Imagem livre de rótulos da Dinâmica de Armazenamento Lipídido em Elegans caenorhabditis usando microscopia de dispersão raman estimulada

Resumo

A microscopia de dispersão de Raman estimulada (SRS) permite imagens seletivas e livres de rótulos de moieties químicos específicos e tem sido efetivamente empregada para imagens de moléculas lipídicas in vivo. Aqui, fornecemos uma breve introdução ao princípio da microscopia SRS e descrevemos métodos para seu uso no armazenamento lipídeto de imagem em Caenorhabditis elegans.

Resumo

O metabolismo lipídico é um processo fisiológico fundamental necessário para a saúde celular e do organismo. A desregulação do metabolismo lipídico muitas vezes provoca obesidade e muitas doenças associadas, incluindo doenças cardiovasculares, diabetes tipo II e câncer. Para avançar no entendimento atual da regulação metabólica lipídica, os métodos quantitativos para medir precisamente os níveis de armazenamento lipídóide in vivo no tempo e no espaço tornaram-se cada vez mais importantes e úteis. As abordagens tradicionais para analisar o armazenamento lipídico são semi-quantitativas para avaliação microscópica ou falta de informações diarrecenciais para medição bioquímica. A microscopia de dispersão Raman estimulada (SRS) é uma tecnologia de imagem química livre de rótulos que permite a detecção rápida e quantitativa de lipídios em células vivas com resolução subcelular. Como o contraste é explorado a partir de vibrações moleculares intrínsecas, a microscopia SRS também permite o rastreamento quadridimensional de lipídios em animais vivos. Na última década, a microscopia SRS tem sido amplamente utilizada para imagens de pequenas moléculas em pesquisas biomédicas e superar as principais limitações dos métodos convencionais de coloração fluorescente e extração lipídica. Em laboratório, combinamos microscopia srs com as ferramentas genéticas e bioquímicas disponíveis para o poderoso organismo modelo, Caenorhabditis elegans, para investigar a distribuição e heterogeneidade de gotículas lipídicas em diferentes células e tecidos e, finalmente, descobrir novas vias de sinalização conservadas que modulam o metabolismo lipídico. Aqui, apresentamos os princípios de trabalho e a configuração detalhada do microscópio SRS e fornecemos métodos para seu uso na quantificação do armazenamento lipídico em pontos de tempo distintos de desenvolvimento de tipo selvagem e insulina sinalizando mutantes deficientes C. elegans.

Introdução

A obesidade tornou-se um problema de saúde global que ameaça um terço da população em todo o mundo, e apresenta uma séria preocupação médica, dada a sua associação com a saúde mental ruim¹ e doenças mortais, incluindo diabetes², doenças cardiovasculares³ e alguns tipos de câncer⁴. O estudo do metabolismo lipídico é essencial para entender melhor os problemas biológicos por trás da obesidade. A quantificação rápida e específica do armazenamento lipídico implica a detecção de ácidos graxos e seus derivados, bem como metabólitos contendo esterol, com alta sensibilidade e preferencialmente com informações espaciais. Lipídios são alvos desafiadores para a imagem porque não têm fluorescência intrínseca e não podem ser facilmente marcados fluorescentemente. As etiquetas fluorescentes são muitas vezes maiores que as moléculas lipídicas e, portanto, podem ser quimicamente invasivas e impraticáveis para aplicações in vivo. A estratégia de rotulagem sem rótulos ou mínimas é necessária para preservar a estrutura hidrofóbica das moléculas lipídicas⁵. Desenvolvimentos recentes em tecnologias de imagem criaram oportunidades emocionantes para imagens sem rótulos de lipídios em células vivas, tecidos e organismos.

