Imagem e análise de fluorescência resolvidas no modelo 3D spheroid

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para a fabricação de um dispositivo de imagem esferoide. Este dispositivo permite imagens de fluorescência dinâmica ou longitudinal de esferoides de células cancerosas. O protocolo também oferece um simples procedimento de processamento de imagem para a análise da invasão de células cancerosas.

Resumo

A invasão de células cancerígenas do tumor primário para os tecidos saudáveis adjacentes é um passo inicial na metástase. As células cancerígenas invasivas representam um grande desafio clínico porque não existem métodos eficientes para sua eliminação uma vez que sua disseminação está em andamento. Uma melhor compreensão dos mecanismos que regulam a invasão de células cancerosas pode levar ao desenvolvimento de novas terapias potentes. Devido à sua semelhança fisiológica com tumores, os esferoides incorporados no colágeno tenho sido amplamente utilizado pelos pesquisadores para estudar os mecanismos que regem a invasão de células cancerígenas na matriz extracelular (ECM). No entanto, este ensaio é limitado por (1) falta de controle sobre a incorporação de esferoides no ECM; (2) alto custo de colágeno I e pratos de fundo de vidro, (3) rotulagem imunofluorescente não confiável, devido à penetração ineficiente de anticorpos e corantes fluorescentes e (4) processamento de imagem demorado e quantificação dos dados. Para enfrentar esses desafios, otimizamos o protocolo esferoide tridimensional (3D) para imagem fluorescente rotulada células cancerígenas embutidas no colágeno I, seja usando vídeos de lapso de tempo ou imagens longitudinais, e analisar a invasão de células cancerosas. Primeiro, descrevemos a fabricação de um dispositivo de imagem esferoide (SID) para incorporar esferoides de forma confiável e em um volume mínimo de colágeno I, reduzindo o custo do ensaio. Em seguida, delineamos os passos para rotulagem robusta de fluorescência de esferoides vivos e fixos. Finalmente, oferecemos uma macro Fiji fácil de usar para processamento de imagens e quantificação de dados. Ao todo, essa metodologia simples fornece uma plataforma confiável e acessível para monitorar a invasão de células cancerígenas no colágeno I. Além disso, este protocolo pode ser facilmente modificado para atender às necessidades dos usuários.

Introdução

Durante a progressão do câncer, as células cancerígenas podem adquirir um fenótipo motile e invasivo, permitindo-lhes escapar da massa tumoral e invadir os tecidos circundantes¹. Eventualmente, essas células cancerígenas invasivas podem alcançar e crescer dentro de órgãos secundários, um processo chamado metástase do câncer¹. A metástase causa mais de 90% das mortes relacionadas ao câncer². Uma das razões para isso é que, embora os tumores localizados sejam clinicamente gerenciáveis, não existem métodos eficientes para a eliminação de células cancerígenas invasivas uma vez que a propagação metastática tenha ocorrido. Portanto, o surgimento de células cancerígenas invasivas e a transição de uma doença localizada para uma doença invasiva está representando um grande desafio clínico. Determinar como as células cancerígenas iniciam e sustentam um comportamento invasivo pode levar ao desenvolvimento de novas terapias potentes.

O modelo esferoide 3D é uma plataforma ideal para investigar o comportamento motil das células cancerosas sob condições controladas, mas fisiologicamente relevantes³. De fato, neste ensaio, esferoides de células cancerosas são incorporados dentro da matriz extracelular (ECM), por exemplo, colágeno I, que imita um tumor simplificado. Em seguida, a imagem é usada para visualizar a invasão de células cancerígenas do esferoide para a matriz de colágeno. No entanto, vários desafios limitam esse procedimento.

O primeiro desafio ocorre na etapa de incorporação, onde a matriz de colágeno líquido pode se espalhar pela superfície do prato, fazendo com que o esferoide toque na parte inferior do prato. Consequentemente, as células do esferoide se espalham na superfície bidimensional (2D), quebrando a morfologia esferoide tridimensional (3D). Aumentar o volume de colágeno é uma solução eficiente, mas cara. Para evitar que as células se espalhassem na superfície 2D, mantendo um volume mínimo de colágeno, desenvolvemos um dispositivo de imagem esferoide (SID) delimitando uma inserção de polidimtilsiloxano de 3 furos de espessura (PDMS) em uma placa de fundo de vidro.

