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Resumo

O protocolo atual descreve um método de isolamento de DNA a partir de amostras de sangue e biópsias intestinais, geração de bibliotecas TCRβ e IGH PCR para sequenciamento de próxima geração, desempenho de uma execução de NGS e análise de dados básicos.

Resumo

A memória imunológica, a marca registrada da imunidade adaptativa, é orquestrada por linfócitos T e B. Em circulação e diferentes órgãos, há bilhões de clones de células T e B únicos, e cada um pode ligar um antígeno específico, levando à proliferação, diferenciação e/ou secreção de citocinas. A grande heterogeneidade nas células T e B é gerada pela recombinação aleatória de diferentes segmentos genéticos. As tecnologias de sequenciamento de última geração (NGS), desenvolvidas na última década, permitem uma visão aprofundada sem precedentes do repertório imunológico do receptor de células T e B. Estudos em várias condições inflamatórias, imunodeficiências, infecções e malignidades demonstraram mudanças acentuadas na clonalidade, uso genético e propriedades biofísicas do repertório imunológico, fornecendo importantes insights sobre o papel das respostas imunes adaptativas em diferentes distúrbios.

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para NGS de repertório imunológico de células T e B a partir de sangue e tecido. Apresentamos um pipeline a partir do isolamento do DNA através da preparação da biblioteca, sequenciamento no sequenciador NGS e terminando com análises básicas. Este método permite a exploração de células T e B específicas no nível nucleotídeo ou aminoácido, podendo assim identificar mudanças dinâmicas nas populações de linfócitos e parâmetros de diversidade em diferentes doenças. Esta técnica está entrando lentamente na prática clínica e tem potencial para identificação de novos biomarcadores, estratificação de risco e medicina de precisão.

Introdução

O sistema imunológico adaptativo, composto por linfócitos T e B, utiliza memória imunológica para reconhecer um antígeno previamente encontrado e iniciar uma resposta rápida. Os linfócitos são gerados na medula óssea e maduros nas células timo (células T) ou medula óssea (células B). Tanto o receptor de células T (TCR) quanto o receptor de células B (BCR) exibem configurações únicas que permitem o reconhecimento de antígenos específicos. Na homeostase, as células T e B circulam constantemente e pesquisam os trilhões de peptídeos diferentes apresentados em células que apresentam antígenos. A ligadura TCR ou BCR de um antígeno específico com alta afinidade, juntamente com a co-estimulação adequada, leva à ativação celular, resultando em secreção de citocinas, expansão clonal e geração de anticorpos, no caso de células B.

A enorme matriz das diferentes células T ou B é coletivamente denominada repertório imunológico, permitindo o reconhecimento de incontáveis epítopos diferentes. A fim de gerar um repertório tão vasto, ocorre um complexo processo de montagem aleatória de diferentes segmentos genéticos, criando combinações quase infinitas de receptores que podem ligar antígenos únicos1. Esse processo, chamado de recombinação V(D)J, inclui rearranjos de diferentes genes variáveis (V), diversidade (D) e junção (J), acompanhados de supressões aleatórias e inserções de nucleotídeos nas junções2.

A arquitetura do sistema imunológico adaptativo tem interessado cientistas em diferentes campos por muitas décadas. No passado, o sequenciamento de Sanger, a especificação da região 3 (CDR3) complementar e a citometria de fluxo foram utilizados para caracterizar o repertório imunológico, mas proporcionavam baixa resolução. Na última década, os avanços nos métodos de sequenciamento de próxima geração (NGS) permitiram uma visão aprofundada das características e composição dos repertórios TCR e BCR de um indivíduo3,4. Esses sistemas de alta produtividade (HTS) sequenciam e processam milhões de produtos TCR ou BCR reorganizados simultaneamente e permitem uma análise de alta resolução de células T e B específicas no nível nucleotídeo ou aminoácido. A NGS fornece uma nova estratégia para estudar o repertório imunológico tanto na saúde quanto na doença. Estudos utilizando HTS demonstraram repertórios alterados de TCR e BCR em doenças autoimunes5, imunodeficiências primárias6,7e malignidades, como na leucemia mielóide aguda8. Utilizando NGS, nós e outros mostramos expansão oligoclonal de clones específicos de células T e B, em pacientes com doença inflamatória intestinal (DII), incluindo colite ulcerativa e doença de Crohn9,10,11,12,13,14. No geral, estudos de diferentes campos sugerem que mudanças no repertório têm um papel crucial na patogênese de distúrbios imunomu mediados.

