. Repita duas vezes.
5. Conte o número de células por métodos padrão usando uma câmara de contagem.

2. Ativação da glicoproteína ancorada em GPI humano por anticorpos interligados na superfície dos PBMNCs

1. Coloque as células mononucleares 6 x^{10 6} (MNCs) em tubos de 15 mL e realize a interligação de anticorpos incubando as células com anticorpo específico de proteína de membrana ligada ao GPI humano (30 μg/mL) por 30 minutos em PBS com 1% de albumina de soro bovino (BSA) a 37 °C.
2. Substitua o meio de incubação pelo meio modificado de Dulbecco da Iscove, suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS).
3. Cultivar células em tubos de poliestireno de 15 mL, colocar os tubos em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO₂ por 8-10 dias (sem tremer). Em D5, adicione um adicional de 1-2 mL do meio da Iscove complementado com 10% de FBS a cada tubo de 15 mL.

3. Classificação de células dediferentes recém-geradas

1. Conte células com um contador celular automatizado (suspensão celular de 18 μL + corante de fluorescência de 2 μL) ou em uma câmara de contagem.
2. Suspensão de célula cultivada centrífuga (5-7 x 10⁶) a 300 x g por 10 min e aspirar o supernante resultante com uma pipeta Pasteur estéril.
3. Suspenda a pelota celular em 90 μL de PBS pH pré-resfriado 7,2, 0,5% BSA e 2 mM EDTA.
4. Adicione contas magnéticas de nano-tamanho positivo CD45 (80 μL) à suspensão celular e incubar no gelo por 15 minutos.
5. Lave as células adicionando 2 mL de tampão PBS e centrífuga a 300 x g por 10 min.
6. Suspenda as células em 500 μL de buffer PBS.
7. Lave a coluna com 500 μL de tampão PBS pré-resfriado e coloque-a no campo magnético.
8. Coloque a suspensão celular na coluna e lave-a com 500 μL de tampão PBS (duas vezes) e o fluxo de centrífuga contendo células CD45 negativas. Recolhê-los no meio de Iscove complementado com 1% de BSA.
9. Conte as células na câmara de contagem.

4. Preparar pratos de cultura celular para diferenciação neuronal de células-tronco recém-geradas

1. Cubra os vasos de cultura com poli-L-ornithine e laminina para o crescimento de células neuronais.
2. Coloque as tampas de vidro em placas de 4 poços e cubra-as com 1:5 poli-L-ornithine diluída (0,1 mg/mL em ddH₂O) em ddH₂O. Coloque as tampas em uma incubadora de 37 °C por 1 h. Em seguida, lave com ddH₂O.
3. Descongele lentamente laminina (0,5-2,0 mg/mL) e adicione ao topo das tampas. Incubar a 37 °C por 2 h.
4. Prepare o meio de indução neural N2 composto por 49 mL de D-MEM/F12, 500 μL de suplemento N2, 400 μL de aminoácidos não essenciais (NEAA), solução básica de FGF a 20 ng/mL de concentração final (preparada a partir de 100 μg/mL solução de estoque) e heparina em 2 ng/mL de concentração final.
5. Remova o excesso de laminina por pipetação e adicione n2 médio neuronal aos pratos de cultura.

5. Cultivo de células sanguíneas dediferentes neuronais

1. Cultura CD45 células negativas derivadas de BD em tampas de vidro revestidas de laminina/ornitina por 2 dias em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO₂ no meio N2 para iniciar uma diferenciação neuronal de células recém-geradas por BD.
2. Células de cultura ainda em meio de diferenciação neuronal consistindo de 48 mL de meio neurobásal, 500 μL de L-glutamina, 1 mL de Suplemento B27, 500 μL de NEAA, 50 μL de fator neurotrófico recombinante derivado do glial humano (GDNF) a 5 μg/250 μL em PBS/0,1% BSA, e 50 μL de cérebro humano recombinante fator neurotrófico derivado (BDNF) a 5 μg/200 μL em PBS/0,1% BSA e 50 μL de solução de ácido ascórbico 2,9 g/50 mL em PBS. Coloque as placas em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO₂.

6. Análise de microscopia de imunofluorescência de células neurais derivadas do sangue

1. Cultue as células como descrito acima por 16 dias e remova a mídia.
   1. Incubar com fixação pré-aquecida composta por 75 mL de água estéril, 4 g de paraformaldeído. Adicione 10 N NaOH conforme necessário e mexa até que a solução se limpe. Em seguida, adicione 10 mL de PBS 10x, 0,5 mL de MgCl_2, 2 mL de 0,5 M EGTA e 4 g de sacarose. Titrate para pH 7.4 com 6 N HCl, e leve a 100 mL de água estéril por 15 min, de acordo com Marchenko et al.⁷.
   2. Descarte o fixador e lave as células 3 vezes por 5 minutos cada vez. Adicione imediatamente uma solução Triton X de 0,3% recém-feita e permeabilize as células por 5 minutos. Lave 3 vezes com PBS e adicione uma solução de bloqueio feita pela PBS e 5% BSA.
   3. Bloqueie as células à temperatura ambiente em uma placa de roqueiro por 1 hora.
   4. Prepare a diluição apropriada dos anticorpos em 1% BSA/PBS e incuba as células com diluições de anticorpos na placa de roqueiro por 1,5 h à temperatura ambiente. Lave as células 3 vezes com PBS por 5 minutos cada, incuba as células com DAPI e monte as tampas com mídia de montagem para visualização em um microscópio.
      NOTA: Os anticorpos diretamente rotulados utilizados neste experimento estão listados na Tabela de Materiais.

