JoVE Logo
Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Este artigo descreve métodos para preparação de tecidos, coloração e análise de papilas gustativas de fungos, circunvallato e paladar inteiros que produzem consistentemente papilas gustativas inteiras e intactas (incluindo as fibras nervosas que os inervam) e mantêm as relações entre estruturas dentro das papilas gustativas e a papila circundante.

Resumo

As papilas gustativas são coleções de células transdutoras especializadas para detectar subconjuntos de estímulos químicos na cavidade oral. Essas células transdutoras se comunicam com fibras nervosas que levam essa informação para o cérebro. Como as células transdutoras de paladar morrem continuamente e são substituídas ao longo da vida adulta, o ambiente de paladar é complexo e dinâmico, exigindo análises detalhadas de seus tipos celulares, suas localizações e quaisquer relações físicas entre elas. Análises detalhadas foram limitadas pela heterogeneidade e densidade do tecido da língua que reduziram significativamente a permeabilidade do anticorpo. Esses obstáculos requerem protocolos de secção que resultam na divisão de papilas gustativas entre as seções para que as medidas sejam apenas aproximadas, e as relações celulares sejam perdidas. Para superar esses desafios, os métodos aqui descritos envolvem a coleta, imagem e análise de papilas gustativas inteiras e arboris terminais individuais de três regiões de sabor: papilas fungiformes, papilas circunvallantes e paladar. A coleta de papilas gustativas inteiras reduz o viés e a variabilidade técnica e pode ser usada para relatar números absolutos para características como volume de paladar, invação total de paladar, contagem de células transdutoras e morfologia de arboris terminais individuais. Para demonstrar as vantagens deste método, este artigo proporciona comparações de papila gustativa e volumes de inervação entre papilas gustativas fungiformes e circunvallantes utilizando um marcador geral de paladar e um rótulo para todas as fibras de sabor. Um fluxo de trabalho para o uso de rotulagem genética de células esparsas de neurônios de sabor (com subconjuntos rotulados de células transdutoras de sabor) também é fornecido. Este fluxo de trabalho analisa as estruturas de arbores individuais de paladar-nervo, números de tipo celular e as relações físicas entre as células usando o software de análise de imagem. Juntos, esses fluxos de trabalho fornecem uma nova abordagem para a preparação e análise de tecidos de papilas gustativas inteiras e a morfologia completa de suas arboris inervas.

Introdução

As papilas gustativas são coleções de 50-100 células epiteliais especializadas que ligam subconjuntos de estímulos de gosto químico presentes na cavidade oral. Acredita-se que as células transdutoras de sabor existam como tipos1,2,3,4,5,6,7,8,9, inicialmente baseadas em critérios de microscopia eletrônica que foram posteriormente correlacionados com marcadores moleculares. As células tipo II expressam fosfolipase C-beta 2 (PLCβ2)2 e canal de cação potencial receptor transitório, subfamília M membro 51 e incluem células que transduem doce, amargo e umami1,10. As células tipo III expressam anidragem carbônica 4 (Car4)11 e proteína associada à sinapstosômica 258 e denotam células que respondem principalmente ao sabor azedo11. As células que transduem salgados não foram tão claramente delineadas12,13,14, mas poderiam potencialmente incluir células tipo I, Tipo II e Tipo III15,16,17,18,19. O ambiente de paladar é complexo e dinâmico, uma vez que as células transdutoras de sabor se transformam continuamente durante toda a idade adulta e são substituídas por progenitores basais3,20,21. Essas células transdutoras de sabor se conectam a fibras nervosas pseudo-unipolar do gânglio geniculado e petrosal, que passam informações de gosto para o tronco cerebral. Esses neurônios foram categorizados principalmente com base no tipo de informação de sabor que carregam22,23 porque as informações sobre sua morfologia têm sido evasivas até recentemente24. As células tipo II comunicam-se com fibras nervosas através da proteína moduladora de homeostase de cálcio 1 íon canais25, enquanto as células tipo III se comunicam através de sinapses clássicas8,26. Maior caracterização das células do paladar - incluindo linhagens do tipo celular transdutor, fatores que influenciam sua diferenciação e as estruturas de arbores de conexão são todas áreas de investigação ativa.

Estudos de paladar têm sido dificultados por vários desafios técnicos. Os tecidos heterogênios e densos que compõem a língua reduzem significativamente a permeabilidade de anticorpos para a imunohistoquímica27,28,29. Esses obstáculos têm exigido protocolos de secção que resultam na divisão de papilas gustativas entre as seções para que as medidas sejam aproximadas com base em seções representativas ou resumidas em todas as seções. Anteriormente, seções finas representativas têm sido usadas para aproximar os valores de volume e a contagem de células transdutoras30. Seção serial mais espessa permite a imagem de todas as seções de paladar e a soma das medidas de cada seção31. Cortando seções tão grossas e selecionando apenas vieses de paladar inteiros amostrando para papilas gustativas menores32,33,34. As estimativas de inervação nervosa das papilas gustativas seccionadas foram baseadas em análises dos números depixels 13,35, se quantificadas em todos os36,37,38. Essas medidas ignoram completamente a estrutura e o número de arbors nervosas individuais, porque as árvores são divididas (e geralmente mal rotuladas). Por fim, embora descascar o epitélio permita que papilas gustativas inteiras sejam manchadas39,40, ela também remove fibras nervosas gustativas e pode interromper as relações normais entre as células. Portanto, as investigações das relações estruturais dentro das papilas gustativas têm sido limitadas por causa dessa interrupção causada pelas abordagens de coloração.