O protocolo atual descreve um método de isolamento do DNA de biópsias intestinais e sangue, geração de bibliotecas TCRβ e IGH PCR para NGS, e desempenho de sequenciamento executado. Também fornecemos passos básicos na análise de dados do repertório imunológico. Este protocolo também pode ser aplicado para a geração de bibliotecas TCRα, TCRγ e IGL. O método também é compatível com outros órgãos (por exemplo, linfonodos, tumores, fluido sinovial, tecido adiposo, etc.) desde que sejam utilizados protocolos de digestão específicos do tecido.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional do Sheba Medical Center, e o consentimento por escrito informado foi obtido de todos os sujeitos participantes.

1. Isolamento e quantificação do DNA

  1. Digestão e lise celular de biópsias intestinais
    1. Recuperar biópsias intestinais, coletadas recentemente ou armazenadas a -20 °C ou -80 °C. Se usar biópsias congeladas, descongele no gelo.
    2. Adicione 600 μL de solução de lise nuclei a um tubo de microcentrífugo estéril de 1,7 mL, refrigerado no gelo.
    3. Coloque a biópsia em um tubo de microcentrifusagem com solução de lise e incubar a 65 °C por 15-30 min.
    4. Adicione 17,5 μL de 20 mg/mL proteinase K e incubar durante a noite a 55 °C, com agitação suave.
    5. Deixe a amostra esfriar até a temperatura ambiente por 5 minutos antes de passar para a etapa 1.3.
  2. Lise celular de sangue inteiro
    1. Obtenha 3 mL de sangue inteiro em EDTA-, heparina ou tubo contendo citrato.
    2. Tubo de rocha suavemente misturado, e transfira sangue para um tubo de centrífuga de 15 mL estéril contendo 9 mL de solução de lise celular. Inverta várias vezes durante um período de incubação de 10 minutos à temperatura ambiente.
    3. Centrifugar a 2.000 x g por 10 minutos à temperatura ambiente, e depois descartar o máximo de supernanato possível sem perturbar a pelota branca visível. Aproximadamente 50-100 μL de líquido residual permanecerão.
    4. Tubo de vórtice vigorosamente para 15 s até que completamente resuspended. Adicione 3 mL de solução de lise nuclei e pipet várias vezes. A solução deve se tornar viscosa.
  3. Precipitação proteica
    1. Adicione 200 μL de tampão de precipitação proteica ao tecido, ou 1 mL ao sangue. Vórtice vigorosamente para 20 s e incubar no gelo por 5 minutos. Pequenas proteínas podem ser visíveis após o vórtice.
    2. Centrifugar a 16.000 x g por 4 min. Uma pelota apertada contendo proteínas precipitadas deve se formar.
    3. Transfira cuidadosamente o supernante, sem perturbar a pelota, para um novo tubo de 1,7 mL.
      NOTA: Se a pelota não estiver apertada, considere outra centrífuga a 16.000 x g por 4 min.
  4. Precipitação e reidratação de DNA
    1. Adicione 1 mL de 2-propanol ao tubo contendo o supernascimento, e misture suavemente invertendo. O DNA deve se tornar visível como substância flutuante branca.
    2. Centrifugar a 16.000 x g por 1 min. Remova o supernatante completamente usando uma pipeta.
    3. Adicione 1 mL de etanol recém-preparado e inverta o tubo várias vezes. Centrífuga a 16.000 x g por 1 min a temperatura ambiente. Descarte o supernaspeuta cuidadosamente.
    4. Repita o passo 1.4.3.
    5. Coloque o tubo aberto invertido em papel absorvente limpo por 10-15 min. Inverter o tubo e confirmar a hidratação completa. Se necessário, deixe secar ao ar por mais 10-15 min.
      NOTA: É crucial que a pelota seque completamente.
    6. Adicione 50 μL de água ultra-pura (UPW). Se necessário, o DNA pode ser diluído mais após a quantificação.
    7. Incubar por 1h no bloco de calor a 65 °C, para reidratação de DNA.
  5. Quantificação de DNA
    NOTA: O DNA foi quantificado por meio de um fluorômetro e reagentes designados, conforme especificado na tabela de materiais.
    1. Leve os padrões à temperatura ambiente e prepare o kit, incluindo tubos designados de 0,5 mL.
    2. Prepare a mistura de tampão e corante em um tubo de 15 mL, de acordo com o número de amostras. Adicione 200 μL de tampão e 1 μL de corante por amostra. Inclua 2 amostras para padrões. Recomenda-se calcular uma amostra adicional para evitar que o buffer não seja suficiente.
      1. Para as 2 normas, coloque 190 μL da mistura acima preparada em tubo de 0,5 mL. Adicione 10 μL do padrão.
      2. Para cada amostra, coloque 199 μL da mistura acima preparada em tubo de 0,5 mL. Adicione 1 μL do DNA.
    3. Leia as amostras. O resultado indica concentração de DNA da amostra.
    4. Se as amostras estiverem acima do limite, dilui o DNA 1:10 com UPW e repita a leitura.

