Citometria de fluxo de alta dimensionalidade para análise da função imune de tecidos dissecados de implantes

Resumo

O isolamento de células de implantes dissecados e sua caracterização por citometria de fluxo podem contribuir significativamente para o entendimento do padrão de resposta imune contra implantes. Este trabalho descreve um método preciso para o isolamento de células de implantes dissecados e sua coloração para análise por citometria de fluxo.

Resumo

O sucesso da implantação de tecido cultivado em laboratório ou de um dispositivo médico em um indivíduo está sujeito à resposta imune do hospedeiro receptor. Considerando um implante como um corpo estranho, uma resposta imune hostil e desregulada pode resultar na rejeição do implante, enquanto uma resposta regulada e recuperação da homeostase podem levar à sua aceitação. A análise dos microambientes de implantes dissecados em ambientes in vivo ou ex vivo pode ajudar na compreensão do padrão de resposta imune, o que pode, em última análise, ajudar no desenvolvimento de novas gerações de biomateriais. A citometria de fluxo é uma técnica bem conhecida para caracterizar células imunes e seus subgrupos com base em seus marcadores de superfície celular. Esta revisão descreve um protocolo baseado em cubagem manual, digestão enzimática e filtração através de um filtro celular para o isolamento de suspensões celulares uniformes do tecido dissecado do implante. Além disso, um protocolo de coloração por citometria de fluxo multicolor foi explicado, juntamente com as etapas para ajustes iniciais do citômetro para caracterizar e quantificar essas células isoladas por citometria de fluxo.

Introdução

Os avanços no campo da medicina têm levado ao uso frequente de materiais implantados para apoiar a função ou o recrescimento do tecido lesado ^1,2. Estes incluem dispositivos como marca-passos, implantes cosméticos reconstrutivos e placas ortopédicas usadas para fixação de fraturas ósseas ^3,4. No entanto, os materiais utilizados para a confecção desses implantes e os locais em que são implantados desempenham papéis importantes na determinação do sucesso desses implantes ^5,6,7. Como corpos estranhos, esses implantes podem gerar uma resposta imune do hospedeiro que pode levar à rejeição ou tolerância⁸. Esse fator tem direcionado a pesquisa de biomateriais para gerar materiais que possam atrair a resposta imune desejada após o implante 9,10,11,12.

A resposta imune é um requisito essencial no campo da medicina regenerativa, onde um tecido ou órgão é cultivado ao redor de um esqueleto de biomaterial (scaffold) em laboratório para a substituição de um tecido ou órgão danificado^13,14,15,16. Na medicina regenerativa, o objetivo é repor o tecido perdido ou danificado por meio do uso de células, sinais e arcabouços, cada um dos quais pode ser grandemente modulado por respostas imunes¹⁷. Além disso, mesmo quando a falta de resposta imune é desejada, é muito raramente uma ausência de atividade imunológica em vez da presença de um perfil regulatório desejado¹⁸. Técnicas como a citometria de fluxo podem desempenhar um papel significativo na caracterização do padrão de resposta imune a vários biomateriais utilizados para revestir dispositivos de implante ou para desenvolver scaffolds para engenharia de tecidos¹⁹.

Essas informações, por sua vez, ajudarão no desenvolvimento de biomateriais para implantes que podem ser bem tolerados pelo sistema imunológico ou no desenvolvimento de arcabouços que podem desempenhar um papel construtivo na engenharia de tecidos. O preparo adequado das amostras para análise por citometria de fluxo é um passo importante para evitar resultados imprecisos na imunocaracterização via triagem celular ativada por^{fluorescência20,21}. Portanto, esta revisão apresenta uma metodologia detalhada que pode ser utilizada para o isolamento de células de tecido de arcabouço, coloração da suspensão celular e análise por citometria de fluxo.

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Protocolo

NOTA: A Figura 1 fornece uma visão geral do protocolo de citometria de fluxo.

