Resposta cardíaca à estimulação β-adrenérgica determinada pela análise do loop de pressão-volume

Resumo

Aqui descrevemos uma análise de loop de volume de pressão cardíaca sob doses crescentes de isoproterenol infundido por via intravenosa para determinar a função cardíaca intrínseca e a reserva β-adrenérgica em camundongos. Utilizamos uma abordagem de peito aberto modificada para as medições de loop de volume de pressão, nas quais incluímos ventilação com pressão final-expiratória positiva.

Resumo

A determinação da função cardíaca é uma análise robusta do ponto final em modelos animais de doenças cardiovasculares, a fim de caracterizar efeitos de tratamentos específicos no coração. Devido à viabilidade das manipulações genéticas, o camundongo tornou-se o modelo animal mamífero mais comum para estudar a função cardíaca e buscar novos potenciais alvos terapêuticos. Aqui descrevemos um protocolo para determinar a função cardíaca in vivo usando medidas e análises de loop de volume de pressão durante as condições basais e sob estimulação β-adrenérgica por infusão intravenosa de concentrações crescentes de isoproterenol. Fornecemos um protocolo refinado, incluindo suporte à ventilação levando em conta a pressão final positiva para amenizar efeitos negativos durante as medidas do peito aberto e a potente analgesia (Buprenorphine) para evitar o estresse miocárdio incontrolável evocado pela dor durante o procedimento. Todos juntos, a descrição detalhada do procedimento e a discussão sobre possíveis armadilhas permitem uma análise de loop de volume de pressão altamente padronizada e reprodutível, reduzindo a exclusão dos animais da coorte experimental, prevenindo possíveis viés metodológico.

Introdução

Doenças cardiovasculares normalmente afetam a função cardíaca. Esta questão aponta a importância na avaliação da função cardíaca in vivo detalhada em modelos de doenças animais. A experimentação animal é cercada por um quadro dos três princípios orientadores de Rs (3Rs) (Reduzir/Refinar/Substituir). No caso de compreender patologias complexas envolvendo respostas sistêmicas (ou seja, doenças cardiovasculares) no nível de desenvolvimento atual, a principal opção é refinar os métodos disponíveis. O refino também levará a uma redução do número de animais necessários devido à menor variabilidade, o que melhora o poder da análise e das conclusões. Além disso, a combinação de medidas de contratilidade cardíaca com modelos animais de doença cardíaca, incluindo aqueles induzidos por estimulação neurohumoral ou por sobrecarga de pressão como banda aórtica, que imita, por exemplo, os níveis alterados de catecolamina/β-adrenérgico^1,2,3,4, fornece um método poderoso para estudos pré-clínicos. Tendo em conta que o método baseado em cateter permanece a abordagem mais utilizada para uma avaliação aprofundada da contratilidade cardíaca^5,pretendemos apresentar aqui uma medição refinada da função cardíaca in vivo em camundongos por medições de loop de volume de pressão (PVL) durante β-adrenérgico com base na experiência anterior, incluindo a avaliação de parâmetros específicos desta abordagem^{6, 7}.