2. Preparação da biblioteca

NOTA: O protocolo atual utiliza um kit de ensaio baseado em multiplex, baseado em PCR, compatível com sequenciadores NGS. O kit contém 24 índices diferentes cada uma visando regiões conservadas dentro doV β e das regiões Jβ. Isso permite uma reação pcr de uma etapa e agrupamento de diferentes amostras. Veja a tabela de materiais para obter detalhes.

  1. Prepare amostras de DNA. Obtenha 150 ng de DNA e adicione UPW para um total de 5 μL.
    NOTA: É possível usar menos de 150 ng de DNA para preparação da biblioteca, com concentração mínima de 10 ng/μL.
  2. Coloque pipetas e pontas no capô com luz UV por 15 minutos para quebrar o DNA residual. Enquanto isso, permita que diferentes tubos de índice (para preparação da biblioteca) e polimerase de DNA descongelem no gelo.
  3. Em uma capa biológica, adicione 45 μL dos diferentes tubos de índice em tubos PCR. A seguir, adicione 0,2 μL da polimerase de DNA e os 5 μL de DNA preparados na etapa 2.1 em tubos PCR.
  4. Execute a reação do PCR usando um programa pré-definido, de acordo com as instruções do fabricante.

3. Purificação e quantificação de amplicon

  1. Use contas magnéticas para remoção de primers em excesso, nucleotídeos e enzimas.
    1. Aqueça as contas com pelo menos 30 minutos a temperatura ambiente. Prepare 80% de etanol fresco suficiente para 400 μL por amostra.
    2. Adicione 50 μL (IGH) ou 35 μL (TCRβ) das contas a cada tubo PCR e misture por pipetação 10 vezes. Incubar 10 min em temperatura ambiente.
    3. Coloque a amostra mista no suporte magnético por 5 minutos.
    4. Aspire 95 μL (IGH) ou 80 μL (TCRβ) do líquido claro e descarte. Aspirar líquido restante usando uma ponta de 10 μL.
    5. Adicione 200 μL de 80% de etanol a cada amostra. Incubar 30 s. Aspirar 195 μL de etanol e descartar. Aspirar líquido restante usando ponta de 10 μL.
    6. Repita o passo 3.1.5. Abra as tampas dos tubos e deixe o ar secar por 5 minutos.
    7. Imediatamente após os 5 minutos, remova do suporte magnético e adicione 25 μL de tampão de elução (10 mM Tris-HCl, pH 8.0). Misture por pipetação até ficar homogêneo. Incubar em temperatura ambiente por 2 minutos.
    8. Coloque os tubos no suporte magnético por 5 minutos. Transfira 22 μL para um novo tubo PCR. Meça a concentração de DNA (etapa 1,5).
  2. Quantificação de amplicon
    NOTA: O protocolo atual usa uma máquina de eletroforese automatizada para controle de qualidade da concentração, tamanho e integridade do DNA. Veja a tabela de materiais para obter detalhes.
    1. Coloque reagentes e fita de tela em temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos.
    2. Em um novo tubo de microcrífugas de 1,7 mL, faça uma diluição de 1ng/μL das amostras de DNA quantificadas na etapa 3.1.8 com UPW para um volume total de pelo menos 3 μL.
    3. Vórtice diluído DNA antes do uso. Coloque 2 μL de tampão, juntamente com 2 μL do DNA diluído nas tiras PCR especializadas pré-rotuladas (fornecidas no kit) e coloque as tampas. Coloque no shaker por 1 min, seguido de girar para baixo de tiras PCR.
      NOTA: Devido à viscosidade do buffer, certifique-se de que o excesso de tampão seja removido da ponta antes de transferir para os tubos de amostra.
    4. Coloque na máquina, a fita de tela e as tiras PCR sem as tampas. Abra a tampa da caixa de ponta dentro da máquina. Atribua a posição com rótulos apropriados. Ligue a máquina.
      NOTA: O histograma de saída deve ser um único pico no tamanho desejado dos amplicons(Figura 1A). Em amostras de má qualidade, serão observados picos adicionais(Figura 1B),indicando má limpeza de contas ou formação de primer dimers.

4. Sequenciamento de próxima geração

  1. Quantificação e agrupamento de biblioteca
    1. Calcule a concentração final de DNA em nM, utilizando o valor do DNA da etapa 3.1.8, e o tamanho dos pares de base (bp) do pico do produto, obtidos a partir dos resultados da máquina de eletroforese (ver Figura 1).
    2. Para cada amostra, calcule o volume de DNA para tomar para uma concentração final de 4 nM, em um volume final de 10-20 μL tampão de eluição.
    3. Prepare uma nova mistura de diluição para cada amostra e retire 2 μL dela para uma nova mistura de piscina.
      NOTA: Para amostras com menos de 4 nM, adicione a quantidade máxima de amostra possível.
  2. NGS executado de biblioteca
    NOTA: O protocolo atual usa uma plataforma de sequenciador de bancada. Veja a tabela de materiais para obter detalhes.
    1. Prepare uma nova solução de 0.2 N NaOH. Adicione 10 μL de 0,2 N NaOH à biblioteca diluída preparada na etapa 4.1.3. Adicione 5% de PhiX ao tubo e ao vórtice brevemente. Gire o tubo para garantir que toda a solução tenha se acomodado na parte inferior do tubo.
    2. Incubar por 5 minutos à temperatura ambiente para desnaturar o DNA duplo encalhado. Adicione 980 μL de tampão pré-refrigerado do kit ao tubo contendo DNA e vórtice brevemente.
    3. Coloque a biblioteca diluída no gelo e prepare a biblioteca da seguinte forma. Para uma mistura de 17 pM, adicione 425 μL de DNA da etapa 4.2.2 e 575 μL de tampão. Inverter biblioteca várias vezes e girar para baixo. Carregue 600 μL da biblioteca final no cartucho designado e coloque amostras na máquina.
    4. Inicie a execução seguindo as instruções de software.

5. Análise de sequenciamento

  1. Baixe métricas de sequenciamento do sequencer e verifique se os dados de sequenciamento estão dentro das seguintes faixas (específica para o kit usado no protocolo atual). As amostras que não atendem a esses critérios estão sujeitas a repetição:
    Densidade do cluster (Densidade (K/mm2)): 945K – 1800K
    Percentual de leituras do filtro de passagem (Clusters PF (%)): >90%
    Escores de qualidade (%>=Q30): >85%
    Alinhamento PhiX (Alinhado%): 1,5% - 10%
    Taxa de erro phix (%): <1,0%

Resultados

Aqui, descrevemos um método para isolamento do DNA do tecido intestinal e sangue, preparação de bibliotecas para NGS, e etapas básicas de um sequenciamento para sequenciamento do repertório imunológico. A execução gerará arquivos fastq, que podem ser convertidos em arquivos fasta para uso na plataforma internacional IMGT)/HighV-QUEST. Este HTS realiza e gerencia muitas análises de dezenas de milhares de sequências TCRβ e IGH reorganizadas, no nível nucleotídeo15. O IMGT/HighV-QUEST p...

Discussão

Alterações na abundância e função de linfócitos B e T são frequentemente encontradas em diferentes malignidades18, distúrbios inflamatórios crônicos (por exemplo, colite ulcerativa e artrite reumatoide)10,19, e em várias imunodeficiências17,20. O método atual utiliza o NGS para facilitar uma visão aprofundada dos repertórios TCR e BCR, permitindo a detecção de alte...

Divulgações

Todos os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

nenhum.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
2-propanolSigmaI9516-500ML
1.7 mL micro-centrifuge tubesAxygen8187631104051
15 mL centrifuge tubesGreiner188261
Absolute ethanolMerck1.08543.0250
Amplitaq GoldThermo FisherN8080241
AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63881
Heat blockBioerNot applicable
High Sensitivity D1000 Sample BufferAgilent5067-5603For Tapestation
High Sensitivity D1000 ScreenTapeAgilent5067-5584For Tapestation. Tubes sold seperately
Lymphotrack Assay kitInvivoscribeTRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019Each includes 24 indexes
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)IlluminaMS-102-2003Includes standard flow cell type and all reagents required
MiSeq SequencerIlluminaSY-410-1003
PCR strips4titude4ti-0792
Proteinase KInvitrogenEO0491
Qubit 4 FluorometerThermo FisherQ33226
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo FisherQ32854Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes
ShakerBiosanNot applicable
Tapestation 2100 BioanalyzerAgilentG2940CA
ultra pure waterBio-lab7501
Wizard DNA isolation kitPromegaA1120Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer

Referências

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