O segundo desafio do ensaio esferoide é a rotulagem de células cancerígenas em esferoides, que é limitada pela má penetração de anticorpos e corantes fluorescentes, um efeito que aumenta com o tamanho esferoide. Embora a solução ideal para rotular células seja o estabelecimento de linhas celulares expressando de forma estável proteínas fluorescentes, essa opção é restrita principalmente a linhas celulares imortalizadas e é limitada pela disponibilidade de quimeras de proteína fluorescente. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para a coloração de imunofluorescência de esferoides fixos, bem como o uso eficiente de um corante citoplasmado para rotular células imediatamente antes de incorporar o esferoide.

O terceiro desafio do ensaio esferoide é a falta de macros fiji simples para quantificação semi-automatizada da invasão celular ao longo do tempo. Para enfrentar esse desafio, descrevemos uma metodologia simples para analisar a área esferoide ao longo do tempo. Ilustramos as vantagens deste protocolo usando as linhas celulares 4T1 e 67NR como exemplos.

Protocolo

1. Fabricação de um Dispositivo de Imagem Esferoide (SID) para otimizar a incorporação de esferoides (Duração de 1 dia)

1. Crie o espaçador usando uma impressora 3D (Figura 1A, B e Arquivo Suplementar 1).
2. Pese uma proporção de 10:1 (wt/wt) de polímero base: crosslinker em um copo plástico [por exemplo, 20 g de polímero de base de etilbenzeno e 2 g de interlinker de resina de silicone para criar polidimethylsiloxano (PDMS)].
3. Misture bem a solução PDMS no copo de plástico usando uma pipeta descartável.
4. Coloque o copo de plástico em uma câmara de vácuo para remover as bolhas de ar da mistura. Solte rapidamente a pressão de vácuo para remover a pequena quantidade de ar presa na superfície da mistura e dissipar as bolhas de ar restantes.
5. Incubar o espaçador impresso em 3D a 100 °C por 5 minutos para aumentar sua flexibilidade.
6. Limpe as duas placas de vidro que serão usadas para construir o molde PDMS completamente, limpando-as com isopropanol 100%. Se as placas de vidro foram usadas anteriormente para lançar PDMS, certifique-se de remover qualquer PDMS velho restante raspando suavemente as placas de vidro com uma lâmina de barbear e limpando-as com isopropanol 100%.
7. Construa o molde colocando o espaçador impresso em 3D no meio das duas placas de vidro limpas.
8. Sele o molde usando grandes clipes de aglutinante nas bordas externas das placas de vidro. Coloque dois clipes de aglutinante na borda inferior e um no canto superior.
9. Inspecione a parte superior do molde para garantir que o espaçador esteja alinhado com as placas de vidro. Isso garante que não haverá deformações e que uma folha uniforme de PDMS será criada.
   NOTA: Se a folha resultante não for de espessura uniforme, os clipes precisam ser ajustados ligeiramente.
10. Corte a ponta de uma pipeta descartável (~2 cm da ponta) e adicione a mistura de PDMS a uma velocidade lenta e constante ao canto superior esquerdo do molde. Despeje a mistura lentamente para evitar a criação de grandes bolsões de ar.
11. Coloque o molde em uma câmara de vácuo para remover bolhas de ar que se formaram durante o derramamento.
12. Cure o PDMS incubando o molde a 100 °C por 1 h.
13. Recupere o molde da incubadora e deixe esfriar para tocar.
14. Remova os clipes de aglutinante e as placas de vidro do espaçador contendo o PDMS curado.
15. Use uma lâmina de barbear para cortar o selo que foi criado em todos os quatro lados do molde entre o espaçador e a placa de vidro. Com todos os quatro lados cortados, comece a separar o molde para revelar a folha PDMS no espaçador.
16. Retire cuidadosamente a nova folha PDMS do espaçador usando pinças.