Para determinar parâmetros hemodinâmicos cardíacos, estão disponíveis abordagens que incluem imagens ou técnicas baseadas em cateter. Ambas as opções são acompanhadas de vantagens e desvantagens que precisam ser cuidadosamente consideradas para a respectiva questão científica. As abordagens de imagem incluem ecocardiografia e ressonância magnética (RM); ambos foram usados com sucesso em camundongos. As medições ecocardiográficas envolvem altos custos iniciais de uma sonda de alta velocidade necessária para a alta frequência cardíaca dos camundongos; é uma abordagem não invasiva relativamente simples, mas é variável entre os operadores que, idealmente, devem ser experimentados reconhecendo e visualizando estruturas cardíacas. Além disso, nenhuma medição de pressão pode ser realizada diretamente e os cálculos são obtidos a partir da combinação de magnitudes de tamanho e medições de fluxo. Por outro lado, tem a vantagem de que várias medidas podem ser realizadas na mesma função animal e cardíaca podem ser monitoradas, por exemplo, durante a progressão da doença. Quanto à medição do volume, a ressonância magnética é o procedimento padrão-ouro, mas semelhante à ecocardiografia, não são possíveis medidas diretas de pressão e apenas parâmetros dependentes de pré-carga podem ser obtidos⁸. Fatores limitantes também são a disponibilidade, o esforço de análise e os custos operacionais. Aqui, os métodos baseados em cateter para medir a função cardíaca são uma boa alternativa que, adicionalmente, permitem o monitoramento direto da pressão intracardica e a determinação de parâmetros de contratilidade independentes da carga, como o trabalho de acidente vascular cerebral pré-carga (PRSW)⁹. No entanto, os volumes ventriculares medidos por um cateter de condução de pressão (por determinação de condutividade) são menores do que os da ressonância magnética, mas as diferenças de grupo são mantidas na mesma faixa¹⁰. Para determinar valores de volume confiáveis é necessária a calibração correspondente, que é um passo crítico durante as medições pvl. Combina medições ex vivo de condutividade sanguínea em cuvetas calibradas em volume (conversão de condutância em volume) com a análise in vivo para a condutância paralela do miocárdio durante a injeção de bolus da solução salina hipertônica^11,12. Além disso, o posicionamento do cateter dentro do ventrículo e a orientação correta dos eletrodos ao longo do eixo longitudinal do ventrículo são fundamentais para a capacidade de detecção do campo elétrico circundante produzido por eles. Ainda com o tamanho reduzido do coração do rato é possível evitar artefatos produzidos por alterações na orientação intraventricular do cateter, mesmo em ventrículos dilatados^5,10, mas artefatos podem evoluir sob β-adrenergic stimulation^6,13. Além dos métodos de condutância, o desenvolvimento do método baseado em admissão apareceu para evitar as etapas de calibração, mas aqui os valores de volume são bastante superestimados^14,15.

Como o camundongo é um dos modelos pré-clínicos mais importantes em pesquisa cardiovascular e a reserva β-a reserva adrenérgica do coração é de interesse central em fisiologia cardíaca e patologia, apresentamos aqui um protocolo refinado para determinar a função cardíaca in vivo em camundongos por medições de PVL durante β-adrenergic estimulação.

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram aprovados e realizados de acordo com as normas do Conselho Regional de Karlsruhe e da Universidade de Heidelberg (AZ 35-9185.82/A-2/15, AZ 35-9185.82/A-18/15, AZ 35-9185.81/G131/15, AZ 35-9185.81/G121/17) de acordo com as diretrizes da Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu sobre a proteção dos animais utilizados para fins científicos. Os dados mostrados neste protocolo são derivados de camundongos machos do tipo selvagem C57Bl6/N (17 ± 1,4 semanas de idade). Os camundongos foram mantidos sob condições especificadas de livre de patógenos na instalação animal (IBF) da Faculdade de Medicina de Heidelberg. Os camundongos foram alojados em um ciclo claro-escuro de 12 horas, com umidade relativa entre 56-60%, uma mudança de ar 15 vezes por hora e temperatura ambiente de 22°C +/- 2°C. Foram mantidos em gaiolas convencionais tipo II ou tipo II há muito tempo fornecidos com cama animal e papéis de tecido como enriquecimento. Alimentos autoclavados padrão e água autoclavada estavam disponíveis para consumir ad libitum.