1) Preparação do reagente

1. Preparar meios para diluir enzimas e para cultura de tecidos.
   1. Adicionar 5 mL de solução tampão do ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES) em 500 mL de meio RPMI e agitar bem. Conservar o meio a 4 °C até nova utilização.
2. Calcular o volume da solução enzimática.
   NOTA: O volume da solução enzimática é o volume do meio contendo as enzimas (colagenase e DNase I) que serão necessárias para digerir o tecido cortado em cubos em placas de 6 poços; depende do número de amostras.
   1. Use a seguinte equação para calcular o volume necessário:
      (Número de amostras a digerir) × 5 mL de RPMI sem soro com tampão HEPES 10 mM
      NOTA: Por exemplo, para 0,1 a 0,3 g de baço dissecado, use 5 mL de meio para preparar a solução enzimática. O protocolo de digestão enzimática descrito neste manuscrito é principalmente para tecidos moles (variando de 0,1 a 1 g) dissecados de camundongos que incluem cérebro, rim, pele, fígado, pulmões, baço, músculos, bem como cápsulas ao redor de implantes subcutâneos feitos de materiais sintéticos ou proteínas da matriz extracelular. A digestão de tecidos cartilaginosos duros pode requerer diferentes condições e volumes de enzimas digestivas, o que só pode ser determinado por otimização.
   2. Calcular a quantidade de colagenase e DNase I necessária para a solução enzimática.
      OBS: Neste protocolo foram utilizados 0,25 mg/mL de colagenase e 0,2 mg/mL de DNase I. As concentrações de trabalho necessárias para colagenase e DNase podem variar para diferentes tipos de tecidos¹⁹.
3. Preparar uma solução de corante de viabilidade 1:1000 adicionando 1 μL do corante de viabilidade (ver Tabela de Materiais) a 999 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e vórtice a solução. Conservar a solução no escuro a 4 °C até nova utilização.
4. Preparar o tampão de coloração adicionando 1 g de albumina de soro bovino (BSA) a 100 mL de PBS e agitar a solução até que o BSA esteja completamente dissolvido. Conservar a solução a 4 °C até nova utilização.

2) Configuração de placas de digestão enzimática

1. Monte uma placa de 6 poços com filtros celulares de 70 μm em cada poço. Adicionar 3 ml do meio preparado do passo 1.1.1 em cada poço e incubar no gelo.
2. Conservar o meio restante (2 ml/poço) numa estufa ou banho-maria a 37 °C para suspender a quantidade calculada de colagenase e DNase I (passo 1.2.2).

3) Isolamento de células

1. Coloque os implantes/tecidos dissecados em placas e corte finamente usando tesoura. Alternativamente, utilize um método de ruptura mecânica usando um dissociador de tecido ou homogeneizador portátil. Devido ao alto número de leucócitos, dissecar o baço para utilizar como um controle de coloração em cada corrida.
   NOTA: Como alguns materiais induzem níveis mais elevados de fibrose, este protocolo é aplicável tanto para materiais altamente fibróticos quanto minimamente fibróticos. No entanto, cada método de processamento deve ser avaliado quanto ao rendimento celular e à viabilidade após a digestão antes da coloração. Evitar a contaminação do sangue periférico durante a dissecção.
2. Adicionar colagenase e DNase I (volume calculado no passo 1.2.2) ao restante RPMI (2 ml) que foi aquecido a 37 °C. Adicionar 2 ml da solução enzimática completa a cada poço.
3. Colocar as placas num agitador incubado durante 45 minutos a 37 °C e 100 rpm.
   NOTA: Seja cauteloso ao empilhar placas, pois isso pode inibir a transferência de calor adequada.
4. Enquanto isso, prepare uma ponta de dispensação de suspensão cortando 3-4 mm da extremidade de uma ponta de 1000 μL com tesoura. Após a incubação, pipetar a suspensão nos poços para cima e para baixo para misturá-la completamente usando a ponta picada. Coloque o filtro celular na parte superior de um tubo cônico de 50 mL e passe a solução digerida através do filtro celular.
   NOTA: O filtro celular de 70 μm é suficiente para separar as células do biomaterial implantado, como o alginato. Se for necessária maior pureza, use processos como a separação por gradiente de densidade para obter uma população enriquecida de leucócitos.
5. Enxaguar os poços com solução de PBS 1x e transferir o volume de enxágue através do filtro, seguido de adicionar as lavagens do filtro com solução de PBS 1x até que o volume no tubo atinja 50 mL.
   NOTA: O PBS 1x deve estar à temperatura ambiente para evitar qualquer aumento na viscosidade do digestor e para permitir a peletização celular durante a centrifugação.
6. Centrifugar o tubo a 300 × g durante 5 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, aspirar o sobrenadante cuidadosamente usando uma pipeta sorológica sem perturbar o pellet. Ressuspenda o pellet em 1000 μL de 1x PBS e transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga.
7. Misturar 10 μL da suspensão celular com 10 μL de azul de tripano e carregar a suspensão em lâminas de câmara de contagem para contagem de células usando um contador automático de células ou em um hemocitômetro para contar pelo método convencional em um microscópio. Alternativamente, use contas de contagem de células de citometria de fluxo.