Abordagens tradicionais para análises de armazenamento lipídico em amostras biológicas incluem ensaios bioquímicos e protocolos de coloração com corantes lipofílicos. Ensaios de quantificação bioquímica envolvendo espectrometria de massa (MS) são incomparáveis em sua resolução molecular, mas requerem quantidades de amostra muito grandes e a preparação da amostra geralmente leva várias horas, limitando sua aplicação para imagens em tempo real de sistemas vivos⁵. Outra grande limitação desses ensaios é a falta de informação espacial. Por outro lado, corantes lipofílicos como Oil Red O e Sudan Black fornecem tecido e distribuição celular de organelas de armazenamento lipídico e comparados às técnicas de ESM, esses métodos de coloração também são de baixo custo e fáceis de executar. No entanto, esses protocolos de coloração requerem fixação, que pode impactar a natureza hidrofóbica das gotículas lipídicas, gerar mudanças artificiais em sua estrutura e resultar em inconsistências entre os experimentos⁶. As dificuldades técnicas associadas às técnicas bioquímicas e de coloração levaram à busca de métodos livres de rótulos para imagens de moléculas lipídicas e ao rápido aumento do uso de microscopia coerente de dispersão de Raman (CRS) em imagens lipídicas.

O efeito Raman foi reconhecido pela primeira vez por Raman e Krishnan, onde eles relataram que ao interagir com um fóton, uma molécula pode gerar luz dispersa sem alteração no comprimento de onda (chamado dispersão de Rayleigh) ou raramente com um comprimento de onda alterado (chamado de dispersão de Raman) e essa mudança no comprimento de onda é característica dos grupos químicos funcionais dentro da molécula⁷. Quando as ligações químicas dentro de uma molécula ficam excitadas a um nível de energia vibracional mais alto por um fóton incidente, chamado fóton bomba, a energia do fóton disperso, chamado de fóton Stokes, fica mais baixa. Caso contrário, as ligações químicas podem atingir um nível de energia vibracional mais baixo se estiverem originalmente em um nível mais alto, e o fóton disperso ganhar energia para ser o fóton anti-Stokes. A diferença de frequência entre o incidente e os fótons dispersos é conhecida como a mudança de Raman. Cada ligação química dentro de uma molécula tem uma mudança raman característica e quantificável. Por exemplo, o vínculo CH₂ tem uma mudança raman de 2.845 cm^-1, que é abundante nas cadeias de ácidos graxos⁸. Este sinal espontâneo de Raman é geralmente muito fraco, o que limitou muito a velocidade de imagem na microscopia espontâneo convencional de Raman. Ao longo dos anos, várias abordagens foram desenvolvidas para aumentar a velocidade de imagem e a sensibilidade da microscopia espontânea de Raman. A microscopia de dispersão de Raman coerente, incluindo microscopia coerente de dispersão de Raman (CARS) e microscopia estimulada de dispersão de Raman (SRS), é o progresso mais recente. Carros e SRS têm princípios de trabalho ligeiramente diferentes, mas ambos são técnicas livres de rótulos que têm capacidade de imagem ao vivo, podem produzir informações espaciais e temporais sobre a dinâmica de armazenamento lipídial, e requerem apenas um pequeno tamanho amostral. A microscopia cars sofre de fundo não ressonante, que vem de vários processos não lineares, e os sinais CARS também têm relação não linear com a concentração da molécula, que juntas complicam o processo de quantificação⁹. Ao contrário da microscopia CARS, a microscopia SRS não gera sinais de fundo não ressonantes e oferece dependência linear da concentração da molécula de interesse. Assim, atualmente a microscopia SRS é mais amplamente utilizada para imagens lipídicas.