A coleta de estrutura completa elimina a necessidade de seções representativas e permite a determinação de medições de valor absoluto de volumes, contagem de células e morfologias estruturais41. Essa abordagem também aumenta a precisão, limita o viés e reduz a variabilidade técnica. Este último elemento é importante porque as papilas gustativas apresentam considerável variabilidade biológica dentrode 34,42 e entre as regiões43,44, e análises de paladar inteiros permitem que números de células absolutas sejam comparados entre o controle e as condições experimentais. Além disso, a capacidade de coletar papilas gustativas intactas permite a análise das relações físicas entre diferentes células transdutoras e suas fibras nervosas associadas. Como as células transdutoras de sabor podem se comunicar entre si45 e se comunicar com as fibras nervosas46,essas relações são importantes para a função normal. Assim, as condições de perda de função podem não ser devido à perda de células, mas sim a mudanças nas relações celulares. Fornecido aqui é um método para coletar papilas gustativas inteiras para obter os benefícios de medidas absolutas para análises de volume de refino tanto para paladar quanto para suas innervações, contagem de células de paladar e formas, e para facilitar análises de relações transdutor-células e morfologias nervosas-arboriológicas. Dois fluxos de trabalho também são apresentados a jusante deste novo método de montagem total para preparação de tecidos: 1) para análise do volume da papila gustativa e inervação total e 2) para rotulagem genética de células esparsas de neurônios de paladar (com subconjuntos de células transdutoras de paladar rotuladas) e análises subsequentes da morfologia da árvore do nervo do paladar, números de tipos de células de sabor e suas formas, e o uso de software de análise de imagem para analisar as relações físicas entre células transdutoras e aquelas entre transdutores células e suas arboris nervosas. Juntos, esses fluxos de trabalho fornecem uma nova abordagem para a preparação de tecidos e para as análises de papilas gustativas inteiras e a morfologia completa de suas arboridades inervas.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

NOTA: Todos os animais foram atendidos de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Política de Serviços Públicos de Saúde dos EUA sobre o Cuidado Humano e Uso de Animais de Laboratório e o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Os camundongos Phox2b-Cre (cepa MMRRC 034613-UCD, NP91Gsat/Mmcd) ou ratos TrkBCreER (Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg) foram criados com ratos repórteres tdTomato (Ai14). AdvillinCreER47 foram criados com Phox2b-flpo48 e Ai65. Para injeções de 5-ethynyl-2′-desoxyuridina (EdU), a EdU foi preparada e as doses calculadas de acordo com Perea-Martinez et al.49.

1. Preparação de materiais

  1. Elaboração de soluções
    1. Dissolva 5,244 g de fosfato de sódio monobásico e 23,004 g de fosfato de sódio dibásico em água duplamente destilada (ddH2O) em uma placa de mexida. Ajuste o pH para 7,4 e leve o volume total para obter 1 L de tampão fosfato de sódio de 0,2 M (PB).
    2. Dissolver paraformaldeído em ddH2O em um capô de fumaça aquecendo enquanto mexe em uma placa de agitação até que a solução atinja 90 °C. Adicione a solução 4 M NaOH dropwise para limpar o paraformaldeído e filtre a solução usando um frasco de vácuo Erlenmeyer e filtro de cerâmica com papel filtro. Adicione um volume igual de 0,2 M PB, e ajuste o pH para 7,4 para obter 4% de PFA em 0,1 M PB.