7. Análise de microscopia eletrônica de transmissão de células recém-geradas

1. Seme as células para TEM em lâminas de câmara de 8 poços.
2. Fixar as células em 3,5% glutaraldeído por 1 h a 37 °C, pós-fixação em 2% OsO₄ por uma hora adicional à temperatura ambiente e manchar em acetato de uranyl de 2% no escuro a 4 °C por 2 h 30 min.
3. Finalmente, enxágüe as células em água destilada, desidrate-a em etanol e incorpore resina epóxi durante a noite. No dia seguinte, transfira as amostras para um forno de 70 °C por 72 h para endurecimento de resina.
4. Retire as culturas celulares incorporadas do deslizamento de câmara e cola para blocos de araldito.
5. Corte seções semifinais em série (1,5 μm) com uma máquina, monte em lâminas de vidro e manche levemente com 1% de azul toluidina.
6. Cole seções semifinas selecionadas para blocos de araldito e desvinculá-las do deslizamento de vidro por congelamento repetido (em nitrogênio líquido) e descongelamento.
7. Prepare seções ultrathinas (0,06-0,08 μm) com uma máquina e contraste ainda maior com citrato de chumbo.
8. Obtenha micrografias usando microscópio de varredura eletrônica com câmera digital.

Resultados

Os resultados fornecem evidências de que este novo método livre de GM é capaz de reverter células progenitoras de sangue para seu estado mais primitivo sem agir diretamente sobre o genoma humano.

Já mostramos anteriormente que o crosslinking de anticorpos específicos ligados ao GPI inicia-se via PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN upregulation de genes altamente conservados de desenvolvimento relevantes como WNT, NOTCH e C-Kit, iniciando assim um processo de desdiferenteização que leva a...

Discussão

O método não-GM de reprogramação de células humanas descrito neste trabalho baseia-se na ativação da membrana ao núcleo de máquinas de sinalização por trás da glicoproteína de membrana humana ligada ao GPI que inicia o processo de desdiferenciação levando à geração ex vivo e à expansão de PSCs auto-renovados obtidos a partir de sangue periférico humano não manipulado. Essas células quando cultivadas em meios apropriados são capazes de se diferenciar em células pertencentes a diferentes c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin Fraction V	Roth	T8444.4
Anti-GFAP Cy3 conjugate	Merck Millipore	MAB3402C3
Anti-MAP2 Alexa Fluor 555	Merck Millipore	MAB3418A5
Anti-Nestin Alexa Fluor 488	Merck Millipore	MAB5326A4
Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488	BD Pharmingen	560381
AO/PI Cell Viability kit	Biozym	872045	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes	Sigma Aldrich	A8960-5G
B27 Serum free 50x	Fisher Scientific (Gibco)	11530536
Basic FGF solution	Fisher Scientific (Gibco)	10647225
Biocoll	Merck Millipore	L6115-BC	density gradient media
BSA Frac V 7.5%	Gibco	15260037
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-045-801	nano-sized magnetic beads
Cell counting slides Luna	Biozym	872010	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Chamber Slides Lab-Tek	Fisher Scientific	10234121
D-MEM/F12	Merck Millipore	FG4815-BC
Durcupan	Sigma Aldrich	44610	epoxy resin
FBS	Merck Millipore	S0115/1030B	Discontinued. Available under: TMS-013-B
GDNF recombinant human	Fisher Scientific (Gibco)	10679963
GlutaMax 100x	Gibco	35050038	L-glutamine
Glutaraldehyde grade	Sigma-Aldrich	G5882-50ML
Heparin sodium cell	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Human BDNF	Fisher Scientific (Gibco)	11588836
Iscove (IMDM)	Biochrom	FG0465
Laminin mouse	Fisher Scientific (Gibco)	10267092
Lead citrate	Sigma-Aldrich	15326-25G
Luna FL Automated Cell Counter	Biozym	872040	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
MACS Buffer	Miltenyi	130-091-221
MEM NEAA 100x	Gibco	11140035
MiniMACS Trennsäulen	Miltenyi	130-042-201
Morada digital camera	Olympus
Multiplatte Nunclon 4 wells	Fisher Scientific	10507591
N2 Supplement 100x	Fisher Scientific (Gibco)	11520536
Neurobasal Medium	Gibco	10888022
PBS sterile	Roth	9143.2
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957-50ML
Super Glue-3 Loctite	Henkel
TEM FEI Technai G2 Spirit	FEI Europe
Ultracut UC-6	Leica
Uranyl acetate C	EMS	22400