Coloração de Imunofluorescência de Montagem Inteira, Imagem Confocal e Reconstrução 3D do Nó Sinoatrial e Atrioventricular em Camundongo

Resumo

Fornecemos um protocolo passo-a-passo para a coloração por imunofluorescência de montagem completa do nó sinoatrial (SAN) e do nó atrioventricular (AVN) em corações murinos.

Resumo

O sinal elétrico fisiologicamente gerado pelas células do marcapasso no nó sinoatrial (SAN) é conduzido através do sistema de condução, que inclui o nó atrioventricular (AVN), para permitir a excitação e contração de todo o coração. Qualquer disfunção de SAN ou AVN resulta em arritmias, indicando seu papel fundamental na eletrofisiologia e arritmogênese. Modelos de camundongos são amplamente utilizados na pesquisa de arritmia, mas a investigação específica de SAN e AVN permanece desafiadora.

A SAN está localizada na junção da crista terminal com a veia cava superior e a AVN está localizada no ápice do triângulo de Koch, formado pelo orifício do seio coronariano, do anel tricúspide e do tendão de Todaro. No entanto, devido ao pequeno tamanho, a visualização pela histologia convencional continua sendo desafiadora e não permite o estudo de SAN e AVN dentro de seu ambiente 3D.

Aqui descrevemos uma abordagem de imunofluorescência de montagem inteira que permite a visualização local de SAN e AVN de camundongos marcados. A coloração de imunofluorescência de montagem inteira destina-se a seções menores de tecido sem a necessidade de seccionamento manual. Para este fim, o coração do rato é dissecado, com tecido indesejado removido, seguido de fixação, permeabilização e bloqueio. As células do sistema de condução dentro da SAN e da AVN são então coradas com um anticorpo anti-HCN4. A microscopia confocal de varredura a laser e o processamento de imagem permitem a diferenciação entre células nodais e cardiomiócitos em funcionamento e localizam claramente a SAN e a AVN. Além disso, anticorpos adicionais podem ser combinados para rotular outros tipos de células também, como fibras nervosas.

Em comparação com a imuno-histologia convencional, a coloração por imunofluorescência de montagem completa preserva a integridade anatômica do sistema de condução cardíaca, permitindo assim a investigação da AVN; especialmente em sua anatomia e interações com o miocárdio de trabalho circundante e células não-miócitos.

Introdução

As arritmias são doenças comuns que afetam milhões de pessoas e são a causa de morbidade e mortalidade significativas em todo o mundo. Apesar dos enormes avanços no tratamento e na prevenção, como o desenvolvimento de marcapassos cardíacos, o tratamento das arritmias permanece desafiador, principalmente devido ao conhecimento muito limitado sobre os mecanismos da doença de base ^1,2,3. Uma melhor compreensão da eletrofisiologia normal e da fisiopatologia das arritmias pode ajudar a desenvolver estratégias de tratamento novas, inovadoras e causais no futuro. Além disso, para estudar de forma abrangente a arritmogênese, é importante localizar e visualizar o sistema de condução cardíaca específico em modelos animais, como o camundongo, pois os camundongos são amplamente utilizados em pesquisas de eletrofisiologia.

As principais partes do sistema de condução cardíaca são o nó sinoatrial (SAN), onde o impulso elétrico é gerado em células de marcapasso especializadas, e o nó atrioventricular (AVN), que é a única conexão elétrica entre os átrios e os ventrículos⁴. Sempre que as propriedades eletrofisiológicas da SAN e da AVN são alteradas, podem ocorrer arritmias como síndrome do seio doente ou bloqueio atrioventricular, o que pode levar à deterioração hemodinâmica, síncope e até mesmo à morte, ressaltando assim o papel essencial da SAN e da AVN na eletrofisiologia e arritmogênese⁵.