1. Elaboração de instrumentos e soluções de medicamentos

1. Cateter venoso central: Corte o micro tubo (diâmetro externo de 0,6 mm) em tubos de cateter de ~20 cm de comprimento. Use fórceps para puxar uma extremidade do tubo na ponta de uma cânula de calibre 23. Corte a outra extremidade do tubo na diagonal para criar uma ponta afiada que possa perfurar a veia femoral.
2. Tubo endotraqueal: Para um tubo de intubação corte uma ubula venipuncture de 20 mm de comprimento para remover o acessório da seringa.
   1. Se o tubo de intubação não se encaixar perfeitamente na conexão do ventilador, enrole o parafilme sobre a extremidade do tubo onde o dispositivo de ventilação está conectado. A conexão deve ser estável e selada pelo espessamento(Figura 1A). Encurte o pino guia metálico da cânula venipunctura de 20 bitolas para 2,7 cm e use-o como um auxílio de intubação. Abordagens refinadas para intubação, incluindo fibras leves para facilitar a visualização da traqueia também são bem descritas, por exemplo, por Das e colaboradores¹⁶.
3. Mistura anestésica utilizada para intubação: Misture 200 μL de heparina (1000 UI/mL) com 50 μL de 0,9% NaCl e 750 μL de 2 mg/mL etomidato de um produto à base de emulsão óleo-na-água. Use 7 μL/g de peso corporal (BW) para cada rato (0,1 mg/kg BW Buprenorphine 10 mg/kg BW etomidate).
4. Relaxante muscular: Dissolva 100 mg de brometo de pancurônio em 100 mL de 0,9% NaCl. Use 1,0 μL/g de peso corporal (1 mg/kg BW) para cada rato.
5. Soluções de isoproterenol: Dissolver 100 mg de isoproterenol em 100 mL de 0,9% NaCl (1 μg/μL). Prepare as seguintes diluições(Tabela 1) e transfira cada uma em uma seringa de 1 mL.
   1. Para obter diluição 1, diluir o estoque em 1:1.8. Para obter diluição 2, diluir o estoque em 1:6. Para obter diluição 3, diluir a diluição 1 em 1:10. Por fim, obtenha diluição 4 por uma diluição de 1:10 de diluição 2.
6. 15% Hypertnic NaCl (c/v): Dissolver 1,5 g de 0,9% NaCl em 10 mL de H₂O. Filtrar a solução com um filtro de seringa porosa de 0,45 μm.
7. Preparação de 12,5% de solução albumina (c/v): Dissolver 1,25 g de albumina de soro bovino em 10 mL de 0,9% NaCl. Incubar a solução a 37 °C por 30 min. Esfrie até a temperatura ambiente e filtre a solução com um filtro de seringa porosa de 0,45 μm.
8. Preparação da configuração: Ligue primeiro a placa de aquecimento e coloque-a em 39-40 °C. Coloque uma seringa cheia de soro fisiológico na almofada de aquecimento e transfira o cateter de loop de volume de pressão (PVL) para dentro da seringa. Pré-incubar o cateter por pelo menos 30 minutos antes de ser usado para estabilização. A configuração que usamos consiste em um cateter de condução de pressão 1.4 F, uma unidade de controle e o software correspondente, e é descrito graficamente na Figura 1B e as referências do provedor estão listadas na Tabela de Materiais.

2. Anestesia

1. Injete buprenorfina (0,1 mg/kg BW intraperitoneally) 30 min antes da intubação.
2. Coloque o mouse em uma câmara de vidro acrílico pré-saturada com isoflurane de 2,5% e pré-aquecida com uma almofada de aquecimento colocada na base da câmara.
3. Assim que o camundongo dormir (falta de reflexo), injete a mistura anestésica (7 mL/kg BW) contendo etomidato de 10 mg/kg etomidato e heparina (1.200 UI/kg BW) intraperitoneally.

3. Ventilação

1. Transfira o animal para a plataforma de intubação (Figura 1C) 3-4 minutos após a injeção anestésico. O rato fica pendurado nos dentes com a visão dorsal voltada para o operador.
2. Levante suavemente a língua com fórceps. Para identificar os glottis, levante ligeiramente a mandíbula inferior do rato com o segundo fórceps.
3. Insira cuidadosamente o tubo endotraqueal(Figura 1A) na traqueia e remova a haste guia.
4. Transfira o animal para a placa de aquecimento, coloque-o na parte de trás e conecte o tubo de intubação ao pequeno respirador animal.
5. Ajuste a taxa respiratória para 53,5 x (peso corporal em gramas)^-0,26 [min^-1],como descrito por outros¹², e volumes de maré para pico de pressões inspiratórias de 11 ± 1 cmH₂O. Estabeleça um PEEP de 2 cmH₂O.
6. Fixar cuidadosamente as extremidades do mouse na placa de aquecimento com tiras adesivas e aplique pomada nos dois olhos para evitar o ressecamento.
7. Insira uma sonda de temperatura reta e mantenha a temperatura do núcleo do núcleo a 37 ± 0,2 °C.
8. Instale um ECG de 1 chumbo e monitore a frequência cardíaca on-line como um indicador para profundidade e estabilidade da anestesia.
9. Após a ausência de reflexos interdigiais, injete 1 mg/kg BW do músculo relaxante pancurônio-brometo intraperitoneally. Isso previne artefatos respiratórios durante as medições de PVL.

