Dosimetria para Irradiação Celular usando instalações de raios-X ortovoltage (40-300 kV)

Resumo

Este documento descreve um novo protocolo de dosimetria para irradiações celulares usando equipamentos de raio-X de baixa energia. As medições são realizadas em condições que simulam condições reais de irradiação celular, tanto quanto possível.

Resumo

A importância dos protocolos de dosimetria e normas para estudos radiobiológicos é evidente. Vários protocolos foram propostos para a determinação de doses usando instalações de raios-X de baixa energia, mas dependendo das configurações de irradiação, amostras, materiais ou qualidade do feixe, às vezes é difícil saber qual protocolo é o mais adequado para empregar. Propomos, portanto, um protocolo de dosimetria para irradiações celulares usando instalações de raios-X de baixa energia. O objetivo deste método é realizar a estimativa de dose ao nível da monocamada celular para torná-la o mais próxima possível das condições reais de irradiação celular. As diferentes etapas do protocolo são as seguintes: determinação dos parâmetros de irradiação (alta tensão, intensidade, recipiente celular etc.), determinação do índice de qualidade do feixe (casal de camadas de meio valor de alta tensão), medição da taxa de dose com câmara de ionização calibrada em condições de kerma de ar, quantificação da atenuação e dispersão do meio de cultura celular com filmes radiocromômicos EBT3, e determinação da taxa de dose no nível celular. Esta metodologia deve ser realizada para cada nova configuração de irradiação celular, pois a modificação de apenas um parâmetro pode impactar fortemente a deposição real da dose ao nível da monocamada celular, particularmente envolvendo raios-X de baixa energia.

Introdução

O objetivo da radiobiologia é estabelecer vínculos entre a dose entregue e os efeitos biológicos; a dosimetria é um aspecto crucial no desenho de experimentos radiobiológicos. Há mais de 30 anos, destacam-se a importância das normas de dosimetria e a harmonização das práticas^1,2,3,4,5. Para estabelecer uma referência de taxa de dose, existem vários protocolos^6,7,8,9,10; no entanto, como mostra Peixoto e Andreo¹¹ , pode haver diferenças de até 7% dependendo da quantidade dosimétrica utilizada para a determinação da taxa de dose. Além disso, mesmo que existam protocolos, às vezes é difícil saber qual protocolo é o mais adequado para uma determinada aplicação, se houver, pois a taxa de dose para as células depende de parâmetros como o recipiente celular, quantidade de mídia de cultura celular ou qualidade do feixe, por exemplo. A dispersão e o retrocesso para este tipo de irradiação também é um parâmetro muito importante a ser leve em conta. De fato, para raios-X de baixa e média energia, no protocolo de referência AAPM TG-61¹⁰, a dose absorvida na água é medida na superfície de um fantasma da água. Levando-se em conta as condições de irradiação celular muito específicas, o pequeno volume de mídia de cultura celular cercada pelo ar está mais próximo das condições de kerma do que aquelas definidas para uma dose absorvida com um fantasma equivalente de água grande como no protocolo TG-61. Por isso, optamos por usar o kerma na água como uma quantidade dosimétrica para referência em vez da dose absorvida na água. Assim, estamos propondo uma nova abordagem para proporcionar uma melhor determinação da dose real entregue às células.

Além disso, outro aspecto crucial para os estudos radiobiológicos é a comunicação completa dos métodos e protocolos utilizados para a irradiação, a fim de poder reproduzir, interpretar e comparar resultados experimentais. Em 2016, Pedersen et al.¹² destacaram o relato inadequado de dosimetria em estudos radiobiológicos pré-clínicos. Um estudo mais recente de Draeger et al.¹³ destacou que, embora alguns parâmetros de dosimetria, como a dose, energia ou tipo de fonte, sejam relatados, grande parte dos parâmetros de física e dosimetria essenciais para replicar adequadamente as condições de irradiação estão faltando. Esta revisão em larga escala, de mais de 1.000 publicações abrangendo os últimos 20 anos, mostra uma falta significativa do relato das condições físicas e de dosimetria em estudos radiobiológicos. Assim, uma descrição completa do protocolo e do método utilizado em estudos radiobiológicos é obrigatória para ter experimentos robustos e reprodutíveis.