2. Preparação tecidual

  1. Coleta de tecidos
    1. Sacrificar camundongos usando uma overdose anestésico com uma solução de trabalho contendo 10 mL de soro fisiológico e 0,25 mL de uma solução de estoque contendo 5 g de 2,2,2-tribromoetanol e 5 mL de álcool tert-amilol. Perfumia transcardialmente com 4% de PFA em 0,1 M PB; remover as línguas e o paladar.
    2. Isole as papilas gustativas circunvalolantes usando um corte coronal que separa a língua posterior, atrás da eminência intermolar; cortar as papilas gustativas com um razorblade; e, em seguida, bissecção da língua anterior na linha média. Pós-fixação durante a noite a 4 °C com 4% de PFA em 0,1 M PB.
    3. Crioprotetor o tecido em 30% de sacarose durante a noite a 4 °C.
      NOTA: O tecido pode ser congelado em composto de temperatura de corte ideal (OCT) usando 2-metilbutano refrigerado em um béquer em gelo seco e armazenado a -80 °C se o procedimento tiver que ser pausado aqui.
  2. Papilas gustativas fungiformes
    1. Esfrie 2-metilbutano em um béquer em gelo seco em preparação para a etapa 2.2.8.
    2. Descongele e enxágue a língua em 0,1 M PB. Coloque metade da língua anterior contendo as papilas fungiformes em uma lâmina de vidro sob um microscópio dissecando.
    3. Use fórceps e tesouras de dissecção para remover o músculo. Use fórceps sem corte para manter o tecido aberto à medida que o epitélio lingual é curvo, e garantir uma orientação plana mantendo as lâminas da tesoura de dissecção grosseira paralela ao epitélio.
    4. Descarte o epitélio ventral não queratinizado da língua, pois não contém papilas gustativas.
    5. Use uma tesoura de dissecção fina para dissecção mais próxima à parte inferior do epitélio queratinizado.
      NOTA: É importante dissecar perto do epitélio para que o músculo restante tenha espessura uniforme, e a superfície seja lisa para garantir a penetração uniforme de anticorpos. A consequência da espessura não uniforme do músculo restante será a secção desigual no criostato, com exposição do epitélio em áreas com menos músculo e uma camada mais espessa de músculo para outras áreas, o que impede a penetração de anticorpos.
    6. Use os fórceps de ponta sem corte para colocar um pedaço de epitélio em um molde de tecido (lado muscular para baixo), e garantir que ele se deite plana. Uma vez que o tecido é plano, adicione uma gota de OCT ao tecido.
      NOTA: Dado que a ponta da língua é curvada, pode ser necessário fazer um corte no epitélio onde ele é curvado para que o tecido possa ser feito para ficar liso.
    7. Coloque o molde de tecido em uma base metálica (previamente resfriado em gelo seco) sob o escopo de dissecação. Continue a tocar o tecido levemente com os fórceps até que o OCT tenha congelado para garantir que o tecido congele o mais plano possível.
    8. Uma vez que o OCT tenha congelado, adicione rapidamente oct adicional, e coloque o molde em um béquer de 2-metilbutano (resfriado em gelo seco) até congelar.
    9. Secção criostat
      NOTA: O criostat é usado para a remoção fina do tecido subcutâneo restante, que pode inibir a penetração de anticorpos(Figura 1).
      1. Monte os moldes OCT no criostat e corte seções de 20 μm. Colete cada seção e visualize-a sob o microscópio de luz para avaliar sua proximidade com a base do epitélio (Figura 1E - H).
      2. Depois que o tecido for raspado da parte inferior do epitélio, descongele o epitélio e enxágue-o duas vezes em 0,1 M PB em um shaker.
  3. Papilas gustativas circunvalolando
    1. Usando um corte coronal com um razorblade, separe a papila circunvallada da língua anterior. Use dois cortes parasagitais com a mesma lâmina de barbear para remover o tecido lateral à papila sob um escopo dissecando. Coloque a papila em um molde de tecido usando fórceps para que uma borda lateral da papila circunvallada fique de frente para a parte inferior do molde tecidual.
      NOTA: O tecido pode ser congelado em OUTUBRO usando 2-metilbutano refrigerado em um béquer em gelo seco e armazenado a -80 °C se o procedimento tiver que ser pausado aqui.
    2. Corte o tecido em seções flutuantes de 90 μm no criostat.
  4. Papilas gustativas no paladar
    1. Corte o paladar duro anterior à junção do paladar macio e duro(Figura 2). Use uma tesoura para separar o paladar macio do tecido subjacente, certificando-se de que quaisquer fragmentos ósseos restantes sejam cortados. Remova músculos adicionais e tecido conjuntivo.
      NOTA: Uma vez removido, todos os tecidos que restam consistirão em glândulas e tecido conjuntivo solto, que são levemente aderidos à parte inferior do paladar.
    2. Segure o paladar com fórceps sem cortes, e remova as glândulas restantes e o tecido conjuntivo solto raspando-os suavemente com uma lâmina de barbear.
      NOTA: O tecido pode ser congelado em OUTUBRO usando 2-metilbutano refrigerado em um béquer em gelo seco e armazenado a -80 °C se o procedimento tiver que ser pausado aqui.

3. Mancha de imunohistoquímica

  1. Lave os tecidos com 0,1 M PB, 3 x 15 min. Coloque os tecidos em tubos de 1 mL com solução de bloqueio (3% soro de burro, 0,5% surfactante não iônico (ver a Tabela de Materiais), 0,1 M PB) a 4 °C durante a noite.
  2. Remova a solução de bloqueio e incuba o tecido em anticorpo primário (coelhinho anti-PCLβ2) na solução de anticorpos (0,1 M PB, 0,5% surfactante não iônico) por 5 dias a 4 °C.
  3. Lave com 0,1 M PB, 4 x 15 min cada lavagem, e incuba em anti-coelho de burro secundário 488 anticorpo (1:500) em solução de anticorpos por 2 dias a 4 °C.
  4. Lave com 0,1 M PB, 4 x 15 min cada lavagem e bloqueie com 5% de soro de coelho normal na solução de anticorpos.
  5. Lave com 0,1 M PB, 4 x 15 min. Incubar com anticorpo anti-coelho de burro (20 μg/mL) em solução de anticorpos por 2 dias a 4 °C.
  6. Lave com 0,1 M PB, 4 x 15 min cada lavagem e, em seguida, incubar com anticorpo primário dsRed (coelho) conjugado a um rótulo fluorescente (de acordo com as instruções do fabricante) em uma solução de anticorpos por 5 dias a 4 °C.
  7. Lave com 0,1 M PB, 4 x 15 min cada lavagem e, em seguida, incuba com anticorpo primário (anti-Car4 de cabra (1:500)) em solução de anticorpos por 5 dias a 4 °C.
  8. Lave com 0,1 M PB, 4 x 15 min cada lavagem. Incubar com anti-cabra de burro secundário 647 anticorpo (1:500) em solução de anticorpos por 2 dias a 4 °C.
  9. Lave com 0,1 M PB, 4 x 15 min cada lavagem e monte (lado epitelial para cima) em mídia de montagem aquosa, e coloque um deslizamento sobre a seção do tecido.
    NOTA: Se usar anticorpos de diferentes espécies, como no caso apenas com queratina-8 e dsRed, adicione todos os anticorpos primários à solução de anticorpos na etapa 3.2 e todos os anticorpos secundários na etapa 3.3 antes de prosseguir para a etapa 3.9.