4. Cirurgia

1. Recomendações gerais
   1. Durante a cirurgia, ventile com ~1,5-2% de isoflurane vaporizado com O₂. A concentração de isoflurane também pode depender de variáveis como cepa de camundongos, sexo, idade e peso dos animais, mas precisa ser individual e experimentalmente determinada e os valores aqui são referência para a cepa de camundongos C57BL6/N. É importante ressaltar que o ventilador está conectado a um sistema de extração para evitar que o operador inale isoflurane.
   2. Use uma ampliação entre 1,5-4x do microscópio estéreo para procedimentos cirúrgicos.
      NOTA: Consulte orientações institucionais/locais sobre a preparação do animal para cirurgias de não sobrevivência.
2. Cannulação femoral
   1. Enxágüe a linha traseira com 70% de etanol, incisee a região inguinal esquerda e exponha a veia femoral esquerda.
   2. Exploda a artéria epigástrica e a veia com um cautery.
   3. Ligate a veia femoral com uma sutura colocada distal ao acesso ao cateter.
   4. Passe uma sutura sob a veia femoral e prepare um nó craniano de perfuração. Puna a veia femoral com o micro tubo preparado (ver passo 1.1) preso a uma seringa de 1 mL.
   5. Amarre o nó para consertar o tubo dentro do vaso.
   6. Contra-ação perda de fluido pela infusão de 0,9% NaCl complementada com 12,5% de albumina a uma taxa de infusão de 15 μL/min com uma bomba de seringa automática. Além disso, mantenha o tecido exposto úmido usando 0,9% de NaCl pré-aquecido.
3. Toracotomia
   1. Enxágüe o tórax com 70% de etanol.
   2. Incisar a pele logo abaixo do processo xifoide e separar sem rodeios os músculos peitorais da parede do peito com fórceps ou um cautery.
   3. Levante o processo xifoide com fórceps e, em seguida, corte através da parede do peito movendo-se lateralmente em ambos os lados com um cauterismo até que o diafragma seja totalmente visível por baixo.
   4. Incisar o diafragma por baixo e expor o ápice cardíaco. Em seguida, remova cuidadosamente o pericárdio com fórceps.
   5. Realize uma costotomia limitada no lado esquerdo como descrito anteriormente⁶.
   6. Passe uma sutura sob a veia caval inferior para realizar a redução da pré-carga durante os estágios posteriores.
   7. Puna suavemente o ápice cardíaco com uma cânula de 25 mm (máximo de 4 mm). Remova a cânula e insira o cateter FOTOVOLTAICO até que todos os eletrodos estejam dentro do ventrículo.
   8. Ajuste a posição do cateter por movimentos suaves e giros até que sejam obtidas alças em forma retangular(Figura 2A).
   9. Mantenha sempre todos os tecidos expostos úmidos usando 0,9% de NaCl pré-aquecido.