Na microscopia SRS, os sinais fracos espontâneos de Raman podem ser amplificados quando excitados por dois raios laser sincronizados com sua diferença de frequência que corresponde à frequência vibracional da ligação química. A molécula experimentará uma transição aprimorada para um estado animado devido à excitação coerente. Como resultado, a taxa de geração de fótons Stokes é aumentada. Consequentemente, a intensidade do feixe "Stokes" transmitido aumenta (estimulado o ganho de Raman, SRG) e a intensidade do feixe de "bomba" transmitido diminui (estimulado perda de Raman, SRL). A detecção de sinais SRG ou SRL está fundamentada para a imagem de microscopia de Dispersão de Raman (SRS) estimulada de moléculas com ligações químicas específicas¹⁰. Se a diferença de frequência entre os dois raios laser não corresponder à frequência vibracional da ligação química dentro de uma molécula de interesse, nem sinais SRG nem SRL serão gerados. A velocidade de imagem da microscopia SRS é de cerca de 2 μseg por pixel ou 1 segundo por quadro, o que é muito mais rápido do que a microscopia raman^{espontânea 11}. A resolução lateral típica para microscopia SRS é limitada e em torno de 300 nm. Além disso, os processos ópticos de dois fótons da microscopia SRS permitem imagens volumostricas 3D de amostras de tecido de espessura relativa e a profundidade de imagem pode chegar a 300-500 μm. No geral, a microscopia SRS apresenta uma técnica de imagem eficiente e livre de rótulos para detectar biomoléculas específicas, especialmente lipídios.

Gotículas lipídicas são organelas de membrana única, que são o principal local de armazenamento celular para lipídios neutros, incluindo os triacylglycerols (TAGs) e ésteres de colesterol (CEs). As ligações CH₂ nas cadeias de ácidos graxos dessas moléculas lipídicas geram fortes sinais de SRS a 2.845 cm^-1 quando excitadas⁸, permitindo assim a detecção e quantificação dos níveis lipídicos de armazenamento em células intactas, seções teciduais e até organismos inteiros^12,13,14,15. Em particular, c. elegans são úteis para estudos de imagem lipídica devido à sua transparência. Como os mamíferos, os C. elegans também armazenam lipídios em gotículas lipídicas e as vias de síntese e degradação das moléculas lipídicas são altamente conservadas¹⁶. Neste protocolo, forneceremos o princípio de trabalho da microscopia SRS, sua configuração fundamental e descreveremos os métodos para seu uso em imagens lipídicas em C. elegans.

Protocolo

1. Configuração instrumental para Microscopia de Dispersão Raman Estimulada

NOTA: O sistema de microscopia SRS é construído sobre um laser picosegundo com oscilador óptico integrado de bomba e um microscópio de varredura a laser confocal. O oscilador fornece dois trens de pulso picosegundo, incluindo um feixe de Stokes a 1.064 nm e um feixe de bomba incapaz entre 700-990 nm. A sobreposição temporal e espacial dos dois feixes são alcançadas dentro do laser. Um modulador eletro-óptico embutido (EOM) foi projetado especificamente para microscopia SRS. Este protocolo se concentrará no acoplamento do laser com o microscópio, e no funcionamento diário deste sistema(Figura 1). A configuração de um sistema de microscópio SRS está evoluindo na última década. Deve-se notar que a descrição a seguir representa apenas uma das várias configurações.