4. Imagem confocal e desconvolução

  1. Capture imagens confocal usando um microscópio confocal com um objetivo de 60x (Abertura Numérica= 1,40), 4 ms/pixel, zoom de 3, Kalman de 2 e tamanho de 1024 x 1024. Selecione um tamanho de etapa de 0,47 mm ao longo do eixo z. Para capturar a inervação na papila, use um zoom de 2,5 se o campo de visão com um zoom de 3 for muito estreito para capturar toda a inervação da papila.
  2. Para desconvoluir as imagens, observe que algumas configurações serão automaticamente importadas com a imagem; portanto, preencha os demais detalhes para a modalidade, lente objetiva, abertura numérica, meio de imersão, amostra média e fluoroforos capturados na imagem. Em seguida, selecione a desconvolução 3D.

5. Análise de imagem

  1. Papila gustativa e volume de inervação
    1. Importe pilhas de imagens desconvoludas para um software de análise de imagem baseado em pixels (ver a Tabela de Materiais) para determinar o volume da papila gustativa e o volume da inervação total dentro da papila gustativa.
      1. Desmarque o volume no menu objeto principal.
      2. Selecione Adicionar novas superfícies do menu Objeto. Selecione Pular a criação automática, editar manualmentee, em seguida, selecione Contorno.
      3. Clique em Selecionar e observar a seta que aparece como um + para ajudar a rastrear a borda da papila gustativa. Mova o cortador e delineie a papila gustativa em cada seção óptica. Uma vez que os contornos estejam completos, clique em Criar superfície.
      4. Observe o objeto de volume de paladar que aparece agora no menu objeto principal. Localize o volume da papila de paladar em Ferramentas.
    2. Volume de inervação dentro da papila gustativa
      1. Selecione o ícone de lápis sob o objeto paladar e selecione Mascarar Tudo.
      2. No menu suspenso, selecione o canal fluorescente que corresponde ao rótulo de fibra nervosa. Verifique Criar canal duplicado.
      3. Verifique Definir voxels fora da superfície para:, e digitar 0 na caixa.
      4. Observe o novo canal que aparece na janela Ajuste de exibição, que é uma duplicata não beterada do canal fluorescente selecionado dentro da papila gustativa.
      5. No menu objeto principal, selecione Criar nova superfície. Desmarcar Pular a criação automática, editar manualmente.
      6. Clique duas vezes na seta azul para prosseguir para o próximo passo.
      7. Clique em Excluir, em seguida, clique na seta dupla verde para completar a superfície, que representa o volume das fibras nervosas presentes dentro da papila gustativa. Para encontrar o valor do volume, selecione Ferramentas sob o menu Objeto de fibra nervosa e selecione Volume no menu suspenso.
    3. Volume de inervação para a papila
      1. Crie um volume da papila gustativa descrita na seção 5.1.
      2. Selecione o ícone de lápis sob o objeto paladar e selecione Mascarar Todos.
      3. No menu suspenso, selecione o canal fluorescente que corresponde ao rótulo de fibra nervosa. Verifique Criar canal duplicado.
      4. Verifique Definir voxels dentro da superfície para: e digitar 0 na caixa. Clique em OK.
      5. Gere uma superfície clicando em Adicionar nova superfície. Selecione Segmento apenas uma Região de Interesse.
      6. Clique na seta azule aumente o valor Z para que a região de interesse comece na base da papila gustativa.
      7. Clique duas vezes na seta azul para prosseguir para o próximo passo.
      8. Clique em Excluir, em seguida, clique na seta dupla verde para completar a superfície, que representa o volume da innervação para a papila. Para encontrar o valor do volume, selecione Ferramentas sob o menu Objeto de fibra nervosa e selecione Volume no menu suspenso.
    4. Análise de contato com árvore terminal
      1. Preparação de imagens
        1. Vá para o menu Editar e selecione Crop 3D. Corte a imagem em todos os lados, removendo o espaço fora da papila gustativa.
          NOTA: A cultura tão perto da papila do sabor sem remover qualquer estrutura relevante - qualquer imagem em excesso irá alongar o tempo de processamento.
        2. Selecione Editar no menu principal, clique em Alterar o tipo de dados. Selecione Para: 32 bits flutuam no menu suspenso.
        3. Selecione Adicionar novas superfícies do menu Objeto. Clique em Pular a criação automática, editar manualmente,selecionar Contornoe, em seguida, arrastar a posição de fatia para a direita para encontrar o número total de fatias ópticas.
        4. Gere voxels isométricos e certifique-se de que, em vez de os voxels serem retângulos (0,0691 x 0,0691 x 0,474) como XxYxZ, respectivamente, os voxels são 0,0691 x 0,0691 x 0,0691 dividindo os retângulos em cubos com valores idênticos para intensidade de fluorescência como o voxel original e retangular. Selecione Propriedades de imagem. Em seguida, divida o valor Z para o Tamanho Voxel pelo valor X ou Y (= 0,474/0,0691), e multiplique esse valor pelo número de fatias (seções ópticas) encontradas na etapa anterior.
        5. Volte para Editar no menu principal e selecione Resample 3D.
        6. Substitua o valor Z (número de fatias) pelo valor recém-calculado.