5. Medições

1. Recomendações gerais
   1. Durante as medições, ventile com ~1,5-2% de isoflurane vaporizado com 100% O_2.
   2. Realize 2 medidas de linha de base, bem como 2 oclusãos de vena cava em cada etapa do protocolo de resposta à dose.
      NOTA: É importante que após a primeira e segunda oclusão vena cava, tanto os valores de pressão quanto de volume retornem aos valores de estado estável como antes da primeira oclusão. Esta observação é necessária para reconhecer uma mudança na posição do cateter devido a reduções seriais no volume intraventricular. Se uma mudança na posição do cateter fosse o caso, especialmente os valores de volume seriam deslocados.
2. Realize uma análise on-line dos parâmetros (frequência cardíaca, volume de derrame, dP/dt_max) e espere até obter a função cardíaca de estado estável. Para a faixa de parâmetros esperada com a configuração aqui utilizada em camundongos C57Bl6/N, consulte os resultados publicados⁶.
3. Pare o respirador na posição expiratória final e regise parâmetros de linha de base. Após 3 a 5 segundos reduza a carga cardíaca levantando a sutura abaixo da veia caval inferior com fórceps, a fim de obter parâmetros independentes de pré-carga(Figura 2B). Ligue o ventilador. Espere pelo menos 30 segundos para a segunda oclusão até que os parâmetros hemodinâmicos sejam estabilizados.
4. Após a obtenção das medidas em condições basais proceder à dose-resposta de isoproterenol, mudando para as seringas preparadas. Aqui a taxa de infusão permanece inalterada para evitar modificações da pré-carga cardíaca. Tome cuidado para não infundir bolhas de ar ao trocar a seringa.
   1. Espere pelo menos 2 minutos até que uma nova função cardíaca de estado estável seja obtida do que parar novamente o respirador na posição expiratória final e registrar parâmetros de linha de base. Após 3 a 5 segundos reduza a carga cardíaca levantando a sutura abaixo da veia caval inferior, a fim de obter parâmetros independentes de pré-carga.
   2. Espere pelo menos 30 segundos pela segunda oclusão. Depois mudando para a seringa preparada com a próxima concentração isoproterenol e repetir as gravações dos parâmetros independentes de linha de base e pré-carga.
      NOTA: Artefatos como o pico de pressão sistólica final (ESPS, Figura 2C) podem ocorrer durante o aumento da dosagem de isoproterenol, que resulta da armadilha do cateter. Artefatos que ocorrem antes do início dos parâmetros basais podem ser facilmente corrigidos através do ree posicionado do cateter.

6. Calibração

NOTA: Os procedimentos de calibração podem variar dependendo do sistema PVL utilizado.

1. Calibração de condução paralela
   1. Conecte uma seringa contendo uma solução naCl de 15% à cânula femoral após a última medição da dose-resposta isoproterenol. Infundir cuidadosamente 5 μL da solução hipertônica restante no tubo até que pvl mude ligeiramente para a direita durante a visualização on-line. Então espere até que os laços voltem ao estado estável.
   2. Pare o respirador no final da expiração e injete um bolus de 10 μL de 15% de NaCl dentro de 2 a 3 segundos. Verifique se o PVL se expande em grande parte e será deslocado para a direita durante a visualização on-line.
2. Calibração conduance-volume
   1. Espere 5 min, nada menos, para que o bolus salino hipertônico seja completamente diluído. Depois remova o cateter e retire pelo menos 600 μL de sangue do ventrículo esquerdo do coração pulsante usando uma seringa de 1 mL e uma cânula de 21 calibres. Neste momento, o animal é eutanizado sob anestesia profunda e analgesia por hemorragia maciça, parando a ventilação e remoção do coração.
   2. Transfira o sangue para o cuvette de calibração pré-aquecido (em banho-maria a 37 °C) com cilindros de volume conhecido. Coloque o cateter PV centralizado em cada cilindro e regisse a condução. Ao calcular uma curva padrão para cada animal, as unidades de condução podem ser convertidas em valores absolutos de volume.

7. Análise

1. Após medições bem sucedidas de PVL em condições basais e estimulação isoproterenol, visualize, digitalize, calcule e extraia parâmetros caracterizando função cardíaca (como PRSW, dP/dt, pressão e volume diastólico final, pressão e volume sistólica final, tensão e volume de relaxamento constantes, entre outros) utilizando um software de análise PVL apropriado. Análises estatísticas adicionais e representações gráficas podem ser realizadas com software de análise padrão.
2. Análise de parâmetros independentes de pré-carga
   NOTA: Para esta etapa é crucial padronizar o procedimento.
   1. Selecione os primeiros 5-6 PVLs mostrando a diminuição da pré-carga em todas as medições para a análise de parâmetros independentes de pré-carga(Figura 2D). Um número constante de PVLs selecionados para análise durante a redução da pré-carga diminuirá a variabilidade entre as medições dos parâmetros obtidos.
   2. Calcule o valor médio das duas medidas em cada etapa do protocolo.

Resultados

A medição do ciclo de volume de pressão (PVL) é uma ferramenta poderosa para analisar a farmacodinâmica cardíaca de drogas e investigar o fenótipo cardíaco de modelos de camundongos geneticamente modificados em condições normais e patológicas. O protocolo permite a avaliação da reserva cardíaca β-adrenérgica no modelo de camundongo adulto. Aqui descrevemos um método de peito aberto sob anestesia isoflurano combinada com buprenorfina (analgésico) e pancurônio (relaxante muscular), que se concentra na re...

Discussão

Aqui, fornecemos um protocolo para analisar a função cardíaca in vivo em camundongos sob crescente estimulação β-adrenérgica. O procedimento pode ser usado para abordar ambos os parâmetros de linha de base da função cardíaca e a reserva adrenérgica (por exemplo, inotropia e cronotropia) em camundongos geneticamente modificados ou após intervenções. A vantagem mais proeminente das medidas de ciclo de volume de pressão (PVL) em comparação com outros meios de determinação da função cardíaca é a anál...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.4F SPR-839 catheter	Millar Instruments, USA	840-8111
1 ml syringes	Beckton Dickinson, USA	REF303172
Bio Amplifier	ADInstruments, USA	FE231
Bridge-Amplifier	ADInstruments, USA	FE221
Bovine Serum Albumin	Roth, Germany	8076.2
Buprenorphine hydrochloride	Bayer, Germany	4007221026402
Calibration cuvette	Millar, USA	910-1049
Differential pressure transducer MPX	Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany	Type 39912
Dumont Forceps #5/45	Fine Science tools Inc.	11251-35
Dumont Forceps #7B	Fine Science tools Inc.	11270-20
Graefe Forceps	Fine Science tools Inc.	11051-10
GraphPad Prism	GraphPad Software	Ver. 8.3.0
EcoLab-PE-Micotube	Smiths, USA	004/310/168-1
Etomidate Lipuro	Braun, Germany	2064006
Excel	Microsoft
Heparin	Ratiopharm, Germany	R26881
Hot plate and control unit	Labotec, Germany	Hot Plate 062
Isofluran	Baxter, Germany	HDG9623
Isofluran Vaporizer	Abbot	Vapor 19.3
Isoprenalinhydrochloride	Sigma-Aldrich, USA	I5627
Fine Bore Polythene tubing 0.61 mm OD, 0.28 mm ID	Smiths Medical International Ltd, UK	Ref. 800/100/100
MiniVent ventilator for mice	Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany	Type 845
MPVS Ultra PVL System	Millar Instruments, USA
NaCl	AppliChem, Germany	A3597
NaCl 0.9% isotonic	Braun, Germany	2350748
Pancuronium-bromide	Sigma-Aldrich, USA	BCBQ8230V
Perfusor 11 Plus	Harvard Apparatus	Nr. 70-2209
Powerlab 4/35 control unit	ADInstruments, USA	PL3504
Rechargeable cautery-Set	Faromed, Germany	09-605
Scissors	Fine Science tools Inc.	140094-11
Software LabChart 7 Pro	ADInstruments, USA	LabChart 7.3 Pro
Standard mouse food	LASvendi GmbH, Germany	Rod18
Stereo microscope	Zeiss, Germany	Stemi 508
Surgical suture 8/0	Suprama, Germany	Ch.B.03120X
Venipuncture-cannula Venflon Pro Safty 20-gauge	Beckton Dickinson, USA	393224
Vessel Cannulation Forceps	Fine Science tools Inc.	00574-11
Water bath	Thermo Fisher Scientific, USA
Syringe filter (Filtropur S 0.45)	Sarstedt, Germany	Ref. 83.1826