17. Em um tapete de corte, solte discos PDMS de 17,5 mm de diâmetro da folha e, em seguida, soque três furos distribuídos uniformemente de 5,5 mm de diâmetro, usando socos de biópsia de tamanho diferente. Aqui esses discos PDMS de 3 furos são chamados de "inserções"(Figura 1C).
    NOTA: Cortes não uniformes feitos no PDMS, ou uma ligação defeituosa via tratamento plasmápico, podem resultar em vazamentos futuros.
18. Limpe cada inserção removendo suavemente quaisquer partículas de poeira usando fita adesiva.
19. Coloque as pastilhas em um pedaço de fita dupla face e enrole a fita ao redor da tampa de uma placa de Petri de 10 cm.
20. Coloque a tampa da placa de Petri na máquina de plasma, juntamente com os pratos abertos de fundo de vidro de 35 mm.
21. Ative a superfície das pastilhas e do vidro através do tratamento plasmá-plasmá-lo por 1 min a 300 mTorr. Uma varinha de plasma portátil pode ser usada.
22. Utilizando pinças, conecte rapidamente o lado positivo, ou seja, tratado, de uma inserção(Figura 1D) à parte de vidro de um prato de fundo de vidro(Figura 1E). Repita para todos os pratos.
23. Use o dedo indicador e o polegar para aplicar uma pressão uniforme enquanto gira o prato de fundo de vidro. Isso garantirá a fixação estável da inserção na placa de fundo de vidro.
24. Incubar os SIDs (Figura 1F) a 60 °C por 20 minutos para fortalecer a adesão entre vidro e PDMS.
25. Realize uma segunda rodada de tratamento plasmático nos SIDs, usando as mesmas configurações da etapa 1.21 ou com a varinha portátil. Isso fará com que a superfície PDMS livre adere à poli-L-lysina na solução de revestimento (ver 1,26).
26. Prepare-se recentemente as seguintes soluções.
    1. Solução de revestimento: 1x PBS contendo 0,01% (vol/vol) poli-L-Lysine [por exemplo, adicionar 10 μL de 0,1% (vol/vol) poli-L-Lysine a 90 μL de 1x PBS].
    2. Solução de crosslinking: Água destilada contendo 1x (vol/vol) glutaraldeído [por exemplo, adicionar 10 μL de glutaraldeído de 10x a 90 μL de água destilada].
    3. Solução de armazenamento: 1x PBS contendo penicilina-estreptomicina 10x (vol/vol) Penicilina-Streptomycina [por exemplo, adicionar 1 mL de Penicillin-Streptomicina a 9 mL de 1x PBS].
27. Adicione 35 μL de solução de revestimento por cada orifício e incubar por 1h à temperatura ambiente.
28. Aspire a poli-L-Lysine e enxágue todo o SID 3 vezes com água destilada.
29. Adicione 35 μL de solução de crosslinking por cada orifício incubado por 30 minutos à temperatura ambiente.
30. Aspire a solução de crosslinking e enxágue todo o SID 3 vezes com água destilada.
31. Adicione 70% de etanol em cada SID e coloque sob luz ultravioleta (UV) por 30 minutos.
32. Sob o capô, aspire o etanol e enxágue o SID 3 vezes com água destilada.
33. Adicione 2,5 mL de solução de armazenamento por cada SID.
    NOTA: Nesta fase, os SIDs podem ser armazenados a 4 °C durante uma semana. Observou-se que a força de ligação entre PDMS e vidro diminui ao longo do tempo. Além de uma semana, recomenda-se que os usuários testem os SIDs para possíveis vazamentos antes do uso. Para isso, aspire a solução de armazenamento e adicione 35 μL de 1x PBS em cada orifício. Após o uso, as pastilhas PDMS podem ser descascadas dos pratos de fundo de vidro. Para obter uma limpeza ideal dos pratos de fundo de vidro, várias lavagens com isopropanol e ácido clorídrico devem ser usadas para remover resíduos de PDMS.

2. Formação esferoide e incorporação em colágeno (Duração de 4 dias)

NOTA: Para imagens ao vivo de esferoides, longitudinalmente ou em vídeos de lapso de tempo, use uma linha celular expressando uma proteína citoplasmática e/ou fluorescente nuclear. Se essa linha de célula estiver disponível, siga as etapas descritas nesta seção. Alternativamente, na seção 3, propõe-se um protocolo para rotular células cancerígenas em esferoides usando um corante citoplasmado.