1. Alimentando raios laser no microscópio
   1. Configure o periscópio para levantar o feixe da saída de fonte de luz picosegundo para a porta de entrada de laser IR no scanner do microscópio.
      ATENÇÃO: Leia o manual do sistema de laser antes da operação e tome todas as precauções necessárias, pois a radiação infravermelha próxima gerada por este sistema laser classe IV pode causar danos graves aos olhos e à pele. Complete os treinamentos exigidos pelas secretarias institucionais de segurança ambiental. Use óculos de proteção e jaleco com mangas algemadas.
   2. Primeiro, coloque o feixe da bomba em 750 nm e abaixe a potência do laser para 50 mW, que pode ser inspecionada visualmente, afiliadando o alinhamento. Em seguida, use um expansor de feixe(Figura 1,L1 e L2) para ajustar o diâmetro do feixe para se encaixar na abertura traseira dos objetivos do microscópio. Use dois espelhos de relé(Figura 1,M1 e M2) para guiar o raio laser até o periscópio(Figura 1,P1 e P2). O periscópio levantará o feixe até a altura da abertura do scanner e servirá como espelho de direção para alinhamento também.
   3. Coloque os botões no periscópio no centro da faixa de sintonia e escolha a posição inicial e o ângulo de cada espelho de forma que o raio laser atinja o centro do espelho, aproximadamente.
   4. Realize o alinhamento grosseiro usando uma porta vazia na torre objetiva e coloque a sonda do medidor de potência para medir a potência da luz transmitida. Defina o scanner do microscópio no zoom mais alto (50x) e, em seguida, meça a potência da luz transmitida com o ponto de raio laser focalizado. Otimize os botões em cada espelho, M1 e M2, iterativamente para alcançar a maior potência laser transmitida.
   5. Realize o alinhamento fino com a ferramenta de alinhamento. Coloque a tampa de alinhamento do alvo da fluorescência no assento objetivo vazio e ajuste os botões de M1 para centralizar o local. Em seguida, introduza o tubo de extensão para o alvo e sintonize os botões de M2 para centralizar o local.
   6. Repita as etapas 1.1.4 e 1.1.5 até que a viga centraliza o alvo em ambas as posições.
2. Conexão de detecção e eletrônica
   1. Configure o módulo de detecção srs. Coloque um cuber divisor de feixe após o condensador para direcionar o laser transmitido para o módulo fotodiodo. O módulo inclui um telescópio para retransmitir e alterar o tamanho do feixe para se encaixar na área ativa do fotodiodo, bem como um filtro óptico para remover o feixe de Stokes modulado e deixar o feixe da bomba passar para a desmodulação.
   2. Configurar a conexão eletrônica(Figura 1). A intensidade do feixe de Stokes é modulada por um EOM embutido a 20 MHz dentro do laser picosegundo tunable. A saída de frequência de modulação do laser é entrada no amplificador lock-in como a frequência de referência para demodulação. Alimente o sinal de saída do fotodiodo no amplificador de travamento para desmodular o SRL.
      NOTA: Os sistemas laser de uma caixa podem ser atualizados e, portanto, suas especificações podem variar devido a diferentes datas de produção. A versão anterior do sistema laser picosegundo tunable, usado neste protocolo, tem um feixe stokes de 1.064 nm, mas a versão recente tem um feixe Stokes de 1.031 nm. A frequência de modulação do EOM usado neste protocolo é personalizada a 8 MHz, mas a frequência de modulação padrão para o sistema recente pode ser de 10 ou 20 MHz.
   3. Finalmente, alimente a saída do amplificador de travamento na caixa analógica do microscópio para converter sinal analógico elétrico em sinal digital. O sistema deve estar pronto para processar o sinal SRS.
3. Otimizar as condições de imagem
   1. Faça uma amostra química para alinhamento do sistema. Por exemplo, use dodecano para otimizar o microscópio, porque o dodecano tem um sinal SRS muito forte das ligações C-H. Use um selo seguro para fazer uma mini câmara; coloque 5 μL de dodecano e cubra-o com um deslizamento de tampa.
      NOTA: Substitua a amostra de dodecano uma vez que pareça pouco clara ou apresente detritos, com uma nova amostra que poderia ser usada para alinhamento por 2-3 meses.
   2. Coloque a amostra no estágio do microscópio. Concentre-se corretamente na gota líquida. Pode ser feito mais rápido procurando a borda do bloco dodecano. Ajuste o condensador para iluminação Kohler.
   3. Defina os parâmetros de imagem. Verifique se a etapa de atraso está nos números certos. Coloque o comprimento de onda do feixe da bomba para 795,8 nm. Usando um cartão de sensor IR e um visualizador de RI, verifique se o caminho do feixe da bomba ainda está correto.
   4. Defina a potência do feixe da bomba para 200 mW e o feixe stokes para 400 mW no painel de controle do sistema picosegundo.
      NOTA: Os throughputs de laser da saída a laser para o objetivo pós dos dois feixes são aproximadamente 25% para a bomba e 14% para Stokes para esta configuração do sistema. Portanto, uma potência pós-objetiva do feixe de bomba é de aproximadamente 50 mW e para o feixe stokes é em torno de 56 mW. A largura de pulso do recente sistema laser picosegundo mudou de 6 ps para 2 ps, portanto, a potência laser aplicada deve ser ainda menor.
   5. Defina o ganho do amplificador de travamento ao máximo. Abra o obturador tanto para os feixes, quanto para o obturador principal do laser.
   6. Escaneie a amostra e verifique a imagem na tela do computador. Altere o modo de exibição para Hi-Lo no software de imagem. Ajuste o intervalo para ver uma saturação de ~50%. Verifique se a saturação está centrada na imagem. Caso não, ajuste cuidadosamente os espelhos de direção, M1 e M2, para maximizar a intensidade da imagem e centralizar a intensidade máxima.
   7. Ajuste ajuste o estágio de atraso e encontre a intensidade máxima do sinal SRS a partir da amostra dodecane. O sistema está então pronto para uso.

2. Preparação de amostras de C. elegans para imagens de microscopia SRS

NOTA: Como organismos modelo, os elegans de Caenorhabditis provaram ser muito úteis para múltiplas técnicas de imagem. São transparentes em todo o corpo, portanto, vários tecidos podem ser imagens no animal intacto sem a necessidade de dissecção. Em C. elegans, lipídios neutros são armazenados em gotículas lipídicas localizadas no intestino, que consiste em 20 células epiteliais localizadas bisemetricamente ao redor do lúmen intestinal¹⁶. Células hipodérmicas e oócitos também armazenam lipídios. A principal forma de armazenamento de lipídios em C. elegans gotículas lipídicas são os triacylglycerols (TAGs)¹⁷, que geram fortes sinais de SRS devido à abundância de ligações CH₂ presentes em suas cadeias de ácidos graxos. Esta seção se concentrará em como preparar amostras de C. elegans para imagens de microscopia SRS e quantificação de seus níveis totais de armazenamento lipídado intestinal.

1. Preparação dos slides de imagem
   1. Primeiro, prepare 2% de solução agarose em H₂O destilado, e certifique-se de que toda a agarose derrete antes de preparar as almofadas agarose.
   2. Adicione uma gota de 2% de agarose quente em um slide em branco (aproximadamente 100 μL) que é colocado entre slides de suporte com duas camadas de fita de laboratório e coloque rapidamente um segundo slide em cima do primeiro slide. Pressione suavemente para criar uma almofada fina e até mesmo agarose.
   3. Coloque esses slides de lado em posição fechada e não os separe até que os vermes estejam prontos para serem montados. Prepare slides frescos antes de cada sessão de imagem, pois as almofadas secarão após 1 dia.
      NOTA: Use câmaras de imagem multi-poços, se a imagem de vários worms em telas genéticas de alto rendimento¹⁸. Use configurações de imagem ao vivo para imagem da dinâmica espátula-temporal do metabolismo lipídico através do desenvolvimento e envelhecimento¹⁹.
2. Montando os vermes
   1. Prepare o agente anestesizante adicionando azida de sódio ou levamisole no tampão M9 à concentração final de 100 mM ou 1 mM, respectivamente.
      NOTA: Use levamisole se os vermes precisarem ser recuperados após a imagem para genotipagem após as telas genéticas.
      ATENÇÃO: Vários agentes anestesizantes, incluindo azida de sódio e levamisole, são prejudiciais se inalados. Use luvas de proteção e roupas, bem como use um capuz de fumaça química ao preparar essas soluções de trabalho.
   2. Coloque uma gota de agente anestesiante em um deslizamento de tampa (aproximadamente 4-5 μL para 10-20 worms).
      NOTA: Ajuste a quantidade do agente anestesiador de acordo com o número do verme para manter os vermes o mais próximos possível. Usar muito líquido para poucos vermes pode fazer com que os vermes se espalhem na almofada de agarose.
   3. Escolha os vermes a serem imagens sob a microscopia de dissecção e transfira-os para a gotícula do agente anestesiante. Depois que todos os worms forem adicionados à gota, mova-os usando o colhedor de vermes e certifique-se de que eles não se sobrepõem uns aos outros.
   4. Separe os slides de vidro (da etapa 2.1) sem perturbar a almofada agarose.
   5. Cubra a gota de verme com o escorregador de vidro que tem a almofada de agarose. Certifique-se de que a almofada de agarose está voltada para os vermes. Alternativamente, a gotícula de envelhecimento anestesiante também pode ser adicionada na almofada de agarose e os vermes podem ser cobertos com o deslizamento de tampas.
   6. Finalmente, marque a localização dos vermes usando um marcador permanente no escorregador de vidro.

3. Aquisição e análise de imagens

1. Aquisição das imagens usando o sistema de microscópio SRS.
   1. Antes de fotografar qualquer amostra, determine os parâmetros de imagem e verifique os sinais de SRS (conforme explicado no Protocolo 1).
   2. Monte o slide com a mancha de cobertura voltada para a lente objetiva. Ligue a fonte de luz de campo brilhante e direcione-a para a ocular para localizar os vermes.
      NOTA: Use uma lente objetiva de 20x para imaginar o armazenamento lipídudo em todo o intestino. Considere usar uma lente objetiva de 60x para imagem de armazenamento de gordura hipodérmica ou para quantificar o tamanho/número da gota lipídica.
   3. Coloque os vermes em foco e ajuste a posição do condensador de acordo.
   4. Desligue a fonte de luz de campo brilhante e mude para a unidade de varredura a laser. Comece a digitalizar o primeiro worm a uma taxa de varredura rápida (por exemplo, 512 x 512 pixels), e ajuste o foco fino para encontrar a área de interesse. Para que a primeira amostra seja imageda, ajuste os poderes laser ao nível onde os sinais SRS não estão saturados.
   5. Mude para uma taxa de varredura mais lenta (por exemplo, 2 μs/pixel) e maior resolução (por exemplo, 1024 x 1024 pixels) para obter a imagem SRS.
      NOTA: Mantenha os poderes de laser constantes para que cada amostra seja imagen durante a sessão de imagem.
   6. Salve a imagem SRS no formato desejado que permite alta resolução (como um arquivo .tiff). Dependendo do software de imagem e configuração usado, salve a localização do primeiro worm antes de passar para o próximo.
   7. Imagens completas de todos os vermes que foram montados no slide. Desligue o obturador para bloquear os raios laser. Não desligue a fonte de laser até que todas as amostras sejam imagens.
   8. Remova o slide antes de colocar o próximo slide de amostra. Repetição de passos 3.1.2-3.1.7.
   9. Uma vez que todas as amostras tenham sido imagens, coloque a fonte laser em espera e desligue o equipamento associado, incluindo o amplificador, o detector, o microscópio e o computador.
2. Análise de imagens usando ImageJ
   1. Abra os arquivos de imagem (geralmente .tiff) a serem quantificados no ImageJ, selecionando os arquivos e arrastando-os e soltando-os na janela ImageJ. Baixe os plug-ins imageJ apropriados, se usar formatos específicos de microscópio Olympus (como arquivos .oib).
   2. Selecione as propriedades a serem analisadas(Analisar > definir medidas). Para a quantitação total de armazenamento lipídico, selecione Área, Valor Cinza Min e Max e Valor Cinza Médio.
   3. Use a ferramenta de seleção de polígonos e delineie a região do intestino do verme a ser quantificada. Para medir os parâmetros selecionados na etapa 3.2.2, clique em Analisar > Medida. Uma nova janela com os resultados de medição aparecerá. Repita este passo para todas as imagens abertas.
   4. Selecione as medições para todos os worms em um determinado genótipo e copie/cole os resultados para uma nova planilha. Repita as etapas 3.2.1-3.2.4 para todos os genótipos na mesma sessão de imagem.
   5. Selecione uma área nas proximidades do worm que não tenha nenhum sinal SRS, para quantificar como plano de fundo. Certifique-se de que a área selecionada para medição de fundo não contenha nenhuma bactéria ou detrito que também possa dar um sinal SRS.
   6. Subtrair o valor cinzento médio de fundo das medidas de cada verme individual. Calcule o desvio médio e padrão dos valores médios de cinza subtraídos de todos os vermes em um determinado grupo de genótipo/teste. Normalize esse valor para a média do grupo controle.
   7. Finalmente, realize a análise estatística adequada usando o valor cinzento médio como medida para os níveis lipídes de cada verme. Normalmente, use o teste tdo Student para dois grupos e use ANOVA unidirecional com um teste de comparação múltipla apropriado para mais de dois grupos.
      NOTA: Ao selecionar imagens para apresentação de figuras, certifique-se de que essas imagens selecionadas tenham a mesma distribuição de intensidade de pixel. Defina o brilho e contraste com os mesmos valores para todas as imagens na mesma figura (Imagem > Ajuste > Brilho e Contraste).