      2. Criando superfícies automáticas baseadas na fluorescência
        1. Clique em Adicionar nova superfície novamente para adicionar uma nova superfície, desmarcar segmento apenas uma região de interesse, e clique em Next.
        2. No menu suspenso do canal Source, selecione o canal para um dos tipos de células transdutoras de sabor. Desmarque Suave e continue para o próximo passo.
        3. Não altere nada na próxima tela que mostre a gama de intensidades fluorescentes presentes na imagem. Clique na seta azul na parte inferior novamente para passar para o próximo passo.
        4. Clique em Excluir, em seguida, clique na seta dupla verde para completar a superfície.
        5. Vá para o menu Objeto na mão esquerda da tela onde a superfície celular completa aparecerá e será chamada de algo genérico como Surface 2. Clique duas vezes no nome da superfície para nomeá-lo de acordo com o que o rótulo representa.
          NOTA: Neste caso, a superfície gerada é baseada na célula rotulada plcß2.
        6. Se houver pontos em vez de uma superfície, sob o menu no canto inferior esquerdo, clique no Surface em vez do ponto central. Em seguida, clique em OK quando solicitado.
        7. Repetir as etapas 5.3.2.1-5.3.2.5 para os outros marcadores celulares transdutores de sabor e o marcador de fibra nervosa.
        8. Salvar (exportar) o progresso.
        9. Clique em um tipo de célula Superfície no menu principal. No menu desse objeto, clique em Ferramentas, e clique em Transformação de Distância.
        10. Aguarde que uma caixa pop-up intitulada XTDistanceTransformation apareça. Selecione Objeto de superfície externo. Anote o novo canal que aparece no menu Ajuste de exibição chamado Distância para nome de superfície.
        11. Selecione a superfície da fibra nervosa no menu Objeto. Clique no ícone do lápis e, em seguida, mascarar tudo.
        12. No menu suspenso que aparece, selecione o novo nome distância do canal para superfície. Anote o novo canal que aparece na janela De ajuste de exibição chamada Distância Mascarada para nome de superfície.
        13. Crie um novo objeto usando o menu objeto principal. Segmento não seletivo apenas uma região de interesse e clique na seta azul. Selecione a distância mascarada para o canal PLCß2 e desmarque Suave.
        14. Na próxima tela, verifique se há alguma região onde as células transdutoras de sabor estão dentro da menor distância das fibras nervosas discerníveis por este software. Para isso, estabeleça um limite de 0,01-0,11 μm para verificar se há fluorescência celular receptora tão perto das fibras nervosas.
        15. Digite 0.01 na caixa verde do lado esquerdo para definir o limiar inferior, pressione a Guia. Em seguida, clique no botão vermelho e no tipo 0.11 para definir o limiar superior. Pressione a guia e clique na seta azul na parte inferior para passar para o próximo passo.
        16. Clique em Excluir e, em seguida, a seta dupla verde para terminar.
        17. Renomeie esta superfície Dentro de 0.01-0.11 de PLCß2 no menu Objeto. Selecione Dentro de 0.01 - 0.11 da superfície PLCß2 no menu Objeto.
        18. Selecione o lápis e clique em Máscara All. Selecione o canal vermelho (fibra de nervo) do menu suspenso e clique em OK. Anote o novo canal que aparece na janela Ajuste de exibição chamada CHS2 Mascarado.
        19. Clique no nome do canal; renomeie o canal Within 0.01 - 0.11 do PLCß2.
          NOTA: Este é um canal fluorescente que representa uma duplicata do canal fluorescente vermelho presente dentro da superfície criada.
        20. Clique em branco no meio do seletorde cores . Selecione uma cor que contrasta com as cores das estruturas.
        21. Exportar (ou seja, salvar) o arquivo nesta fase.
        22. Repetição de passos 5.4.2.9-5.4.2.21 para outros marcadores celulares transdutores de sabor.
        23. Exportar (ou seja, salvar) o arquivo nesta fase.
          NOTA: Para analisar a proximidade de um tipo de célula rotulada para outro, basta substituir a superfície da Fibra Nervosa na etapa 5.4.2.11 (e as seguintes etapas) com o objeto de interesse e os componentes equivalentes que pertencem a cada etapa subsequente.

6. Reconstrução da árvore do neurônio e quantificação absoluta do número celular

  1. Rastreamento e análise de arbor terminal
    1. Abra o arquivo de imagem desconvolucido em um software de análise de imagem baseado em vetores 3D (ver a Tabela de Materiais),selecione Trace,clique em Neurônioe clique em Dendrite.
    2. Role até a base da papila gustativa na pilha de imagens. Rastreie cada fibra até o final enquanto percorre a pilha de imagens.
    3. Quando estiver no final do ramal, clique com o botão direito do mouse na extremidade e selecione Final . Nos pontos da filial, clique com o botão direito do mouse e selecione O nó de bifurcação.
      NOTA: Isso permite rastrear um ramo até o final e, em seguida, retornar ao ponto de bifurcação e rastrear o outro ramo com o programa reconhecendo que este rastreamento ainda é do mesmo neurônio.
    4. Salve o arquivo de dados como um . Arquivo DAT, que pode então ser aberto para análise no software de análise de imagem baseado em vetores 3D.