Levando em conta esses diferentes aspectos, para os experimentos radiobiológicos realizados no IRSN (Instituto de Proteção contra Radiação e Segurança Nuclear), foi implementado um protocolo rigoroso para irradiações celulares em uma instalação de ortovoltagem. Este protocolo de dosimetria foi projetado para simular as condições reais de irradiação celular tanto quanto possível e, assim, determinar a dose real entregue às células. Para isso, todos os parâmetros de irradiação estão listados, e o índice de qualidade do feixe foi avaliado medindo a camada de meio valor (HVL) para a qual algumas adaptações foram feitas como as recomendações padrão do protocolo AAPM¹⁰ não podem ser seguidas. A medição da taxa de dose absoluta foi então realizada com a câmara de ionização dentro do recipiente celular utilizado para irradiações celulares, e a atenuação e a dispersão dos meios de cultura celular também foram quantificadas com filmes radiocromômicos EBT3. Como a modificação de apenas um parâmetro do protocolo pode impactar significativamente a estimativa da dose, uma dosimetria dedicada é realizada para cada configuração de irradiação celular. Além disso, o valor de HVL deve ser calculado para cada combinação de filtro de tensão. Neste presente trabalho, são utilizadas uma tensão de 220 kV, uma intensidade de 3 mA e uma filtragem inerente e adicional de 0,8 mm e 0,15 mm de berílio e cobre, respectivamente. A configuração de irradiação celular escolhida está em um frasco T25, onde as células foram irradiadas com 5 mL de mídia de cultura celular.

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Protocolo

1. Plataforma de irradiação e determinação de parâmetros de irradiação

1. Use uma plataforma de irradiação que ofereça raios-X de baixa a média energia. Determine os parâmetros do experimento para garantir a robustez e a reprodutibilidade do experimento radiobiológico: Alta tensão, Intensidade, Filtração (inerente e adicional), Camada de Meio Valor (HVL), Energia efetiva, Detector usado para medições de dosimetria, Distância da Amostra de Origem (SSD), campo de irradiação (forma, tamanho, geometria), quantidade de dosimetria, método de dosimetria, taxa de dose, recipiente celular e quantidade de mídia de cultura celular. Todos os parâmetros utilizados neste protocolo são dados na Tabela 1.

2. Índice de qualidade do feixe: determinação da camada de meio valor

NOTA: O HVL é definido como a espessura de um atenuante (geralmente cobre ou alumínio) para reduzir a intensidade do feixe em um fator de dois em comparação com o valor original.

1. Configure o equipamento (suporte, colisimador, diafragma, ionização) dentro do gabinete de irradiação seguindo as instruções na Figura 1. Nenhum material atenuador é usado nesta etapa.
2. Certifique-se de que todas as distâncias relatadas na Figura 1 estão corretas. Meça isso com uma fita métrica.
3. Coloque a câmara de ionização na posição horizontal. Para este trabalho, utilizamos uma câmara de ionização cilíndrica 31002 (equivalente a 31010) calibrada em kerma de ar.
4. Pré-irradie a câmara de ionização por 5 min e meça o fundo (esta etapa pode ser realizada sem um collimador).
5. Realize 10 medições de 1 min cada modo de coleta responsável correspondente ao valor_bruto M (em coulombs).
6. Leve a temperatura e a pressão com equipamentos calibrados adequados colocados dentro do gabinete de irradiação em nosso caso (se não for possível, coloque-o perto do experimento). Corrija a leitura_bruta M no eletrometro pelo fator de correção de temperatura e pressão dado da seguinte forma:
   