Estudos abrangentes sobre SAN ou AVN exigem uma localização e visualização precisas de ambas as estruturas, idealmente dentro de seu ambiente fisiológico. No entanto, devido ao seu pequeno tamanho e localização dentro do miocárdio de trabalho, sem estabelecer uma estrutura macroscopicamente visível clara, estudar a anatomia e a eletrofisiologia da SAN e da AVN é um desafio. Pontos de referência anatômicos podem ser usados para identificar aproximadamente a região que contém SAN e AVN ^6,7,8. Em resumo, a SAN está localizada na região inter-caval do átrio direito adjacente à crista terminal muscular (TC), a AVN está localizada dentro do triângulo de Koch estabelecido pela valva tricúspide, o óstio do seio coronariano e o tendão de Todaro. Até agora, esses marcos anatômicos foram usados principalmente para localizar, remover e, em seguida, estudar SAN e AVN como estruturas individuais (por exemplo, pela histologia convencional). Para entender melhor a complexa eletrofisiologia da SAN e da AVN (por exemplo, efeitos regulatórios de células adjacentes do miocárdio em funcionamento), no entanto, é necessário estudar os sistemas de condução dentro do ambiente fisiológico 3D.

A coloração por imunofluorescência de montagem completa é um método utilizado para estudar estruturas anatômicas in situ , preservando a integridade do tecido circundante⁹. Aproveitando o software de microscopia confocal e análise de imagens, o SAN e o AVN podem ser visualizados com anticorpos marcados fluorescentemente visando canais iônicos especificamente expressos nessas regiões.

Este protocolo a seguir explica as etapas necessárias para executar um método de coloração de montagem completa bem estabelecido para localização e visualização de microscópio SAN e AVN. Especificamente, este protocolo descreve como (1) localizar SAN e AVN por marcos anatômicos para preparar essas amostras para coloração e análise microscópica (2) para realizar coloração de imunofluorescência de montagem completa dos marcadores de referência HCN4 e Cx43 (3) para preparar amostras de SAN e AVN para microscopia confocal (4) para realizar imagens confocais de SAN e AVN. Também descrevemos como este protocolo pode ser modificado para incluir coloração adicional do miocárdio circundante ou células não-miócitos, como fibras nervosas autônomas, o que permite uma investigação completa do sistema de condução cardíaca dentro do coração.

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Protocolo

O cuidado com os animais e todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética e Cuidados com os Animais da Universidade de Munique, e todos os procedimentos realizados em camundongos foram aprovados pelo Governo da Baviera, Munique, Alemanha (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). Camundongos C57BL6/J foram comprados do Jackson Laboratory.

NOTA: A Figura 1 mostra os instrumentos necessários para o experimento. A Figura 2 mostra uma ilustração da anatomia cardíaca macroscópica. A Figura 3 mostra a localização da SAN e da AVN em um coração de rato adulto. A Figura 4 mostra a amostra preparada carregada na microscopia confocal.

1. Preparações

1. Preparar uma solução de formaldeído a 4% (PFA a 4%) diluindo 10 mL de solução de formaldeído a 16% em 30 mL de PBS.
2. Preparar uma solução de sacarose a 15% e uma solução de sacarose a 30%, dissolvendo 15 g e 30 g de sacarose em pó em 100 mL de PBS, respectivamente. Após a dissolução completa do pó de sacarose, filtrar a solução utilizando um filtro de seringa de 0,2 μm antes de armazenar a 4 °C.
3. Prepare um gel de agarose a 3% a 4%, adicione 3 g ou 4 g de pó de agarose e 100 mL de 1x TAE (diluído a partir de 50x solução de estoque de TAE) em um béquer. Coloque o copo sobre um agitador magnético e ferva-o até que a agarose esteja completamente dissolvida.
4. Prepare a placa de dissecação derramando suavemente 30 mL de gel de agarose (3%-4%) em uma placa de Petri de 100 mm de diâmetro. Deixe a placa de Petri no banco à temperatura ambiente para arrefecer e endurecer.
5. Preparar a solução de bloqueio e a solução de lavagem de acordo com as receitas fornecidas na Tabela 1. Prepare todas as soluções preparadas no dia de uso. O armazenamento a longo prazo não é recomendado.
6. Prepare as soluções de anticorpos diluindo-as em PBS frio (4 °C) 1x, proteja a diluição da luz (por exemplo, envolvendo papel alumínio) e mantenha as diluições no gelo até que sejam usadas. Diluir os anticorpos pouco antes da incubação. Evite deixar os anticorpos diluídos à temperatura ambiente.
   NOTA: A diluição apropriada de anticorpos deve ser testada com amostras de tecido comparáveis, realizando uma coloração imunofluorescente convencional. Aqui, testamos os anticorpos por coloração de cortes congelados cortados a uma espessura de 10 μm.