7. Quantificação do número de células

  1. Quantifique as células de paladar rotuladas em qualquer pacote de software de análise de imagem, desde que marcadores distintos para tipos de células transdutoras ancoradas à posição z possam ser colocados no nível nuclear.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

A coloração do epitélio lingual com anticorpos para dsRed e queratina-8 (um marcador geral de paladar) rotulou tanto as papilas gustativas inteiras quanto toda a inervação do paladar em Phox2b-Cre:tdTomato ratos50,51 (Figura 3A). A imagem dessas papilas gustativas de seus poros para suas bases deu a maior resolução x-y imagens de avião(Figura 3A, B). A função de contorno do pro...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

O desenvolvimento de uma abordagem para coletar e manchar consistentemente papilas gustativas inteiras de três regiões de sabor da cavidade oral (fungos, circunvallato e paladar) proporciona melhorias significativas para a análise de células transdutoras de paladar, rastreamento de células recém-incorporadas, inervação e relações entre essas estruturas. Além disso, facilita a localização de um potencial marcador de neurônio secundário dentro ou fora de uma população rotulada50. Is...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos a Kavisca Kuruparanantha por suas contribuições para a coloração de tecidos e a imagem de papilas gustativas circunvalolantes, Jennifer Xu por coloração e imagem de inervação à papila, Kaytee Horn para cuidados com animais e genotipagem, e Liqun Ma por sua coloração tecidual dos paladares macios. Este projeto foi apoiado por R21 DC014857 e R01 DC007176 para R.F.K e F31 DC017660 para L.O.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
2,2,2-TribromoethanolACROS OrganicsAC421430100
2-MethylbutaneACROS126470025
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch711-007-00315.5μL/mL
Alexa Fluor® 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgGJackson Immuno Research712-605-150(1:500)
AutoQuant X3 software Media Cybernetics
Blunt End ForcepsFine Science Tools FST 91100-12
Click-iT™ Plus EdU Cell Proliferation KitMolecular ProbesC10637Follow kit instructions 
CoverglassMarienfeld107242
Cytokeratin-8Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), (RRID: AB_531826) Troma1 supernatant(1:50, store at 4°C)
Dissection Scissors (coarse)RobozRS-5619
Dissection Scissors (fine)MoriaMC19B
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA21206(1:500)
Donkey anti-Rabbit, Alexa Fluor® 555ThermoFisher ScientificA31572(1:500)
DyLight™ 405 AffiniPure Fab Fragment Bovine Anti-Goat IgGJackson Immuno Research805-477-008(1:500)
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01
Glass slidesFisher Scientific (Superfrost Plus Miscroscope Slides)12-550-15
Goat anti-Car4R&D Systems AF2414(1:500)
Imaris Bitplane pixel-based image analysis software
Neurolucida 360 + ExplorerMBF Biosciences3D vector based image analysis software
Normal Donkey SerumJackson Immuno Research017-000-121
Normal Rabbit Serum Equitech-Bio, IncSR30
Olympus FV1000(multi-Argon laser with wavelengths 458, 488, 515 and additional HeNe lasers emitting 543 and 633)
ParaformaldehydeEMDPX0055-34% in 0.1M PB
Rabbit anti-dsRedLiving Colors DsRed Polyclonal Antibody; Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496)632496(1:500)
Rabbit anti-PLCβ2 Santa Cruz BiotechnologyCat# sc-206(1:500)
Sodium Phosphate Dibasic AnhydrousFisher ScientificBP332-500
Sodium Phosphate MonobasicFisher ScientificBP330-500
tert-Amyl alcoholAldrich Chemical Company8.06193
Tissue MoldsElectron Microscopy Sciences70180
Tissue-Tek® O.C.T. CompoundSakura4583
Triton X-100BIO-RAD#161-0407
Zenon™ Alexa Fluor™ 555 Rabbit IgG Labeling KitThermoFisher ScientificZ25305Follow kit instructions 