   onde: T (°C) e P (hPa) são a temperatura e pressão reais, respectivamente. T_ref e P_ref são a temperatura de referência e pressão quando a ionização foi calibrada pelo laboratório de normas. A pressão e a temperatura devem ser medidas com instrumentos calibrados. O valor obtido no modo de carga é o valor médio de referência M (em coulombs).
   NOTA: Esta etapa não é estritamente necessária para a medição de HVL, mas é recomendada.
7. Coloque um atenuante de certa espessura acima do diafragma. O conjunto HVL é composto de folhas com espessuras diferentes (0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 5 e 10 mm de cobre) com uma dimensão que permite cobrir todo o feixe (80 x 80 mm aqui).
8. Faça uma medição de 1 min (M_cru corrigido pelo K_T,P como descrito anteriormente).
   1. Se a taxa de dose for dividida por um fator de 2 em relação ao valor inicial, o valor de HVL é encontrado. Faça 5 medições de 1 minuto para estimar a taxa média de dose.
   2. Se a taxa de dose não for dividida por um fator de 2 em relação ao valor inicial, aumente ou diminua a espessura do atenuante e faça outra medição. Ajuste a espessura do atenuador conforme necessário.
9. Uma vez encontrada a espessura do atenuante que diminui a intensidade do feixe por um fator dois, faça 5 medições de 1 min para confirmar o HVL.
   NOTA: Na maioria dos casos, a espessura exata do atenuador não pode ser encontrada a partir das folhas disponíveis. Neste caso, prossiga por biseção e interpole o HVL.

3. Avaliação do campo de irradiação (sem estimativa de dose)

1. Coloque uma filme EBT3 no suporte usado para irradiação.
2. Irradie este filme para obter um campo de irradiação bem marcado (pelo menos 2 Gy).
3. Escaneie o filme EBT3 usando um scanner dedicado.
4. Plote o perfil de dose usando a imagem J usando a opção Analisar e, em seguida, Plot Profile (Figura 2).
5. Determine o tamanho do uso do campo de irradiação para irradiação (área homogênea, excluindo regiões penumbra, ver Figura 2).
6. Faça marcas no suporte usado para irradiação para garantir que o recipiente de célula esteja na posição certa.
   NOTA: Nesta etapa, o tamanho do campo de irradiação é determinado, e a dose não é estimada. O procedimento completo para leitura e análise de filmes é dado na seção 5. Além disso, tome as margens para evitar erros devido ao posicionamento do recipiente celular.

4. Medição da taxa de dose com câmara de ionização

1. Pegue o recipiente de célula e quebre uma pequena parte na lateral ou na parte inferior (dependendo do recipiente específico e da câmara de ionização utilizada) para poder colocar a câmara de ionização dentro(Figura 3,seção superior) ou abaixo(Figura 3, seção inferior) do recipiente. Os exemplos são dados na Figura 3 com diferentes câmaras de ionização (cilíndrico ou plano paralelo) e recipientes celulares. Neste caso, foi utilizado um frasco T25(Figura 3, caixa vermelha).
   NOTA: um ferro de solda ou bisturi aquecido é uma boa alternativa para fazer furos em plástico
2. Coloque o recipiente dentro do compartimento no suporte utilizado para irradiação (placa de carbono aqui).
3. Coloque a câmara de ionização no recipiente (Figura 3, caixa vermelha), na posição correta e conecte-a ao eletrometro.
4. Certifique-se de que todos os parâmetros de irradiação listados na seção 1 estão corretos (alta tensão, intensidade, filtrações adicionais, distância da amostra de origem, etc.).
5. Pré-irradie a câmara de ionização por 5 min e realize o zering do eletrometro.
6. Faça 10 medições de 1 min para determinar a taxa média de dose no kerma de ar (Gy.min^-1). Calcule a determinação da taxa de dose no_ar K da seguinte forma:
   
   onde M é a leitura do dosemetro corrigido pela temperatura, pressão, efeito polaridade, recombinação de íons e calibração eletrométrica. N_Kair e K_q são os fatores de calibração e correção para a qualidade da radiação, cujos valores são específicos para cada câmara de ionização.

5. Medição da atenuação e dispersão da mídia de cultura celular

NOTA: Manuseie filmes EBT3 com luvas durante todo o procedimento.

1. Preparação do experimento
   1. Corte pequenas peças de filmes EBT3 pelo menos 24 h antes da irradiação.
   2. Determine o tamanho dos filmes em função do recipiente celular usado para experimentos de radiobiologia (4 x 4 cm para um frasco T25, por exemplo).
      Corte dois conjuntos de filmes radiocrômicos: Um conjunto para as curvas de calibração compostas por três peças de filme radiocrômico EBT3 por dose ou ponto de tempo (nove pontos no total para este trabalho) ; e um conjunto para a quantificação da atenuação da mídia da cultura celular, também três peças por ponto.
   3. Numerar todos os filmes para identificação (canto superior direito aqui) e escaneá-los na mesma posição no scanner.
   4. Mantenha os filmes longe da luz.
   5. Prepare o recipiente de celular usado para as medições da película EBT3 e, se necessário, corte uma peça para colocar o filme dentro (um exemplo com um T25 é dado na Figura 4).
2. Estimativa da taxa de dose
   1. Meça a taxa de dose para a configuração conforme descrito na seção anterior.
   2. Mantenha esta configuração no lugar para a irradiação das filmes radiocrômicos EBT3 e use o mesmo tipo de recipiente celular.
3. Construção da curva de calibração
   1. Pegue os filmes EBT3 pré-cortados para a curva de calibração.
   2. Não irradie três peças (0 Gy).
   3. Coloque a primeira película dentro do recipiente celular, na mesma configuração da irradiação celular.
   4. Irradie-o para obter os pontos da primeira dose.
   5. Repita esta operação para obter três peças de filmes EBT3 irradiados com a mesma dose.
   6. Realize isso para cada ponto de dose (nove pontos de dose neste trabalho (0, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 2,5 e 3 Giros) conforme ilustrado na Figura 5).
4. Avaliação da atenuação dos meios de cultura celular e dispersão.
   1. Escolheu o mesmo tempo de irradiação para todas as irradiações (60 s, por exemplo).
   2. Irradiar três peças de filmes EBT3 no recipiente sem água.
   3. Irradie três peças de filmes EBT3 no recipiente com água da seguinte forma.
      1. Coloque o filme dentro do recipiente.
      2. Encha o recipiente com a quantidade exata de água para representar a mídia de cultura celular (5 mL aqui). Use pequenos pedaços de fita se os filmes não permanecerem submersos corretamente.
      3. Coloque o recipiente de célula dentro do compartimento e certifique-se de que o filme está corretamente imerso.
      4. Quando a irradiação estiver completa, pegue os filmes EBT3, seque-os com papel absorvente e armazene-os longe da luz.

6. Leitura de filmes radiocrômicos EBT3

1. Leia filmes EBT3 pelo menos 24 horas após a irradiação.
2. Escaneie os filmes em um scanner dedicado.
3. Defina os parâmetros do scanner como: formato de tiff vermelho-verde-azul de 48 bits, 150 dpi no modo de transmissão e sem correção de imagem.
4. Realize um aquecimento do scanner da seguinte forma.
   1. Coloque uma filme não irradiado no scanner.
   2. Inicie uma prévia da varredura.
   3. Lance um temporizador e espere por 30 s.
   4. Inicie a varredura.
   5. No final da varredura, inicie um temporizador e espere por 90 s.
   6. Ao mesmo tempo, registre a varredura, abra a imagem com ImageJ, trace um ROI quadrado (sempre do mesmo tamanho e na mesma posição) e faça uma medição do nível médio de pixel vermelho da área.
   7. No final dos anos 90, repita o procedimento a partir da etapa 2 (sem tocar no filme dentro do scanner).
   8. Repita isso pelo menos 30 vezes para aquecer e estabilizar o scanner (sem variações no nível médio de pixel vermelho da área selecionada nas películas não irradiadas). Se o scanner, ou seja, o valor médio do pixel vermelho, não estiver estabilizado, continue o procedimento.
5. Digitalização dos filmes do EBT3
   1. Coloque o primeiro filme no centro da cama do scanner. Delimitar uma área para sempre colocar o filme no mesmo lugar e na mesma orientação.
   2. Inicie uma prévia da varredura.
   3. Lance um temporizador e espere por 30 s.
   4. Inicie a varredura.
   5. No final da varredura, inicie um temporizador e espere por 90 s. Durante esses anos 90 muda o filme EBT3.
      NOTA: Uma análise dos filmes radiocromômicos EBT3 foi realizada por meio de um programa C++. auto-programado. Diferentes métodos podem ser usados para a análise de filmes EBT3, como o método do canal vermelho ou o método de três canais^14,15. Neste caso, usamos o método do canal vermelho sem subtração de fundo, e as imagens foram convertidas em densidades ópticas e, em seguida, para a dose usando nosso programa. Como esse método já está bem definido, nosso programa C++ não foi incluído aqui. Além disso, o software dedicado¹⁶ também pode ser usado para análise de filmes EBT3.

7. Determinação da taxa de dose ao nível da monocamada celular

1. Converta a taxa média de dose obtida com a câmara de ionização corrigida pela atenuação e dispersão da mídia de cultura celular (K) para o kerma de água utilizando a razão do coeficiente médio de absorção de energia de massa para água ao ar avaliado sobre o espectro de fluência de fótons (μ_en/ρ).
   
   Um software dedicado¹⁷ foi usado para calcular o espectro de energia de fótons no ar sem fantasma, e usamos a tabela NIST¹⁸ para calcular o coeficiente médio de absorção de energia em massa.

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Resultados

Neste trabalho, utilizamos uma plataforma dedicada à irradiação de animais de pequeno porte¹⁹; no entanto, essa plataforma pode ser usada para irradiar outros tipos de amostras, como células. A fonte de irradiação é um tubo de raios-X Varian (NDI-225-22) com uma filtragem inerente de 0,8 mm de berílio, um grande tamanho de esporte focal de 3 mm, uma faixa de alta tensão de cerca de 30 a 225 kV e uma intensidade máxima de 30 mA.

Os parâmetros utilizados para e...

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Discussão

Este trabalho apresenta o protocolo utilizado e implementado para irradiações celulares utilizando instalações de raios-X de baixa energia. Atualmente, muitos experimentos de radiobiologia são realizados com esse tipo de irradiador, pois são fáceis de usar, econômicos e com pouquíssimas restrições de radioproteção, em comparação com a fonte de cobalto, por exemplo. Embora essas configurações tenham muitas vantagens, pois usam uma fonte de energia de raios-X baixa, uma modificação de apenas um parâmetr...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
31010 ionization chamber	PTW	ionization Radiation, Detectors including code of practice, catalog 2019/2020, page 14	https://www.ptwdosimetry.com/fileadmin/user_upload/DETECTORS_Cat_en_16522900_12/blaetterkatalog/index.html?startpage=1#page_14
EBT3 radiochromic films	Meditest	quote request	https://www.meditest.fr/produit/ebt3-8x10/
electrometer UNIDOSEwebline	PTW	online catalog, quote request	https://www.ptwdosimetry.com/en/products/unidos-webline/?type=3451&downloadfile=1593& cHash= 6096ddc2949f8bafe5d556e931e6c865
HVL material (filter, diaphragm)	PTW	online catalog, page 70, quote request	thickness foils: 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5 and 10 mm of copper, https://www.ptwdosimetry.com/fileadmin/user_upload/Online_Catalog/Radiation_Medicine_Cat_en_ 58721100_11/blaetterkatalog/index.html#page_70
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