2. Colheita de órgãos e preparação de tecidos

1. Anestesiar o rato, colocando-o numa câmara de incubação ligada a um vaporizador de isoflurano. Ajuste o vaporizador para fornecer 4-5% de isoflurano (96-95% de oxigênio, respectivamente).
   NOTA: A anestesia completa é confirmada pela perda da reação postural e do reflexo de endireitamento rolando suavemente a câmara até que o rato seja colocado de costas.
2. Coloque o rato em decúbito dorsal sobre a mesa cirúrgica. Coloque o nariz do rato em uma máscara de anestesia conectada a um circuito Bain modificado com seu tubo interno conectado ao vaporizador de isoflurano. Para manter a anestesia, use isoflurano a 1-2% em oxigênio a uma taxa de fluxo de 1 L / min. Elimine o excesso de vapor anestésico do rato através do tubo exterior da máscara e retire através de um recipiente de carvão ativado, que absorve o excesso de gás anestésico.
3. Quando a anestesia completa for alcançada, injete fentanil para analgesia (0,1 μg/25 g de peso corporal, i.p.).
4. Quando o reflexo da pinça do dedo do pé for indetectável, faça um corte claro do jugúnculo para a sínfise usando uma tesoura da íris para remover a pele e a pele. Faça outro corte da esquerda para a direita sob as costelas usando uma tesoura de íris para abrir cuidadosamente o abdômen.
5. Vida o xifoide um pouco usando pinça curva para permitir cortar o diafragma da esquerda para a direita sem ferir nenhum órgão. Corte a caixa torácica em uma linha axilar medial em ambos os lados usando uma tesoura de íris para virá-la cranialmente e permitir o acesso ao coração.
6. Corte a veia cava inferior e a aorta torácica descendente ao nível do diafragma usando uma tesoura de íris. Puncione o coração com uma agulha de 27 G na área do ápice e, em seguida, empurre cuidadosamente a agulha para o ventrículo esquerdo (VE). Injete suavemente 5-10 mL de PBS gelado no VE para perfundir o coração.
   NOTA: A cor do coração deve passar de vermelho para cinza, indicando perfusão bem-sucedida com PBS.
7. Levante cuidadosamente o ápice do coração usando uma pinça que permite cortar os grandes vasos e remover o coração.
8. Excise o coração, cortando as grandes artérias e veias o mais longe possível do coração para evitar qualquer dano à veia cava superior (SVC). Conserve o SVC, pois ele servirá como um marco importante durante o processamento posterior.
9. Após a remoção do coração, desligue o vaporizador de isoflurano.
10. Coloque o coração em um prato de dissecação cheio de PBS gelado sob o microscópio de dissecação. Após a determinação da esquerda / direita e frente / trás do coração, gire o coração com a frente do coração na parte inferior do prato (para expor os grandes vasos que estão localizados posteriormente).
11. Imobilizar o coração colocando pequenos pinos através do ápice e do apêndice atrial esquerdo (AAE) na agarose na parte inferior do prato de dissecção (Figura 2A). Usando pinças finas e tesouras, remova cuidadosamente o tecido não cardíaco ao redor da VCS e da veia cava inferior (VCI) (por exemplo, pulmões, gordura, pericárdio) para expor a região intercaval (Figura 3A).
12. Remova a maioria dos ventrículos cortando paralelamente o sulco entre os ventrículos e os átrios com a microtesoura. Preserve uma pequena parte do tecido ventricular para a carga posterior no anel de plexiglas.
13. Para fixação e desidratação, colocar a amostra (contendo os átrios, VCS e IVC) em PFA a 4% durante a noite a 4 °C.
14. No dia seguinte, transfira o coração para a solução de sacarose a 15% durante 24 horas a 4 °C.
15. No dia seguinte, transfira o coração para a solução de sacarose a 30% durante 24 horas a 4 °C.
    NOTA: Para a fixação e desidratação nas etapas 2.13, 2.14 e 2.15, as amostras são deixadas a 4°C sem agitação ou balanço.