Referências

  1. Clapp, T. R., Medler, K. F., Damak, S., Margolskee, R. F., Kinnamon, S. C. Mouse taste cells with G protein-coupled taste receptors lack voltage-gated calcium channels and SNAP-25. BMC Biology. 4 (1), 7(2006).
  2. Clapp, T. R., Yang, R., Stoick, C. L., Kinnamon, S. C., Kinnamon, J. C. Morphologic characterization of rat taste receptor cells that express components of the phospholipase C signaling pathway. The Journal of Comparative Neurology. 468 (3), 311-321 (2004).
  3. Delay, R. J., Roper, S. D., Kinnamon, J. C. Ultrastructure of mouse vallate taste buds: II. Cell types and cell lineage. The Journal of Comparative Neurology. 253 (2), 242-252 (1986).
  4. Finger, T. E. Cell types and lineages in taste buds. Chemical Senses. 30, Supplement 1 54-55 (2005).
  5. Kataoka, S., et al. The candidate sour taste receptor, PKD2L1, is expressed by type III taste cells in the mouse. Chemical Senses. 33 (3), 243-254 (2008).
  6. Murray, R. Fine structure of gustatory cells in rabbit taste buds. Journal of Ultrastructure Research. 27 (5-6), 444(1969).
  7. Murray, R. G., Murray, A. Fine structure of taste buds of rabbit foliate papillae. Journal of Ultrastructure Research. 19 (3), 327-353 (1967).
  8. Yang, R., Crowley, H. H., Rock, M. E., Kinnamon, J. C. Taste cells with synapses in rat circumvallate papillae display SNAP-25-like immunoreactivity. The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 205-215 (2000).
  9. Yee, C. L., Yang, R., Böttger, B., Finger, T. E., Kinnamon, J. C. "Type III" cells of rat taste buds: Immunohistochemical and ultrastructural studies of neuron-specific enolase, protein gene product 9.5, and serotonin. Journal of Comparative Neurology. 440 (1), 97-108 (2001).
  10. Zhang, Y., et al. Coding of sweet, bitter, and umami tastes. Cell. 112 (3), 293-301 (2003).
  11. Chandrashekar, J., et al. The taste of carbonation. Science. 326 (5951), 443-445 (2009).
  12. Oka, Y., Butnaru, M., Von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
  13. Stratford, J. M., Larson, E. D., Yang, R., Salcedo, E., Finger, T. E. 5-HT3A-driven green fluorescent protein delineates gustatory fibers innervating sour-responsive taste cells: A labeled line for sour taste. Journal of Comparative Neurology. 525 (10), 2358-2375 (2017).
  14. Baumer-Harrison, C., et al. Optogenetic stimulation of type I GAD65(+) cells in taste buds activates gustatory neurons and drives appetitive licking behavior in sodium-depleted mice. The Journal of Neuroscience. 40 (41), 7795-7810 (2020).
  15. Nomura, K., Nakanishi, M., Ishidate, F., Iwata, K., Taruno, A. All-electrical Ca(2+)-independent signal transduction mediates attractive sodium taste in taste buds. Neuron. 106 (5), 816-829 (2020).
  16. Ohmoto, M., Jyotaki, M., Foskett, J. K., Matsumoto, I. Sodium-taste cells require Skn-1a for generation and share molecular features with sweet, umami, and bitter taste cells. eneuro. 7 (6), (2020).
  17. Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
  18. Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
  19. Lewandowski, B. C., Sukumaran, S. K., Margolskee, R. F., Bachmanov, A. A. Amiloride-insensitive salt taste is mediated by two populations of type III taste cells with distinct transduction mechanisms. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1942-1953 (2016).
  20. Beidler, L. M., Smallman, R. L. Renewal of cells within taste buds. The Journal of Cell Biology. 27 (2), 263-272 (1965).
  21. Hamamichi, R., Asano-Miyoshi, M., Emori, Y. Taste bud contains both short-lived and long-lived cell populations. Neuroscience. 141 (4), 2129-2138 (2006).
  22. Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
  23. Spector, A. C., Travers, S. P. The representation of taste quality in the mammalian nervous system. Behavoiral and Cognitive Neuroscience Reviews. 4 (3), 143-191 (2005).
  24. Huang, T., Ohman, L. C., Clements, A. V., Whiddon, Z. D., Krimm, R. F. Variable branching characteristics of peripheral taste neurons indicates differential convergence. bioRxiv. , (2020).
  25. Taruno, A., et al. CALHM1 ion channel mediates purinergic neurotransmission of sweet, bitter and umami tastes. Nature. 495 (7440), 223-226 (2013).
  26. Kinnamon, J. C., Taylor, B. J., Delay, R. J., Roper, S. D. Ultrastructure of mouse vallate taste buds. I. Taste cells and their associated synapses. The Journal of comparative neurology. 235 (1), 48-60 (1985).
  27. Dando, R., et al. A permeability barrier surrounds taste buds in lingual epithelia. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 308 (1), 21-32 (2015).
  28. Mistretta, C. M. Permeability of tongue epithelium and its relation to taste. American Journal of Physiology. 220 (5), 1162-1167 (1971).
  29. Michlig, S., Damak, S., Le Coutre, J. Claudin-based permeability barriers in taste buds. The Journal of Comparative Neurology. 502 (6), 1003-1011 (2007).
  30. Kinnamon, S. C., Finger, T. E. Recent advances in taste transduction and signaling. F1000Research. 8, 2117(2019).
  31. Meng, L., Huang, T., Sun, C., Hill, D. L., Krimm, R. BDNF is required for taste axon regeneration following unilateral chorda tympani nerve section. Experimental Neurology. 293, 27-42 (2017).
  32. Meng, L., Ohman-Gault, L., Ma, L., Krimm, R. F. Taste bud-derived BDNF is required to maintain normal amounts of innervation to adult taste buds. eneuro. 2 (6), (2015).
  33. Tang, T., Rios-Pilier, J., Krimm, R. Taste bud-derived BDNF maintains innervation of a subset of TrkB-expressing gustatory nerve fibers. Molecular and Cellular Neuroscience. 82, 195-203 (2017).