4) Coloração para citometria de fluxo

1. Consulte a Figura 2 para obter um exemplo de layout de placa para um experimento de 14 cores com 45 amostras, controles de fluorescência menos um (FMO), controles de compensação e um controle de amostra de baço totalmente corado. Após estimar o número total de células, calcular o volume da suspensão celular necessário para coloração de 1 × 10 6 células para cada amostra, e 0,5 × 10⁶ células para cada compensação e controle FMO. Distribua o volume necessário da suspensão celular nos poços de uma placa de 96 poços com fundo em V e perfaça o volume para 100 μL com 1x PBS.
   NOTA: Por exemplo, se 1000 μL de suspensão celular obtida na etapa 3.6 contiverem 40 × 10 6 células, então para 1 × 10 6 células, 1000/40 × 10⁶ = 25 μL de suspensão celular serão necessários.
2. Centrifugar a placa a 300 × g durante 5 min a 4 °C, aspirar o sobrenadante e, em seguida, ressuspender as células nos poços de amostra e num poço de controlo de compensação para determinar a viabilidade, com 100 μL de uma solução 1:1000 do corante de viabilidade (ver Tabela de Materiais).
3. Para células dos outros poços de compensação, bem como FMO e poços não corados, ressuspendê-los com 100 μL de 1x PBS.
4. Incubar as células no escuro durante 30 minutos a 4 °C.
5. Enquanto isso, prepare um coquetel de anticorpos de superfície para coloração da amostra e controles FMO: 50 μL por amostra ou FMO. Veja a Tabela 1 para um exemplo do coquetel de anticorpos.
6. Após a incubação, adicionar 100 μl de 1x PBS a cada poço, girar para baixo a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
7. Aspirar o sobrenadante e ressuspender em 200 μL de tampão corante (1x PBS + 1% BSA); centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
8. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células nos poços de compensação, FMO e não corados com 50 μL de 1x PBS. Adicionar 50 μL do cocktail de anticorpos aos respectivos poços de amostra e poços FMO. Adicione os respectivos anticorpos aos diferentes poços de compensação.
9. Incubar a placa durante 45 minutos no escuro a 4 °C. Após a incubação, adicionar 150 μL de tampão de coloração em cada poço e centrifugar a suspensão celular a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
10. Aspirar o sobrenadante, ressuspender as células com 200 μL de tampão corante e centrifugar a suspensão celular a 300 × g por 5 min a 4 °C.
11. Se analisar amostras sem fixação, ressuspendê-las em 200 μL de tampão de coloração e prosseguir para a seção 6 sobre a instalação do citômetro e análise da amostra. Se fixar as células, aspirar o sobrenadante após a lavagem e adicionar 100 μL de um fixador como paraformaldeído a 4%. Se a coloração for para marcadores intracelulares, prossiga para a secção 5 sobre a coloração intracelular e fixe e permeabilize as células (ver Tabela de Materiais). Incubar as células durante 20 minutos no escuro a 4 °C.
    OBS: Como a fixação pode afetar a intensidade da fluorescência de alguns fluoróforos, avalie cada painel com e sem fixação.
12. Após a incubação, adicionar 100 μL de 1x PBS, seguido de centrifugação a 300 × g por 5 min a 4 °C. Aspirar o sobrenadante, ressuspender em 1x PBS e centrifugar a 300 × g por 5 min a 4 °C.
13. Ressuspender as células em 200 μL de tampão corante e armazenar a 4 °C antes da análise por citometria de fluxo.

5) Coloração intracelular

1. Continuando a partir do passo 4.11 para fixação e permeabilização para marcadores intracelulares, adicionar 100 μL do tampão apropriado. Centrifugar as células a 350 × g durante 5 min a 4 °C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender os pellets em 200 μL da solução do agente fixador-permeabilizante; centrifugar as células a 350 × g durante 5 min a 4 °C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender os pellets com anticorpos intracelulares diluídos no tampão apropriado.
   NOTA: Os tipos de anticorpos e diluições dependerão das células-alvo. Por exemplo, um marcador intracelular comum é a caixa de cabeça de garfo P3 para células T reguladoras, que é frequentemente usada em uma diluição de 1:100.
2. Incubar a suspensão celular no escuro durante 45 min a 4 °C. Após a incubação, adicionar 150 μL do tampão adequado e centrifugar a suspensão a 350 × g durante 5 min a 4 °C.
3. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 200 μL de tampão corante, seguido de centrifugação a 300 × g por 5 min a 4 °C. Aspirar e ressuspender as células em 200 μL de tampão corante para análise por citometria de fluxo.

6) Citômetro e configuração da compensação

1. Imediatamente antes de executar as amostras, prepare contas de compensação (consulte a Tabela de Materiais) se utilizar a compensação baseada em contas em vez da compensação baseada em células.
   1. Rotular tubos de microcentrífuga separados para cada anticorpo conjugado com fluorocromo e adicionar 100 μL de 1x PBS seguido por uma gota completa de contas de compensação de controle negativo anti-camundongo e uma gota de contas de compensação de controle positivo para cada tubo. Adicionar 1 μL do anticorpo adequado a cada tubo separado. Vórtice e incubar por 5 min antes da aquisição.
      Observação : como alguns corantes, como BUV737, não podem ser vinculados a contas, use um controle baseado em célula.
2. Calibrar o citômetro de fluxo antes de cada experimento executando a configuração do citômetro com as esferas de rastreamento e manter as configurações do citômetro de fluxo para cada experimento.
3. Antes de analisar a amostra, ajuste o citômetro de fluxo executando uma amostra não corada para ajustar a população celular em um gráfico de dispersão lateral (SSC) versus dispersão direta (FSC) para que a população celular caia no centro do gráfico e não fique fora da escala.
4. Execute a amostra corada brevemente para ajustar as tensões para FSC e SSC e para cada canal para garantir que nenhum evento fique fora da escala logarítmica de cada canal. Registre 5.000 eventos para cada controle de compensação, seguido de confinamento de populações positivas e negativas. Calcule a matriz de compensação e, em seguida, execute as amostras, reunindo pelo menos 1.000 eventos para as populações de interesse.
   NOTA: A compensação em painéis de cores maiores deve ser verificada, pois a compensação automatizada pode ser propensa a compensação excessiva ou insuficiente. Cada parâmetro deve ser representado graficamente em relação a todos os outros parâmetros para monitorar sinais de sobrecompensação ou subcompensação, e cada controle de cor única deve ser avaliado. A compensação complexa de experimentos de cores maiores deve ser realizada com a assistência de um colaborador ou de uma instalação central com ampla experiência em citometria de fluxo. Tipos mais recentes de citômetros de fluxo, como citômetros espectrais, utilizam todo o espectro de um fluoróforo por meio de um processo conhecido como desmistura espectral, que pode produzir uma distinção mais limpa de sobreposição fluorescente em comparação com a compensação padrão isoladamente²².

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Resultados

O processo de desenvolvimento de painéis de citometria de fluxo para análise imunológica muitas vezes depende da comparação dos resultados com dados existentes e a literatura na área. O conhecimento de como as populações podem se apresentar na citometria de fluxo é fundamental para a interpretação adequada dos dados. Independentemente disso, populações e tipos celulares podem aparecer de forma diferente em diferentes tecidos, portanto, alguma variabilidade é esperada. No con...

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Discussão

Esta revisão descreve uma metodologia detalhada para isolar células de implantes de biomateriais para obter uma suspensão celular uniforme. Além disso, um protocolo detalhado foi fornecido para coloração da suspensão celular para citometria de fluxo multicolorida, juntamente com as etapas para a configuração de um citômetro de fluxo para resultados ótimos. Os métodos de isolamento celular podem envolver várias etapas, muitas vezes utilizando dissecção manual do tecido seguida de digestão enzimática com e...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical tubes	Fisher Scientific	14-432-22
6 Well Plate	Fisher Scientific	07-000-646
BD Brilliant Stain Buffer Plus	BD Biosciences	566385
BD Cytofix	BD Biosciences	554655	For only fixing cells
Bovine serum albumin	Millipore Sigma	A7906	For preparing FACS staining buffer
CD11b AF700	Biolegend	101222	Clone: M1/70
CD11c PerCP/Cy5.5	Biolegend	117325	Clone: N418
CD197 PE/Dazzle594	Biolegend	120121	Clone: 4B12
CD200R3 APC	Biolegend	142207	Clone: Ba13
CD206 PE	Biolegend	141705	Clone: C068C2
CD45 BUV737	BD Biosciences	612778	Clone: 104/A20
CD86 BUV395	BD Biosciences	564199	Clone: GL1
CD8a BV421	Biolegend	100737	Clone: 53-6.7
Comp Bead anti-mouse	BD Biosciences	552843	For compensation control
DNase I	Millipore Sigma	11284932001	Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I)
F4/80 PE/Cy7	Biolegend	123113	Clone: BM8
Fc Block	Biolegend	101301	Clone: 93
Fixation/Permeabilization Solution Kit	BD Biosciences	554714	For fixing and permeabilization of cells.
HEPES buffer	Thermo Fisher	15630080	Buffer to supplement cell media
Liberase	Millipore Sigma	5401127001	Blend of purified Collagenase I and Collagenase II
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher	L23105	Viability dye
Ly6c AF488	Biolegend	128015	Clone: HK1.4
Ly6g BV510	Biolegend	127633	Clone: 1A8
MHCII BV786	BD Biosciences	742894	Clone: M5/114.15.2
Phosphate buffer saline	Thermo Fisher	D8537
RPMI	Thermo Fisher	11875176	Cell culture media
Siglec F BV605	BD Biosciences	740388	Clone: E50-2440
V-bottom 96-well plate