Resultados

A sinalização de insulina é um importante caminho endócrino que impacta o desenvolvimento, a reprodução, a vida útil e o metabolismo. Em vermes, a sinalização de insulina consiste em cerca de 40 ligantes de peptídeo semelhantes à insulina, ortopal receptor de fator de crescimento semelhante à insulina DAF-2, cascata de quinase PI3K/AKT a jusante, e ortopal do fator de transcrição FoxO, DAF-16²⁰. mutantes daf-2, que não possuem o receptor de insulina, têm mais gotículas li...

Discussão

Em defesa contra a obesidade e seus distúrbios metabólicos associados, importantes esforços de pesquisa têm sido implementados para entender melhor os mecanismos regulatórios da homeostase lipídica. Para a detecção quantitativa de moléculas lipídicas em amostras biológicas, a imagem livre de rótulos por microscopia srs tem sido comprovadamente uma alternativa confiável para ensaios bioquímicos e outros métodos de coloração. Nosso grupo e outros revelaram novos mecanismos biológicos na regulação metab?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
A/D converter	Olympus	Analog Unit
Agarose	GeneMate	3119	For making agarose pads
Alignment tool - adapter	Thorlabs	SM1A4	For mounting the tool on scope
Alignment tool - target	Thorlabs	VRC2SM1	For viewing IR laser
Alignment tool - tube	Thorlabs	SM1L40	Length can vary
Autocorrelator (Optional)	APE	pulseCheck
Bandpass filter	minicircuits	BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz	For signal with modulation frequency filtering
BNC cables
Dissection microscope	Nikon	SMZ800	For handling and picking worms for imaging
Dodecane	Sigma-Aldrich	44010	Used for calibration of the SRS signal
Filter	Chroma Technology	890/220 CARS	For removing Stokes beam
General purpose laboratory labeling tape	VWR	89097	For making agarose pads
Glass coverslips	VWR	48393-106	For covering worms for imaging
Glass microscope slide	VWR	16004-422	For making agarose pads
Laser scanning microscope	Olympus	FV3000
Lens	Thorlabs	L1: AC254-050-B L2: AC254-075-B	For beam expander
Lock-in amplifier	Zurich	HF2LI
Lowpass filter	minicircuits	BLP-1.9+	For power supply noise suppression
Mirrors	Thorlabs	BB1-E03	For relay and periscope
Objective	Olympus	UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20
Photodiode	Thorlabs	FDS1010
Picosecond laser source	APE	picoEmerald
Power supply	TEKPOWER	TP1342U	For photodiode, reversed 50V voltage
Sodium azide	Sigma	S2002	For anaesthesizing the worms
Worm picker	WormStuff	59-AWP