  34. Zhang, G. H., Zhang, H. Y., Deng, S. P., Qin, Y. M. Regional differences in taste bud distribution and -gustducin expression patterns in the mouse fungiform papilla. Chemical Senses. 33 (4), 357-362 (2008).
  35. Huang, T., Ma, L., Krimm, R. F. Postnatal reduction of BDNF regulates the developmental remodeling of taste bud innervation. Developmental Biology. 405 (2), 225-236 (2015).
  36. Nosrat, I. V., Margolskee, R. F., Nosrat, C. A. Targeted taste cell-specific overexpression of brain-derived neurotrophic factor in adult taste buds elevates phosphorylated TrkB protein levels in taste cells, increases taste bud size, and promotes gustatory innervation. Journal of Biological Chemistry. 287 (20), 16791-16800 (2012).
  37. Liebl, D. J., Mbiene, J. -P., Parada, L. F. NT4/5 mutant mice have deficiency in gustatory papillae and taste bud formation. Developmental Biology. 213 (2), 378-389 (1999).
  38. Kumari, A., Yokota, Y., Li, L., Bradley, R. M., Mistretta, C. M. Species generalization and differences in Hedgehog pathway regulation of fungiform and circumvallate papilla taste function and somatosensation demonstrated with sonidegib. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
  39. Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
  40. Meisel, C. T., Pagella, P., Porcheri, C., Mitsiadis, T. A. Three-dimensional imaging and gene expression analysis upon enzymatic isolation of the tongue epithelium. Frontiers in Physiology. 11, 825(2020).
  41. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  42. Guagliardo, N. A., Hill, D. L. Fungiform taste bud degeneration in C57BL/6J mice following chorda-lingual nerve transection. The Journal of Comparative Neurology. 504 (2), 206-216 (2007).
  43. Ohtubo, Y., Yoshii, K. Quantitative analysis of taste bud cell numbers in fungiform and soft palate taste buds of mice. Brain Research. 1367, 13-21 (2011).
  44. Ogata, T., Ohtubo, Y. Quantitative analysis of taste bud cell numbers in the circumvallate and foliate taste buds of mice. Chemical Senses. 45 (4), 261-273 (2020).
  45. Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
  46. Finger, T. E. ATP signaling is crucial for communication from taste buds to gustatory nerves. Science. 310 (5753), 1495-1499 (2005).
  47. Lau, J., et al. Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-CreERT2 recombinase mouse. Molecular Pain. 7 (1), 100(2011).
  48. Hirsch, M. -R., D'Autréaux, F., Dymecki, S. M., Brunet, J. -F., Goridis, C. APhox2b::FLPotransgenic mouse line suitable for intersectional genetics. genesis. 51 (7), 506-514 (2013).
  49. Perea-Martinez, I., Nagai, T., Chaudhari, N. Functional cell types in taste buds have distinct longevities. PLoS ONE. 8 (1), 53399(2013).
  50. Ohman-Gault, L., Huang, T., Krimm, R. The transcription factor Phox2b distinguishes between oral and non-oral sensory neurons in the geniculate ganglion. Journal of Comparative Neurology. 525 (18), 3935-3950 (2017).
  51. Dvoryanchikov, G., et al. Transcriptomes and neurotransmitter profiles of classes of gustatory and somatosensory neurons in the geniculate ganglion. Nature Communications. 8 (1), (2017).
  52. Whitehead, M. C., Ganchrow, J. R., Ganchrow, D., Yao, B. Organization of geniculate and trigeminal ganglion cells innervating single fungiform taste papillae: a study with tetramethylrhodamine dextran amine labeling. Neuroscience. 93 (3), 931-941 (1999).
  53. Suemune, S., et al. Trigeminal nerve endings of lingual mucosa and musculature of the rat. Brain Research. 586 (1), 162-165 (1992).
  54. Rutlin, M., et al. The cellular and molecular basis of direction selectivity of Aδ-LTMRs. Cell. 159 (7), 1640-1651 (2014).
  55. Abraira, V. E., Ginty, D. D. The sensory neurons of touch. Neuron. 79 (4), 618-639 (2013).
  56. Feng, P., Huang, L., Wang, H. Taste bud homeostasis in health, disease, and aging. Chemical Senses. 39 (1), 3-16 (2014).
  57. Cooper, K. W., et al. COVID-19 and the chemical senses: supporting players take center stage. Neuron. 107 (2), 219-233 (2020).
  58. Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142 (21), 3620-3629 (2015).
  59. Roper, S. D. Taste buds as peripheral chemosensory processors. Seminars in Cell & Developmental Biology. 24 (1), 71-79 (2013).
  60. Ma, H., Yang, R., Thomas, S. M., Kinnamon, J. C. BMC. Neuroscience. 8 (1), 5(2007).
  61. Kinnamon, J. C., Sherman, T. A., Roper, S. D. Ultrastructure of mouse vallate taste buds: III. Patterns of synaptic connectivity. The Journal of Comparative Neurology. 270 (1), 1-10 (1988).
  62. Romanov, R. A., et al. Chemical synapses without synaptic vesicles: Purinergic neurotransmission through a CALHM1 channel-mitochondrial signaling complex. Science Signaling. 11 (529), 1815(2018).
  63. Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Superresolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68 (5), 843-856 (2010).
  64. Vandenbeuch, A., Clapp, T. R., Kinnamon, S. C. Amiloride-sensitive channels in type I fungiform taste cells in mouse. BMC Neuroscience. 9 (1), 1(2008).
  65. Bartel, D. L., Sullivan, S. L., Lavoie, ÉG., Sévigny, J., Finger, T. E. Nucleoside triphosphate diphosphohydrolase-2 is the ecto-ATPase of type I cells in taste buds. The Journal of Comparative Neurology. 497 (1), 1-12 (2006).
  66. Wilson, C. E., Vandenbeuch, A., Kinnamon, S. C. Physiological and behavioral responses to optogenetic stimulation of PKD2L1+ type III taste cells. eneuro. 6 (2), (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Neuroci nciaEdi o 168paladarmontaria inteirainerva oaferentel nguagosto

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados