Dissecção e Live-Imaging do Drosophila Gonad embrionário tardio

Resumo

Aqui, fornecemos um protocolo de dissecção necessário para a imagem viva da gônada masculina Drosophila . Este protocolo permitirá a observação de processos celulares dinâmicos em condições normais ou após manipulação transgênica ou farmacológica.

Resumo

A gônada embrionária masculina Drosophila melanogaster é um modelo vantajoso para estudar vários aspectos da biologia do desenvolvimento, incluindo, mas não se limitando ao desenvolvimento de células germinativas, biologia piRNA e formação de nicho. Aqui, apresentamos uma técnica de dissecção ao vivo da gônada ex vivo durante um período em que a imagem ao vivo in vivo é altamente ineficaz. Este protocolo descreve como transferir embriões para um prato de imagem, escolher embriões masculinos adequadamente encenados e dissecar a gônada de seu tecido circundante, mantendo sua integridade estrutural. Após a dissecção, as gôngas podem ser imagens usando um microscópio confocal para visualizar processos celulares dinâmicos. O procedimento de dissecção requer tempo e destreza precisos, mas fornecemos informações sobre como prevenir erros comuns e como superar esses desafios. Pelo que sabemos, este é o primeiro protocolo de dissecção para a gônada embrionária Drosophila , e permitirá imagens vivas durante uma janela de tempo inacessível. Esta técnica pode ser combinada com manipulações transgênicas específicas do tipo farmacológico ou celular para estudar quaisquer processos dinâmicos que ocorram dentro ou entre as células em seu ambiente gonadal natural.

Introdução

O teste de melanogaster Drosophila tem servido de paradigma para nossa compreensão de muitos processos celulares dinâmicos. Estudos desse modelo lançaram luz sobre a regulação da divisão de células-tronco ^1,2,3, desenvolvimento de células germinativas ^4,5, biologia piRNA ^6,7,8 e eventos de sinalização de células-tronco de nicho ^{9,10,11,12,13}. Este modelo é vantajoso porque é geneticamente tratável^14,15 e é um dos poucos onde podemos viver células-tronco em seu ambiente natural ^3,16,17,18. No entanto, a imagem viva deste modelo tem sido limitada ao tecido adulto e aos estágios embrionários iniciais, deixando uma lacuna em nosso conhecimento da dinâmica gonadal no embrião tardio, o estágio preciso quando o nicho está se formando e começando a funcionar.

A gônada embrionária em estágio tardio é uma esfera, consistindo de células de nicho somáticas no anterior, e células germinativas enciontadas por células gândalos somáticas em todas as regiões mais posteriores¹⁹. Este órgão pode ser retratado ao vivo até o início do estágio 17 17,20,21. Novas imagens são evitadas devido ao início de contrações musculares em larga escala. Essas contrações são tão severas que empurram a gônada para fora do quadro de imagem, e tal movimento não pode ser corrigido com software de imagem. Nosso laboratório está interessado em desvendar os mecanismos de formação de nicho, que ocorre durante esse período indescritível para imagens ao vivo. Por isso, geramos uma abordagem ex vivo para imagem viva da gônada a partir do Estágio 16 embrionário, facilitando o estudo da dinâmica celular durante esse período crucial de desenvolvimento da gônada. Trabalhos anteriores do nosso laboratório mostram que essa imagem ex vivo recapitula fielmente o desenvolvimento da gônsia vivo ¹⁷. Esta técnica é a primeira e única do seu tipo para a gônus embrionária Drosophila.

Aqui, apresentamos o protocolo de dissecção necessário para ex vivo live-imaging da gônada durante estágios embrionários tardios. Este protocolo pode ser combinado com tratamentos farmacológicos, ou manipulação transgênica de linhagens celulares específicas dentro da gônada. Usando essa técnica, temos imagens com sucesso dos passos da formação do nicho de células-tronco¹⁷. Essa abordagem de imagem é, portanto, fundamental para o campo da biologia das células-tronco, pois permitirá a visualização dos estágios iniciais de formação de nicho em tempo real dentro de seu ambiente natural^15,17. Embora este método seja benéfico para o campo da biologia das células-tronco, é adicionalmente aplicável para visualizar quaisquer processos dinâmicos que ocorram na gônada durante este ponto de tempo de desenvolvimento, incluindo rearranjos celulares²², adesão celular ^2,12,23 e migração celular²³. Esse protocolo de dissecção aumentará assim nossa compreensão de muitos processos biológicos celulares fundamentais.

Protocolo

1. Preparação do dia-anterior à dissecação

1. Afie eletróticamente uma agulha de tungstênio²⁴ para que o diâmetro resultante seja de aproximadamente 0,03 mm. Ajuste a tensão fornecida a aproximadamente 14 V e use 3,3 M NaOH. A nitidez não deve levar mais do que 1 ou 2 min.
   ATENÇÃO: O NaOH é altamente corrosivo e causará queimaduras após o contato com a pele. Use luvas e óculos durante o manuseio, e trabalhe dentro de um capô de fumaça.
   NOTA: Após o uso, armazene NaOH em um tubo Falcon de polipropileno.
2. Faça a mídia de imagem preparada. Em um tubo cônico de 15 mL, combine 4,25 mL da mídia de Schneider com 750 μL de Soro Bovino Fetal (FBS, 15% de concentração final) e 27,5 μL de penicilina-estreptomicina (0,05 U/μL de Penicilina, 0,05 μg/μL de concentração final). Armazene esta mídia de imagem preparada a 4 °C.
3. Faça solução de cola de heptano. Adicione cerca de 0,5 mL de heptano a um frasco vedado de 20 mL recheado com cerca de 20 cm de fita dupla face. Arrase em um nutador por cerca de uma hora, ou mexa com uma ponta de pipeta até que se alcance uma consistência entre a água e o glicerol. Esta solução de cola dissolvida durará vários dias antes que o heptano evapore. Para refrescar a solução, adicione um heptano adicional de 0,5 mL e rocha.
   NOTA: Uma solução eficaz de heptano-cola pode ser preparada usando várias proporções de heptano para fita, bem como diferentes durações de balanço/agitação. As especificações acima são apenas sugestões para preparar ou refrescar uma solução tão adequada.

2. Coleta de embriões — 15-17 h antes da dissecação

1. Adicione pasta de levedura fresca a um prato de ágar de suco de maçã²⁵. Configure uma gaiola de coleta de embriões adicionando moscas adultas (com menos de 10 dias de idade) a uma garrafa de comida vazia, perfurada com pequenos buracos²⁶. Tampe a gaiola de coleta usando a placa de ágar leveasted, colada na garrafa, e coloque a gaiola com o lado da placa para baixo em uma incubadora escura de 25 °C por 1h.
   NOTA: As moscas devem expressar um transgene que marcará fluorescentemente a gônada, por exemplo, seis eGFP::Moesin²⁰, porque a dissecção dos embriões ocorrerá sob um microscópio estéreo-fluorescente. Consulte Tabela de Materiais para obter uma lista de genótipos usados para marcar a gônego.
2. Retire a gaiola da incubadora e descarte esta primeira coleção. Substitua-o por uma placa de ágar recém-leveasted e coloque a gaiola de volta na incubadora por 2h.
   NOTA: A primeira coleção de embriões é usada para limpar fêmeas de embriões fertilizados e em desenvolvimento, para alcançar uma segunda coleção de embriões bem cronometrados.
3. Retire a placa de ágar da gaiola e coloque-a (com o lado levemente voltado para cima) em uma toalha de papel úmida dentro de um recipiente de plástico vedado. Coloque esta câmara úmida em uma incubadora de 25 °C para envelhecer os embriões por 14,5 h (idades finais, 14,5-16,5 h após a colocação do ovo).
   NOTA: Imediatamente antes do início da etapa 2.4, complete as etapas 3.1 e 3.2.
4. Retire a placa de ágar da incubadora e, usando uma garrafa de esguicho, adicione água suficiente à placa de ágar para dissolver a pasta de levedura escovando levemente com um pincel. Enxágüe os embriões e levedura dissolvida em uma pequena cesta de tela de malha sentada dentro de um barco de pesagem. Enxágüe a cesta com a garrafa de esguicho de água até que a maioria da pasta de levedura tenha filtrado através da malha.
5. Retire a água do barco de pesagem e coloque a cesta de volta dentro. Descoro os embriões imergindo-os em uma solução de alvejante de 50%, usando uma garrafa de esguicho. A solução de alvejante deve ter uma profundidade de 3-5 mm. Mantenha os embriões submersos em alvejante por ~2 min, com redemoinhos ocasionais.
   ATENÇÃO: Alvejante é corrosivo e pode irritar ou danificar os olhos e o trato respiratório. Use luvas e óculos enquanto manuseia alvejante.
   NOTA: Durante este tempo, complete o máximo possível da etapa 3.3. O progresso da descorção pode ser verificado colocando a cesta sob um microscópio estéreo e verificando a ausência dos apêndices dorsais. Submergir os embriões na solução de alvejante por mais tempo, se necessário.
6. Descarte o alvejante e enxágue bem os embriões dentro da cesta com água de uma garrafa de esguicho (por ~3 s, manchando a cesta de malha com toalhas de papel; repita 2-3 vezes).

3. Preparação do dia da dissecação

1. Adicione 30 μL de insulina (10 mg/mL) a 1.500 μL de mídia de imagem preparada (ver passo 1.2) em um tubo Eppendorf de 1,5 mL (concentração final de 0,2 mg/mL). Misture bem e deixe o tubo no banco para equilibrar a temperatura ambiente.
2. Prepare as tiras de deslizamento revestidas com cola.
   1. Use uma faca com ponta de diamante para cortar uma tampa de 22 mm x 22 mm em quatro tiras de tamanho igual (Figura 1A).
   2. Use fórceps para pegar uma tira e espalhar um total de aproximadamente 30 μL de solução de cola de heptano em ambos os lados da tira (Figura 1B). Para obter uma camada uniforme de resíduo de cola, incline a tira em vários ângulos enquanto o heptano evapora.
   3. Armazene a tira coberta de cola em um entalhe vazio de uma caixa de deslizamento de tampas; para manter sua pegajosa, coloque a tira em uma posição inclinada, mas vertical, encostada nas bordas da caixa para minimizar o contato com superfícies da caixa (Figura 1C). Feche a caixa para que as partículas no ar não vestem a cola e diminuam sua pegajosa.
3. Coloque os seguintes itens na bancada: uma pipeta Pasteur de vidro de 6 polegadas, um slide de microscópio, um P200 e um pipeteiro P1000 com as pontas de pipeta apropriadas, a solução^{ringer 27} (pH ajustada a 7,3 com NaOH) e um prato de imagem de 35 mm revestido de Poli-D-Lysine.
4. Transfira embriões da cesta de tela de malha para um pequeno vidro de relógio cheio de heptano de 500 a 750 μL.
   1. Borrihe as laterais e o fundo da cesta secos com uma limpeza de tecido. Umedeça um pincel no heptano, toque o pincel nos embriões (a membrana de vitellina hidrofóbica deve aderir às cerdas), e mergulhe o pincel de volta no heptano no vidro do relógio (embriões devem afundar até o fundo).
      NOTA: Os próximos passos devem ser realizados o mais rápido possível para evitar que os embriões sequem. Embriões não devem ser expostos ao ar por mais de 20 anos.
5. Transfira os embriões para o slide do microscópio usando uma pipeta Pasteur (Figura 1D). Desenhe embriões na pipeta lentamente e limite-os à porção estreita da pipeta. Embriões pipetas no slide lentamente, de tal forma que eles se agregam apenas dentro da ponta da pipeta antes de fluir para o slide. Torça o canto de uma limpeza de tecido em uma ponta fina, e afaste o heptano dos embriões na lâmina. Eles agregarão e cobrirão uma área menor, facilitando a captura deles em uma tira coberta de cola na próxima etapa.
6. Com fórceps, pegue uma tira coberta de cola e toque suavemente nos embriões (Figura 1E). Coloque a tira no prato de imagem, embrião lado para cima, e fora do centro revestido de Poli-D-Lysine. Pressione a tira sobre o prato usando fórceps, para garantir que ela esteja fixada no lugar. Inundar imediatamente o prato com solução ringer de 2-3,5 mL; submergir os embriões primeiro para evitar que eles sequem (Figura 1F).

4. Dissecção

NOTA: Estas etapas devem ser realizadas sob um microscópio estéreo-fluorescente.

1. Devitellinize 10-15 embriões.
   NOTA: Isso pode variar de dois embriões, para iniciantes, até quinze embriões, para especialistas.
   1. Selecione os embriões do Estágio 16 com base na morfologia intestinal (Figura 2). Nesta fase, os embriões possuem três constrições intestinais que criam quatro segmentos intestinais empilhados (Figura 2B,B'). Para iniciar a devitellinização, fure o embrião selecionado em uma extremidade, de preferência o anterior, com a agulha de tungstênio. O embrião pode sair de sua membrana vitelline, mas se não, retire a membrana do embrião.
      NOTA: Embriões muito jovens para dissecar têm tripas não regionalizadas (Figura 2C). A dissecção dos embriões estágio 17 é possível, mas mais desafiadora do que a dissecção dos embriões estágio 16 porque a cutícula está começando a se desenvolver nesta fase. Os embriões do Estágio Inicial 17 apresentam quatro segmentos intestinais que são deslocados em relação um ao outro (Figura 2D,D').
   2. Enganchar a agulha através do embrião em uma região longe das gôndas. Transfira o embrião fisgado para a região revestida de poli-lise do prato (a partir de agora referido como simplesmente "deslizamento de cobertura") e arraste-o contra o fundo até que ele adere. Repita esses passos e organize embriões devitellinizados em uma fileira ao longo do topo do deslizamento de cobertura revestido de poli-lise (Figura 3A), deixando muito espaço abaixo para dissecção posterior.
      NOTA: As gônadas aparecem como pequenos agregados esféricos de células que devem fluoretar brilhantemente, dependendo do marcador específico usado e do número da cópia transgênica. Nesta fase, as gônadas estão localizadas lateralmente no segmento A5, a aproximadamente 70%-80% do comprimento do embrião do anterior. Durante todo o protocolo de dissecação, o tecido pode grudar na agulha. Para livrar a agulha dos detritos, elevá-la logo acima da superfície da solução do Ringer. A devitellinização pode ser desarrumada desde que a gônada adequada seja perturbada o mínimo possível.
2. Finesse as gônnas para fora do embrião e para o prato (Figura 3C,D).
   1. Primeiro, filé do embrião para expor seu interior (Figura 3C). Corte o embrião do centro, movendo a agulha posteriormente, entre as gôndas. Provoque algum tecido interno, pois isso vai grudar no prato muito melhor do que a cutícula externa. A pegajosa do tecido permitirá que as próximas manipulações revelem a gônda e permitam que ela adere ao deslizamento da tampa.
      NOTA: Se o tecido não estiver grudado no prato, tente persuadi-lo a uma região não contaminada do deslizamento de cobertura revestido; as regiões externas do deslizamento de cobertura serão particularmente pegajosas. Como dito na etapa 4.1.2, não importa se as manipulações de dissecção resultam em uma carcaça de embrião mutilada, desde que as gônadas permaneçam ilesas.
   2. Use a agulha para cortar em torno de uma gônada até que um pedaço de tecido, incluindo a gônada, seja separado da carcaça restante. Com a agulha, desenhe este tecido para uma região fresca de deslizamento de cobertura revestido, e persuada-o contra o fundo até que ele adere ao prato.
      NOTA: A melhor imagem será obtida para os casos em que a gônus se prende diretamente ao deslizamento da tampa, em vez de fixação indireta através de tecido sobrelado. Portanto, como o tecido é guiado para longe da carcaça, tente fazer com que a gônada toque primeiro na tampa, em vez de tecido ínteo.
   3. Remova o máximo possível de tecido circundante da gônada (Figura 3D) arrastando suavemente tecido aderente para longe da gônada com a agulha. Evite tocar diretamente na gônda, o que a danificaria (Figura 4E). Para garantir que a gônada esteja suficientemente aderida ao prato, mova a agulha em um movimento circular suave ao redor da gônada — se ela se mover, toque a agulha no tecido aderente restante e direcione a gônada em direção a uma região fresca de deslizamento de cobertura pegajosa. Repita este processo até que não haja movimento detectável da gônus.
   4. Volte para a carcaça do embrião e disseca a segunda gônada. Repita este processo no maior número possível de embriões, mas NÃO exceda 25 min. A viabilidade tecidual será comprometida na solução de Ringer após mais de ~40-45 min.
3. Após a conclusão das dissecções, use um marcador indelével para adicionar marcas de registro à borda externa da placa de imagem para registrar sua orientação durante a dissecção.
4. Retire a tira revestida de cola do prato.
   1. Insira suavemente o pino inferior de um par de fórceps sob a tira, fecho e lentamente incline a tira para cima para libertá-la do prato com o menor sloshing da solução do Ringer possível para minimizar a perturbação das gôndas aderidas.
      NOTA: A tira deve ser inclinada para longe das gônadas dissecadas.
5. Leve suavemente o prato para o microscópio de imagem de uma maneira que evite a inclinação da solução do Ringer.

5. Imagem

1. Coloque o prato de imagem no suporte do palco, utilizando as marcas de inscrição para colocar o prato na orientação aproximada como durante a dissecção. Usando microscopia de campo brilhante e um objetivo de baixa potência (~10x), identifique e coloque em foco qualquer pedaço de tecido que seja aderido ao deslizamento da tampa. Alterne as configurações da ocular para revelar fluorescência, e usando as oculares binóculos, digitalize sistematicamente o prato, marcando a posição de cada gônada dentro do software de imagem (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Certifique-se de que as gônadas estão centradas no campo de visão antes de marcar posições.
2. Retire suavemente toda a montagem do suporte do palco, com o prato de imagem em seu suporte, e coloque a montagem na bancada de trabalho.
3. Substitua a solução do Ringer pela mídia de imagem preparada contendo insulina (ver passos 1.2 e 3.1).
   1. Use um P1000 para remover toda a solução de Ringer da borda superior interna do prato de imagem (não pipete Ringer's da região central de deslizamento de cobertura). Em seguida, mude para um P200, e coloque sua ponta logo abaixo da superfície do Ringer restante na região central. Remova cuidadosamente 50-100 μL de Ringer;; NÃO remova toda a solução.
   2. Elasenhe ~200 μL de mídia de imagem e, novamente colocando a ponta P200 logo abaixo da superfície do Ringer restante, adicione lentamente esta mídia de imagem. Em seguida, adicione a mídia de imagem restante (~1.300 μL) ao prato, começando na borda mais externa da borda superior. Enquanto pipeta, mova-se em direção à cúpula central do fluido, e eventualmente mescle os dois escovando a ponta da pipeta através de ambos. Coloque a tampa no prato.
      NOTA: A mídia de imagem deve cobrir todo o diâmetro interno do prato, com uma profundidade de cerca de 2 mm, para evitar a evaporação (Figura 4D).
4. Mude o microscópio para um objetivo de maior potência (63x, 1.2 NA), aplique o fluido de imersão adequado com base no objetivo utilizado (tipo de fluido de imersão e índice de refração exigido pelo objetivo) e, em seguida, substitua o conjunto do suporte de palco. Use microscopia brightfield para se concentrar no tecido aderido à parte inferior da placa de imagem.
   NOTA: Se a etapa não foi movida, a última gôndama deve ser vista assim que o objetivo estiver focado.
5. Passe por cada posição de gôngeia marcada e ajuste essa posição, conforme necessário. Selecione quais gôndas à imagem com base na clareza de imagem, sexo gôndado, etc. Personalize as configurações de imagem (multicanal, tempos de exposição, intensidades de laser, incrementos da série Z, lapso de tempo com intervalos apropriados, etc.). Comece a imagem.
   NOTA: As gôngas masculinas podem ser identificadas pela presença de um nicho, e na extremidade oposta da gônada, um aglomerado de pequenas células somáticas altamente circulares chamadas precursores gândalos somáticos específicos do sexo masculino (msSGPs). Se o marcador fluorescente de seis eGFP::moesin for usado, as células de nicho são as segundas células mais brilhantes na gônada, sendo a mais brilhante os msSGPs. Nesta fase, as gôndas femininas não têm um nicho nem msSGPs.

Resultados

Ilustramos a preparação do prato de imagem na Figura 1, como descrito na "preparação do dia da dissecação". Esses métodos devem, em última análise, resultar em embriões bem hidratados aderidos a uma tira de deslizamento de cobertura, que é temporariamente fixada na parte inferior do prato e submersa na solução de Ringer (Figura 1F). Uma faca de ponta de diamante permite que se corte limpamente uma tampa de 22 x 22 mm em três a quatro tiras menores ...

Discussão

Durante a gonadogênese, a gônada embrionária, e particularmente o nicho de células-tronco dentro da gônada masculina¹⁵, sofre rápidas alterações morfológicas. Mecanismos de desenvolvimento que fundamentam essas mudanças dinâmicas são melhor compreendidos através de técnicas de imagem ao vivo. No entanto, no estágio 17 embrionário, a imagem in vivo da gônada torna-se impossível pelo início das contrações musculares em larga escala¹⁷. Com este pr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alfa Aesar Tungsten wire	Fisher Scientific	AA10408G6	0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis)
D. melanogaster: His2Av::mRFP1	Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)	FBtp0056035	Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007
D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato	Gift from Ruth Lehmann Lab		Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3'
D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin		FBtp0083398	Sano et al., PLoS One, 2012
Diamond-tipped knife
Double-sided tape	Scotch	665
Fetal Bovine Serum	GIBCO	10082
Imaging dish	MatTek	P35GC-1.5-14-C
Imaging software	Molecular Devices		MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0
Insulin, bovine	Sigma	l0516	Store aliquots at 4 °C
Needle holder	Fisher Scientific	08-955
Nytex basket
Penicillin/streptomycin	Corning	30-002-Cl
Ringer's solution			2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved
Schneider's Insect Media	GIBCO	21720-024