1. Formar esferoides de células 4T1 e/ou 67NR utilizando a técnica de queda suspensa, como descrito anteriormente^4,5,6,7, com 3.000 células/40 gotículas μL e um tempo de incubação de 3 dias. Adicione o atelocollagen bovino que eu solução por último e manter todas as soluções no gelo, em todos os momentos.
2. Identifique os esferoides corretamente formados usando um microscópio de campo brilhante.
3. Encha um tubo cônico de 15 mL com 8 mL de meio completo pré-aquecido.
4. Colete esferoides com uma pipeta P1000 e transfira para o tubo cônico de 15 mL. Molhe a ponta da pipeta, colocando algum meio completo dentro e fora para evitar que os esferoides grudem nas paredes internas da ponta da pipeta e limitem a perda de esferoides.
5. Deixe que os esferoides afundem no fundo do tubo e lave cuidadosamente os esferoides trocando o meio. Repita duas vezes.
6. Prepare uma solução de colágeno de 5 mg/mL I de acordo com as recomendações do fabricante (procedimento de gelação alternativa, veja cálculo exemplar abaixo). Substitua a água destilada por meio completo. Ao calcular o volume de meio a ser utilizado, leve-se em conta que os esferoides serão adicionados em 20 μL de meio completo [por exemplo, para um SID, 3 x 30 + (3 x 30) x 20 % = 108 μL de 5 mg/mL de colágeno I é necessário (prepare 20 % extra para explicar a perda de tubulação ao manusear fluidos viscosos); 22 μL de médio completo + 10,8 μL de 10x PBS + 1,2 μL de 1 M NaOH + 54 μL de 10 mg/mL de colágeno I].
7. Colete todos os esferoides em 20 μL de médio, utilizando uma pipeta P200, e adicione-os à solução de colágeno I preparada na etapa 2.6.
8. Misture lentamente a solução ao subir e descer para evitar a heterogeneidade na concentração de colágeno I, limitando a formação de bolhas. Mantenha a solução no gelo.
9. Remova a solução de armazenamento dos SID(s) e lave 3 vezes com 3 mL de PBS 1x. Após a lavagem final, deixe os SID(s) secos para não diluir a solução de colágeno I.
10. Inicie um temporizador e dispense 30 μL da solução de colágeno I contendo um esferoide em um dos três orifícios do SID. Certifique-se visualmente de que um único esferoide esteja contido no 30 μL.
11. Repita o passo 2.10 mais duas vezes para preencher todos os 3 orifícios de um SID.
12. Use uma ponta de pipeta de 10 μL para centralizar o esferoide se ele estiver localizado perto da fronteira PDMS. Se dois ou três esferoides acabarem dispensados em um dos orifícios, a mesma ponta de pipeta pode ser usada para separar os esferoides um do outro. Pare o temporizador.
    NOTA: Invertendo frequentemente o SID de cabeça para baixo e de cabeça para cima, durante todo o período da polimerização e solidificação do colágeno I, garante que o esferoide esteja posicionado no centro vertical da camada ECM, e previne a invasão de células em 2D. A frequência de inverter (inversão) deve ser maximizada. Como a frequência de inversão é controlada pelo "tempo de dispensação" esferoide medido em 2.10-2.12, o tempo de dispensação deve ser minimizado. Em nosso laboratório, o tempo de distribuição é de 2 minutos em média.
13. Para centralizar verticalmente o esferoide na camada de colágeno, vire o SID de cabeça para baixo e incubar a 37 °C para tempo de distribuição.
14. Vire o SID de cabeça para cima e incubar a 37 °C para o tempo de distribuição.
    NOTA: O tempo que os esferoides passam na orientação de cabeça para baixo deve ser igual ao tempo gasto na orientação de cabeça para cima.
15. Repita as etapas 2.13 e 2.14 por 30 minutos, até que o colágeno I polimerize.
16. Adicione 2,5 mL de meio/SID completo e, se necessário, adquira uma imagem dos esferoides para o ponto de tempo inicial.
17. Repetir as etapas 2.10-2.16 se vários SIDs forem usados.

3. Rotulagem de fluorescência de esferoides

1. Imagem ao vivo (Duração de 6-7 dias)
   NOTA: Se uma linha celular expressando uma proteína citoplasmática e/ou fluorescente nuclear estiver disponível, siga os passos descritos na seção 2. Alternativamente, para rotulagem citoplasmática, propõe-se o seguinte protocolo.
   1. Siga os passos 2.1-2.5 do protocolo descrito na seção 2.
   2. Diluir o corante citoplasmámico para 25 μM em 200 μL de meio livre de soro.
      NOTA: Enquanto um corante citoplasmônico vermelho é usado neste experimento, qualquer outra cor disponível deve ser adequada. As células cancerígenas foram rotuladas dentro de esferoides usando corantes nucleares diluídos a 20 μM em 200 μL de meio livre de soro (ver Tabela de Materiais).
   3. Após a lavagem final, resuspende esferoides na solução citoplasmática ou de corante nuclear e incubar à temperatura ambiente por 20 minutos, protegidos da luz.
      NOTA: Com esta abordagem, a rotulagem das células no centro esferoide não será eficiente. Para conseguir a rotulagem de todas as células, a incubação pode ser estendida durante a noite, colocando o prato em um roqueiro. Alternativas são descritas em Discussão.
   4. Lave esferoides 3 vezes em meio completo.
   5. Prossiga para as etapas 2.6-2.17 do protocolo descrito na seção 2.
   6. Imagens eferóides via imagem de lapso de tempo a cada 10 minutos por 24-72 h(Figura 2), ou via imagem longitudinal, diariamente, por até 7 dias(Figura 3). Use um microscópio confocal de varredura a laser, objetivo de ar 10x (0,4 abertura numérica e 3,1 mm de distância de trabalho), 1024 x 1024 pixels, tempo de exposição 8 μs/pixel, pinhole 90 μm, 6 x 15 μm z-steps e 3 campos de visualização cada contendo um spheroid.
      NOTA: Para imagens de lapso de tempo, use potência laser mínima e equipe o microscópio com uma câmara ambiental com temperatura, umidade e controle de gás. Cultue os esferoides incorporados a 37 °C para > 8 h ou durante a noite antes da imagem para minimizar o tempo no microscópio.
2. Coloração de imunofluorescência de esferoides (Duração 2 dias)
   NOTA: O procedimento descrito aqui é adaptado e otimizado a partir dos protocolos publicados anteriormente^8,9. Este método pode ser usado após o protocolo delineado nas seções 2 e 3.1.
   1. Prepare-se recentemente as seguintes soluções.
      1. Solução de fixação: 1x PBS contendo 4% PFA (vol/vol) [por exemplo, adicionar 5 mL de 16% (vol/vol) PFA a 15 mL de 1x PBS].
      2. Solução de fixação e permeabilização: 1x PBS contendo 4% PFA (vol/vol) e 0,5% Triton X-100 (vol/vol) [por exemplo, adicionar 50 μL de Triton X-100 a 10 mL de solução de fixação].
      3. Solução de bloqueio: 1x PBS contendo 1% de FBS (vol/vol) e 1% BSA (wt/vol) [por exemplo, dissolver 100 mg de BSA em 10 mL de 1x PBS, depois adicionar 100 μL de FBS].
      4. Solução de lavagem: 1x PBS contendo 0,05% Interpol 20 (vol/vol) [por exemplo, adicionar 25 μL de Tween 20 a 50 mL de 1x PBS].
   2. Remova o meio de cultura dos SID(s) e lave uma vez com 1x pbs quente.
   3. Adicione 2 mL de solução de fixação e permeabilização por SID e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos.
   4. Remova a solução de fixação e permeabilização e adicione 2 mL de solução por SID e incubar à temperatura ambiente por 20 minutos.
   5. Lave 3 vezes com a solução de lavagem.
   6. Adicione 2 mL de solução de bloqueio por SID e incubar a 4 °C por 24 h com leve agitação.
      NOTA: Nesta etapa, as amostras podem ser incubadas a 4 °C, durante o fim de semana. Observe que um tempo de bloqueio mais longo pode interferir no procedimento de rotulagem da imunofluorescência.
   7. Diluir anticorpos primários na solução de bloqueio.
   8. Adicione 150 μL de solução de bloqueio com anticorpos primários/bem em uma placa de 48 poços.
   9. Usando pinças finas, desprende cuidadosamente o plugue de colágeno I contendo um esferoide e transfira para um poço. Repita se vários esferoides forem rotulados. Limpe qualquer líquido que possa permanecer na pinça ao trabalhar com diferentes anticorpos, para evitar contaminação.
   10. Incubar durante a noite a 4 °C com leve agitação.
   11. Adicione 300 μL de solução de lavagem a poços vazios e cheios.
   12. Transfira cuidadosamente o plugue de colágeno que eu contenha um esferoide em um poço de "lavagem".
   13. Lave 3 vezes com solução de lavagem por 2h, em temperatura ambiente e com leve agitação.
       NOTA: Transferir os plugues de colágeno I contendo um esferoide, em vez de aspirar as soluções, pode ajudar a reduzir a perda de amostras e danos à amostra.
   14. Diluir anticorpos secundários, 4',6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI) e/ou falooidina na solução de bloqueio.
   15. Adicione 150 μL de solução de bloqueio com anticorpos secundários, DAPI e/ou faloideina por poço.
   16. Usando pinças, transfira cuidadosamente o plugue de colágeno contendo os esferoides para o poço. Repita se vários esferoides forem rotulados.
   17. Incubar em temperatura ambiente por 1h com leve agitação.
   18. Repetir as etapas 3.2.11 e 3.2.12.
   19. Lave 3 vezes com solução de lavagem por 30 minutos, em temperatura ambiente com leve agitação.
   20. Usando uma lâmina de barbear, corte uma inserção PDMS de 3 orifícios em três partes para que cada peça contenha um orifício.
   21. Coloque dois pedaços de PDMS em um slide de microscópio.
   22. Adicione uma gota de solução de montagem usando uma ponta P200 com a extremidade cortada. Evite a formação de bolhas.
   23. Transfira cuidadosamente um colágeno que eu conecto em cada orifício.
       NOTA: Se o esferoide estiver posicionado na parte superior do plugue de colágeno, inverta o plugue de colágeno para que o esferoide acabe mais perto da tampa de vidro.
   24. Coloque uma mancha de cobertura em cima e vedar usando fita adesiva.
   25. Deixe a amostra secar à temperatura ambiente por 10 minutos, protegida da luz.
   26. Armazene amostras a 4 °C, protegidas da luz até a imagem.

4. Processamento de imagem para analisar a invasão do câncer ao longo do tempo

NOTA: O formato necessário para esta macro é uma imagem de um único canal x,y,t salva como um arquivo .tiff.

1. Se várias fatias z forem adquiridas(ou seja, x,y,z,t imagem), abra a imagem em Fiji e selecione Imagem | Pilhas | Projeto Z. Recomenda-se usar a opção Intensidade Máxima. Alternativamente, uma única fatia z pode ser usada para executar a macro. Salve a imagem como um arquivo .tiff.
2. Crie uma pasta separada de "Processamento" na área de trabalho.
3. Selecione | de arquivos Salve como | Sequência de imagem. Use o formato TIFF, atualize o número de dígitos de acordo com o número de quadros, marque a caixa para usar a etiqueta da fatia como nome do arquivo e selecione Ok. Selecione a pasta "Processamento" criada na etapa 2.
4. Abra uma imagem da pasta "Processamento". Deve ser uma imagem x,y, correspondente a um único ponto de tempo.
5. Selecione | de imagem Ajuste | Limiar automático. No menu suspenso selecione o método Experimente tudo e verifique se há objetos brancos na caixa em fundo preto.
6. Uma imagem de montagem aparece mostrando o resultado de cada método de limiar automatizado.
7. Identifique o melhor método de limiar automatizado, por exemplo RenyIEntropy.
8. Para confirmar a escolha do método de limiar automatizado, abra qualquer outra imagem da pasta "Processamento" e teste o método de limiar escolhido usando o Image | Ajuste | Limiar automático.
9. Feche todas as imagens.
10. Baixe a macro SpheroidAreaTime (Arquivo Suplementar 2).
11. Abra a macro Fiji por arrastar e soltar.
12. Na linha 58, atualize o método de limiar automatizado conforme necessário.
13. Na linha 62, atualize a faixa de tamanho de acordo com as dimensões celulares.
14. Selecione Executar.
15. Selecione a pasta "Processamento" e digite "Processamento" como pasta Pai e selecione Ok.
16. Uma vez que a corrida acabou, salve a tabela "Resumo". A primeira coluna indica o nome da imagem; a terceira coluna indica a área esferoide; a sexta, sétima e oito colunas especificam os parâmetros para uma elipse instalada no esferoide.
17. A pasta "Processamento" agora contém uma imagem processada para cada ponto de tempo, com a extensão _SpheroidArea.
    NOTA: Se o centro esferoide estiver escuro, preencha-o com branco usando as ferramentas de seleção, para todos os pontos de tempo, e, em seguida, prossiga para o passo 3. Da mesma forma, o espaço ao redor do esferoide pode ser preenchido com preto para "limpar" a imagem. Se a imagem estiver limpa, comente a linha 61 para acelerar a corrida.

Resultados

Devido à sua biocompatibilidade, o PDMS é amplamente utilizado para microfabificação de poços, selos e moldes de confinamento, o que revolucionou os dispositivos micropatterning e microfluidos. No método descrito aqui, é usado para criar SIDs, poços personalizáveis que otimizam o procedimento de incorporação e imagem de spheroid. A Figura 1 ilustra os principais componentes utilizados na fabricação dos SIDs. Para lançar o molde PDMS, um espaçador de 1 mm de espessura é impres...

Discussão

O espaçador impresso 3D foi projetado para criar folhas de 1 mm de espessura de PDMS que podem então ser usadas para criar facilmente várias formas de PDMS, conforme exigido pelas aplicações experimentais. Devido à simplicidade de sua fabricação e à liberdade de alterar o design, este método de fundição PDMS foi escolhido para o design inicial do SID. Se for necessário um alto volume de SIDs, a produção pode ser mais eficiente criando um molde impresso em 3D, que já contém discos PDMS com três orifício...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 N NaOH	Honeywell Fluka	60-014-44
10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	SH30028.LS
16% paraformaldehyde (PFA)	Alfa Aesar	43368-9M
1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	20012027
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D1306
48-well plate	Falcon	T1048
Alexa Fluor 647 phalloidin	Life Technologies	A20006
Anti cortactin antibody	Abcam	ab33333	1 to 200 dilution
Anti E-cadherin antibody	Invitrogen	13-1900	1 to 100 dilution
Bovine atelocollagen I solution (Nutragen)	Advanced Biomatrix	501050ML
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A4503-50G
CellTracker Red CMTPX Dye	Invitrogen	C34552
Conical tubes	Falcon	352095
Coverslips	FisherBrand	12-548-5E
Disposable container	Staples		Plastic cups
Disposable transfer pipette	Thermo Scientific	202
DMEM	Fisher Scientific	11965118
Double-faced tape	Scotch
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
Fetal bovine serum (FBS)	Bio-Techne	S11550
Fluoromount-G	eBioscience	00-4958-02
Glutaraldehyde	Sigma Aldrich	G5882-100mL
Hoescht nuclear stain	Thermo Fischer	62249
Isopropanol	Thermo Fischer	S25371A
MatTek dish (glass bottom dish)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Methyl cellulose	Sigma Aldrich	M6385-100G
MilliQ water
Penicilin/streptomycin solution	Thermo Fischer	15140122
Petri dish	Corning	353003
Pipet tips	Fisherbrand	02-707
Pipets	Gilson	F167300
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920
Primary antibodies, user specific
Rat Tail Collagen I	Corning	47747-218
Razor Blade	Personna	74-0001
Secondary antibodies, user specific
Slides	Globe Scientific	1354W-72
Sylgard 184 Silicone	Dow Corning	4019862
Tape	Scotch
Triton X100	Sigma Aldrich	10789704001
Tween 20	Sigma Aldrich	655204-100ML