3. Coloração por imunofluorescência de montagem inteira

1. Lavar o coração em Triton X-100 a 1% diluído em PBS e bloquear e permeabilizar em solução bloqueadora (Tabela 1) durante a noite a 4 °C.
2. Colocar o coração num tubo de 1,5 ml e incubar com anticorpos anti-rato conexina-43 de coelho (diluição de 1:200) e HCN4 anti-rato de rato (diluição de 1:200) diluídos com solução bloqueadora durante 7 dias a 4 °C.
   NOTA: A concentração ideal de anticorpos primários deve ser testada antes de utilizar as fichas técnicas como orientação. Outros antígenos de interesse também poderiam ser corados nesta etapa, desde que a espécie hospedeira do antígeno primário seja diferente das demais. Uma concentração mais alta de Triton X-100 pode ajudar a obter uma coloração de anticorpos mais eficiente, conforme demonstrado antes de¹⁰, mas a concentração pode ser determinada individualmente.
3. Após 7 dias, remover a solução que contém anticorpos primários utilizando uma pipeta e lavar o coração com 1% de solução de Triton X-100 3 vezes (cada vez durante 1 h à temperatura ambiente no agitador orbital).
4. Após a lavagem, incubar o coração = com Alexa Fluor 488 cabra anti-rato IgG (diluição de 1:200) e Alexa Fluor 647 cabra anti-coelho IgG (diluição de 1:200) por 7 dias a 4 °C.
5. Após 7 dias, retire toda a solução que contém os anticorpos secundários utilizando uma pipeta. Em seguida, lave o coração com solução de lavagem (Tabela 1) 3 vezes (cada vez por 1 h à temperatura ambiente no agitador orbital).
6. Para corar os núcleos, incubar o coração em solução de DAPI (10 μg/mL) durante a noite a 4 °C.
7. No dia seguinte, lave o coração com solução de lavagem 3 vezes (cada vez por 1 h à temperatura ambiente no agitador orbital).
   NOTA: Para o bloqueio, permeabilização, incubação de anticorpos e coloração DAPI nas etapas 3.1, 3.2, 3.4 e 3.6, deixar as amostras no estado estacionário a 4 °C, sem necessidade de agitação. O tecido corado pôde ser preservado totalmente coberto com solução de lavagem a 4 °C e protegido da luz por alguns dias até a obtenção de imagens ao microscópio confocal.

4. Microscopia confocal

1. Preparar anéis de plexiglas e encher com plasticina (Figura 1). No centro da plasticina, um pequeno sulco é formado no centro para carregar o coração. Faça um sulco raso, pois seria mais fácil adquirir um plano de imagem plano, ajustar o espaço e evitar bolhas de ar entre a amostra e as tampas na etapa 4.4.
2. Use a mesma amostra de coração para a geração de imagens de SAN e AVN sequencialmente. Para imagens SAN, carregue diretamente o coração, enquanto para imagens AVN, execute a microdissecção antes.
   1. Geração de imagens de SAN
      1. Identificar a SAN por marcos anatômicos: ela está localizada no lado dorsal do coração dentro da região inter-caval (a região entre a veia cava superior e inferior). A crista terminal (TC) é a faixa muscular entre a SAN e a ARA.
      2. Coloque o coração no sulco de plasticina com a parte de trás do coração voltada para cima. Adicione PBS no coração para deslocar todo o ar dentro da cavidade até que o coração esteja totalmente coberto com PBS (geralmente algumas gotas de PBS são suficientes).
      3. Sob o microscópio de dissecção, pressione suavemente o RAA, o LAA e as partes restantes do ventrículo esquerdo na plasticina para fixar o coração. Certifique-se de que toda a região inter-caval e a crista terminalis possam ser claramente vistas (não cobertas por plasticina). A área que será visualizada é mostrada na Figura 3A.
   2. Imagem AVN
      1. Depois de concluir a imagem da SAN, recolete a mesma amostra e, posteriormente, use para a imagem AVN. Para microdissecção AVN, coloque o coração = em uma placa de dissecção sob o microscópio de dissecção.
      2. Oriente o coração com o lado direito voltado para cima (incluindo as partes restantes do ventrículo direito). Coloque pinos através da parte restante da parede livre do VE (que agora está na parte inferior) para imobilizar o tecido (Figura 2B).
      3. Corte a parede livre do VD restante para cima através da valva tricúspide e da veia cava superior. Em seguida, vire o VD e a AR para expor o septo interventricular e interatrial. (Figura 3B)
         NOTA: Preste atenção para não danificar o seio coronário (CS), pois é um marco anatômico importante encontrar o triângulo de Koch que permite localizar a AVN. O CS corre transversalmente no sulco atrioventricular esquerdo no lado posterior do coração, e a abertura do orifício CS está localizada entre a VCI e a valva tricúspide na parte inferior do septo interatrial (Figura 3A e B).
      4. Identificar o triângulo de Koch que pode ser encontrado na superfície endocárdica do átrio direito, delimitado anteriormente pela linha articular do folheto septal da valva tricúspide (VC) e posteriormente pelo tendão de Todaro. A base é formada pelo orifício do seio coronariano (Figura 3B). Como essa é a região alvo para imagens AVN, ela precisa ser claramente visível.
      5. Transfira o coração para o sulco de plasticina dentro do anel de Plexiglas com o triângulo de Koch claramente exposto (ou seja, não coberto por plasticina). Pressione suavemente o tecido ao redor do triângulo de Koch na plasticina para fixar a amostra. Adicione PBS no coração para deslocar todo o ar dentro da cavidade até que o coração esteja totalmente coberto com PBS (geralmente algumas gotas de PBS são suficientes).
3. Aplique silicone nas bordas dos anéis de plexiglas para permitir cobrir os corações carregados dentro dos anéis de plexiglas cheios de plasticina com deslizamentos de cobertura.
4. Pressione suavemente a parte de trás da plasticina para espremer partes do PBS e para anexar o coração à tampa, evitando bolhas de ar dentro da área de imagem.
   NOTA: Certifique-se de que as regiões de interesse não estão dobradas e cobertas durante a pressão na parte de trás da plasticina. Um plano de imagem plano sem supercompressão da amostra é necessário para conservar a anatomia e para a imagem confocal adequada das amostras. Para SAN, é importante certificar-se de que a região entre cavalas esteja claramente exposta. Para AVN, o triângulo de Koch deve ser totalmente exposto.
5. Coloque as amostras de coloração de montagem inteira de cabeça para baixo na plataforma do microscópio confocal. O SAN/AVN exposto anexado à folha da tampa está agora na parte inferior da plataforma do microscópio (Figura 4).
   NOTA: Para tirar imagens, usamos o Carl Zeiss LSM800 com Airyscan Unit e o software ZEN 2.3 SP1 preto.
6. Escolha a placa "BP420-480 + LP605" para a excitação do anti-HCN4 conjugado Alexa Fluor 647. Varie o ganho mestre de 650-750.
7. Obtenha uma imagem geral de toda a região SAN e AVN usando a função Verificação de blocos . Em seguida, selecione a região positiva para HCN4 clicando e adicionando um quadrado na imagem de visão geral em torno da área de interesse que será digitalizada.
8. Verifique os parâmetros, incluindo placas e ganho mestre para os canais restantes (Alexa Fluor 488 e DAPI) do microscópio confocal e do conjunto, conforme descrito na etapa 4.6.
9. Ajuste lentamente o foco de cima para baixo da amostra para visualizar toda a amostra e definir o Primeiro e o Último para o intervalo de pilha Z. Defina um intervalo ideal para a pilha Z com base na espessura da amostra óptica. Usamos um objetivo de 20x e 0,8-1 μm como intervalo para Z-stack.
10. Depois que todos os parâmetros estiverem definidos corretamente, verifique toda a área da SAN e do AVN.
11. Realizar a reconstrução 3D das imagens usando software (por exemplo, Imaris versão 8.4.2).
    1. Selecione Processamento de Imagens | Subtração da linha de base para remover a coloração de fundo.
    2. Selecione a criação de superfície na configuração do canal e da região de interesse selecionados para processamento.

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Resultados

Usando o protocolo descrito acima, a imagem de microscopia confocal de SAN e AVN pode ser realizada de forma confiável. A coloração específica do sistema de condução usando anticorpos fluorescentes direcionados à HCN4 e a coloração do miocárdio de trabalho usando anticorpos fluorescentes direcionados à Cx43 permitem a identificação clara de SAN (Figura 5, Vídeo 1) e AVN (Figura 6, Vídeo 2) dentro d...

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Discussão

A anatomia cardíaca tem sido tradicionalmente estudada por meio de cortes histológicos finos¹¹. No entanto, esses métodos não preservam a estrutura tridimensional do sistema de condução e, portanto, fornecem apenas informações 2D. O protocolo de coloração por imunofluorescência de montagem completa descrito aqui permite superar essas limitações e pode ser usado rotineiramente para imagens SAN e AVN.

Em comparação com métodos padrão, como a imuno-histoqu...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia
Isoflurane vaporizer system	Hugo Sachs Elektronik	34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910	Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters
Modified Bain circuit	Hugo Sachs Elektronik	73-4860	Includes an anesthesia mask for mice
Surgical Platform	Kent Scientific	SURGI-M
In vivo instrumentation
Fine forceps	Fine Science Tools	11295-51
Iris scissors	Fine Science Tools	14084-08
Spring scissors	Fine Science Tools	91500-09
Tissue forceps	Fine Science Tools	11051-10
Tissue pins	Fine Science Tools	26007-01	Could use 27G needles as a substitute
General lab instruments
Orbital shaker	Sunlab	D-8040
Magnetic stirrer	IKA	RH basic
Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL	Eppendorf	Z683884-1EA
Microscopes
Dissection stereo- zoom microscope	VWR	10836-004
Laser Scanning Confocal microscope	Zeiss	LSM 800
Software
Imaris 8.4.2	Oxford instruments
ZEN 2.3 SP1 black	Zeiss
General Lab Material
0.2 µm syringe filter	Sartorius	17597
100 mm petri dish	Falcon	351029
27G needle	BD Microlance 3	300635
50 ml Polypropylene conical Tube	Falcon	352070
5ml Syringe	Braun	4606108V
Cover slips	Thermo Scientific	7632160
Eppendorf Tubes	Eppendorf	30121872
Chemicals
0.5 M EDTA	Sigma	20-158	Components of TEA
16% Formaldehyde Solution	Thermo Scientific	28908	use as a 4% solution
Acetic acid	Merck	100063	Components of TEA
Agarose	Biozym	850070
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-094
Normal goat serum	Sigma	NS02L
Sucrose	Sigma	S1888-1kg
Tris-base	Roche	TRIS-RO	Components of TEA
Triton X-100	Sigma	T8787-250ml	Diluted to 1% in PBS
Tween 20	Sigma	P2287-500ml
Drugs
Fentanyl 0.5 mg/10 mL	Braun Melsungen
Isoflurane 1 mL/mL	Cp-pharma	31303
Oxygen 5 L	Linde	2020175	Includes a pressure regulator
Antibodies
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488	Cell Signaling Technology	#4412	diluted to 1:200
Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647	Invitrogen	#A-21247	diluted to 1:200
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)	Invitrogen	H3570	diluted to 1:1000
Rabbit Anti-Connexin-43	Sigma	C6219	diluted to 1:200
Rat anti-HCN4 (SHG 1E5)	Invitrogen	MA3-903	diluted to 1:200
Other
Plexiglass ring			Self-designed and 3D printed
Plasticine	Cernit	49655005
Silikonpasten, Baysilone	VWR	291-1220
Animals
Mouse, C57BL/6	The Jackson Laboratory