Avaliação da dispersão de biofilme em feridas de Murine

Resumo

Aqui, descrevemos métodos ex vivo e in vivo para avaliar a dispersão bacteriana de uma infecção por ferida em camundongos. Este protocolo pode ser utilizado para testar a eficácia de terapias antimicrobianas e anti-biofilme tópicas, ou para avaliar a capacidade de dispersão de diferentes cepas bacterianas ou espécies.

Resumo

As infecções relacionadas ao biofilm estão implicadas em uma ampla gama de condições crônicas, como úlceras diabéticas não curativas, sinusite crônica, otite média recorrente e muito mais. As células microbianas dentro dessas infecções são protegidas por uma substância polimérica extracelular (EPS), que pode impedir que antibióticos e células imunes hospedeiras limpem a infecção. Para superar esse obstáculo, os investigadores começaram a desenvolver agentes dispersos como potenciais terapêuticos. Esses agentes têm como alvo vários componentes dentro do EPS biofilme, enfraquecendo a estrutura e iniciando a dispersão das bactérias, o que pode teoricamente melhorar a potência dos antibióticos e o despejo imunológico. Para determinar a eficácia dos agentes de dispersão para infecções por feridas, desenvolvemos protocolos que medem a dispersão de biofilmes tanto ex vivo quanto in vivo. Usamos um modelo de excisão cirúrgica de camundongos que foi bem descrito para criar infecções de feridas crônicas associadas a biofilmes. Para monitorar a dispersão in vivo,infectamos as feridas com cepas bacterianas que expressam luciferase. Uma vez estabelecidas infecções maduras, irrigamos as feridas com uma solução contendo enzimas que degradam componentes do EPS biofilme. Em seguida, monitoramos a localização e intensidade do sinal luminescente na ferida e órgãos filtrantes para fornecer informações sobre o nível de dispersão alcançado. Para análise ex vivo da dispersão de biofilmes, o tecido da ferida infectada está submerso em solução enzimética degradante de biofilme, após a qual a carga bacteriana restante no tecido, versus a carga bacteriana em solução, é avaliada. Ambos os protocolos têm pontos fortes e fracos e podem ser otimizados para ajudar a determinar com precisão a eficácia dos tratamentos de dispersão.

Introdução

O aumento da resistência a antibióticos em todo o mundo está levando à falta de opções de antibióticos para tratar uma variedade de infecções bacterianas¹. Além da resistência a antibióticos, as bactérias podem ganhar tolerância a antibióticos adotando um estilo de vida associado ao biofilme². Um biofilme é uma comunidade de microrganismos que são protegidos por uma matriz de polissacarídeos, DNA extracelular, lipídios e proteínas³, coletivamente chamada de substância polimérica extracelular (EPS). À medida que a crise de resistência a antibióticos continua, novas estratégias que prolongam o uso ou potencializam a eficácia de antibióticos são extremamente necessárias. Os agentes anti-biofilme são uma solução promissora⁴.

Entre as diferentes estratégias anti-biofilmes que foram propostas, a utilização de agentes dispersos, que visam diferentes componentes do EPS biofilme, estão na vanguarda do desenvolvimento terapêutico⁵. As hidrolases glicóvias (GH) são uma dessas classes de agente disperso. GH são uma grande classe de enzimas que catalisam o decote de diferentes laços dentro dos polissacarídeos que fornecem integridade estrutural ao EPS. Nosso grupo, assim como outros, têm demonstrado que o GH pode efetivamente degradar biofilmes, induzir dispersão e melhorar a eficácia de antibióticos para uma série de espécies bacterianas diferentes, tanto in vitro quanto in vivo^{6,7,8,9,10,11}.

Com um crescente interesse pela dispersão de biofilmes, é importante desenvolver métodos eficazes que avaliem a eficácia dispersa. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para o tratamento de infecções de feridas associadas a biofilmes com um agente dispersivo em camundongos, e a avaliação da eficácia dispersão, in vivo e ex vivo. O objetivo geral é fornecer métodos eficazes que possam ser usados com modelos pré-clínicos para medir a dispersão de biofilmes de forma eficaz e eficiente.

Um modelo de infecção por excisão cirúrgica de murina foi utilizado nesses estudos para estabelecer uma infecção associada a biofilmes. Utilizamos esse modelo há mais de 15 anos e publicamos nossas observações extensivamente^{7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21}. Em geral, este é um modelo de infecção não letal onde as bactérias permanecem localizadas no leito da ferida e são associadas ao biofilme (bactérias vistas em agregados cercados por EPS), configurando uma infecção crônica que dura até 3 semanas. No entanto, se os camundongos são imunocomprometidos (com diabetes tipo 1, por exemplo), eles podem se tornar mais suscetíveis ao desenvolvimento de uma infecção sistêmica fatal neste modelo.

Neste relatório, fornecemos protocolos para avaliar a dispersão de bactérias de uma ferida, tanto in vivo quanto ex vivo. Ambos os protocolos podem ser usados para examinar a eficácia de um agente disperso e ter suas próprias forças e fraquezas. Por exemplo, avaliar a dispersão in vivo pode fornecer informações importantes e em tempo real sobre a disseminação de bactérias para outras partes do corpo após a dispersão, e como o host responde. Por outro lado, avaliar a dispersão ex vivo pode ser mais desejável para a triagem de múltiplos agentes, doses ou formulações, pois o tecido pode ser dividido em múltiplas seções que podem ser testadas separadamente, reduzindo assim o número de camundongos necessários. Ao avaliar vários agentes, normalmente medimos a dispersão primeiro in vitro como descrito anteriormente ^6,9,22. Testamos então o teste ex vivo e reserva mais eficaz para um número limitado de agentes muito promissores.

Protocolo

Este protocolo animal foi revisado e aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Texas Tech University Health Sciences Center (protocolo número 07044). Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde.

1. Preparação de bactérias para infecções de camundongos

NOTA: Aqui descrevemos ratos infectantes apenas com Pseudomonas aeruginosa. No entanto, outras espécies bacterianas podem ser usadas para causar infecção. Cepas e materiais bacterianos estão detalhados na Tabela de Materiais.

1. Use pseudomonas aeruginosa cepa selvagem PAO1 carregando a luminescência plasmid pQF50-lux²³ para esses experimentos como descrito anteriormente⁷.
2. Grow P. aeruginosa esfoja em frascos de Erlenmeyer perplexos, com agitação a 200 rpm, no caldo luria-bertani (LB) a 37 °C por 16 a 20 h. Adicione uma concentração final de 100 μg/mL de ampicillina à cultura noturna de PAO1(pQF50-lux) para manutenção do plasmídeo.
3. Subcultura P. aeruginosa adicionando 100 μL da cultura da noite para o dia a um frasco de Erlenmeyer contendo 10 mL de caldo LB com uma concentração final de 100 μg/mL ampicillin. Em seguida, cresça por 2-2,5 h a 37 °C com agitação, para um OD_{600 nm} de 0,4, e depois diluído em série (1:10) três vezes para uma dose infectante de aproximadamente 10⁴ células.

2. Preparação da enzima dispersão de biofilm

NOTA: Para este estudo utilizamos uma solução de 10% de amilase e celulase de partes iguais (5% de cada), que será referida como "GH", para o tratamento de dispersão.

1. Use uma solução de 10% GH (c/v) de amilase (de Bacillus subtilis) e cellulase fúngica (de Aspergillus niger) diluída em 1x salina tampão fosfato (PBS). Use PBS como tratamento de controle do veículo.
2. Aqueça todos os tratamentos a 37 °C por 30 minutos para ativação da enzima.

3. Animais experimentais e configuração pré-operatória

1. Ratos domésticos, 5 companheiros de lixo por gaiola, em condições controladas pelo meio ambiente, com ciclos claros/escuros de 12h e acesso adequado a alimentos e água.
2. De preferência, use camundongos suíços webster, entre 8 e 10 semanas de idade.
3. Pesar camundongos para determinar a quantidade adequada de anestesia para administrar.
4. Administre anestesia pela injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de cetamina 10 mg/kg de xilazina.
5. Aplique creme para os olhos (por exemplo, Atualize P.M.) cuidadosamente no olho usando um cotonete para reduzir o ressecamento.
6. Monitore parâmetros fisiológicos, incluindo taxa respiratória, coloração da pele e temperatura corporal durante toda a cirurgia.

4. Cirurgia de excisão de espessura total dorsal

1. Avalie o plano cirúrgico da anestesia por aperto de dedo do pé e monitoramento da taxa respiratória e esforço. Raspe a superfície dorsal e aplique um creme depilatório por 10 minutos (ou conforme instruções do produto), após a qual retire suavemente, garantindo que a pele esteja seca.
2. Para o tratamento da dor, administre 0,05 mL de lidocaína subcutânea na área a ser extirpada, e injete 0,02 mL de buprenorfina subcutânea no escroto do pescoço. Espere 10 minutos para garantir que o tratamento da dor seja alcançado.
3. Antes da excisão, desinfete a superfície dorsal usando um cotonete de álcool e desenhe um círculo de 1,5 cm de diâmetro em direção à porção posterior da parte posterior da parte traseira. Mantenha um campo cirúrgico estéril durante todo o procedimento e use instrumentos autoclaved e luvas estéreis. Para limitar a contaminação, realize a cirurgia por um queimador Bunsen aceso e use ferramentas limpas para cada animal.
4. Administre uma ferida de pele excisional e de espessura total ao nível do músculo panniculus com uma tesoura cirúrgica.
5. Após a excisão, cubra imediatamente as feridas com um curativo de poliuretano semipermeável.
6. Injete aproximadamente^{10 4} UFC de bactérias em 100 μL PBS sob o curativo, no leito da ferida, para estabelecer uma infecção.
   NOTA: As feridas também podem ser infectadas com várias espécies de bactérias e/ou fungos simultaneamente, ou colocando biofilmes pré-formados¹², ou mesmo tecido desbridamento extraído de pacientes¹⁹, no leito da ferida.
7. Após a infecção, coloque os ratos na gaiola com almofadas de aquecimento e monitore até que recuperem o reflexo de direita.
   NOTA: Certifique-se de que os ratos não esfriam, pois isso pode levar à morte.
8. Estabeleça infecções por 48 h.
9. Inspecione os curativos adesivos diariamente para lágrimas e áreas de não adesão e substituídos, se necessário.

5. Tratamento de dispersão in vivo

NOTA: Aqui descrevemos a administração dos agentes de dispersão aplicando uma série de 3 soluções de irrigação de feridas tópicas(Figura 1). No entanto, o protocolo pode ser adaptado para outros tipos de entrega, como a aplicação de géis, cremes ou curativos.

1. Coloque camundongos sob anestesia isoflurane (a 3% e 1 L por minuto de oxigênio) enquanto administra os tratamentos.
2. Prepare três seringas de 1 mL, com agulhas de 25 G, contendo 200 μL de tratamento para cada rato.
3. Injete 200 μL de solução enzimápica ou controle de PBS sobre a ferida, levantando cuidadosamente e beliscando a pele com fórceps, ligeiramente acima da ferida em direção à cabeça do animal. Fure cuidadosamente a seringa através da pele levantada e injete lentamente a solução entre o curativo e a cama da ferida. O curativo utilizado neste estudo muitas vezes adere tanto ao leito da ferida quanto ao tecido circundante.
   1. Para garantir que toda a cama da ferida esteja coberta por solução, levante suavemente o curativo com fórceps, afastando-o lentamente da cama da ferida, enquanto injeta lentamente a solução.
4. Após o tratamento, coloque os ratos de volta em suas gaiolas por 30 minutos.
5. Após 30 minutos de exposição ao tratamento, re-anestesiar os camundongos com isofânure e aspirar a solução com uma seringa, certificando-se de perfurar na mesma área de antes.
   NOTA: Esta solução aspirada contém células bacterianas dispersas, que podem ser salvas para várias análises a jusante.
6. Administre o segundo e o terceiro tratamentos de irrigação como o primeiro, usando uma nova seringa cada vez.

6. Imagens e análises dispersas in vivo

NOTA: Se uma cepa luminescente de bactérias for utilizada para iniciar a infecção, um Sistema de Imagem In Vivo (IVIS) pode ser usado para visualizar a dispersão do leito da ferida.

1. Camundongos de imagem imediatamente antes e depois do tratamento e às 10 e 20h pós-tratamento (Figura 2 e Figura Suplementar 1).
2. Realize imagens enquanto os camundongos estão sob anestesia, colocando-os individualmente no IVIS e imagens cada uma por 5 s em um comprimento de onda de 560 nm. Salve imagens para análises posteriores.
   NOTA: O comprimento de onda ideal e o tempo de exposição dependerão do repórter usado e do instrumento IVIS e do software de imagem.
3. Para análise, abra imagens no software IVIS e selecione a área a ser analisada na Paleta de Ferramentas.
4. Para explicar o fundo, coloque um círculo no fundo de uma foto e, em seguida, coloque o mesmo círculo de tamanho em cima da cama de ferida para cada rato.
5. Para carregar valores de medição, selecione Medições de Região de Interesse > (ROI) e carregue a tabela de medições em uma planilha. Subtraia a leitura do círculo de fundo de cada uma das medidas do leito da ferida para calcular a luminescência de cada amostra. Calcule por cento de luminescência alterada por:
   PRÉ-tratamento do ROI pós-tratamento/ pré-tratamento do ROI) x 100.
   NOTA: O controle e os camundongos tratados devem ser analisados simultaneamente para normalizar variáveis que possam afetar a aquisição ou brilho da imagem.

7. Avaliar a dispersão determinando a UFC

1. Eutanize humanamente camundongos pela injeção intraperitoneal de 0,2 mL de sódio pentobarbital (por exemplo, Fatal Plus) sob anestesia com 100 mg/kg de cetamina 10 mg/kg de xilazina.
2. Colher tecido de cama de ferida primeiro removendo suavemente o curativo com fórceps estéreis, e depois cortar ao redor do perímetro do leito da ferida com uma tesoura cirúrgica estéril. Levante suavemente uma extremidade da cama da ferida com fórceps enquanto usa uma tesoura para cortar/provocar a amostra para longe da camada muscular.
3. Coloque tecido do leito da ferida em tubo de homogeneização pré-rotulado e pré-pesado de 2 mL contendo 1 mL de PBS. Pesar os tubos novamente depois de inserir as amostras e, em seguida, inverter suavemente 3-5 vezes para enxaguar qualquer bactéria dispersa ou frouxamente aderida, e remover o PBS. Adicione 1 mL de PBS fresco.
4. Para colher os baços, coloque os ratos em uma posição anatômica supina e fixe fixando suas extremidades em uma superfície de dissecção. Mergulhe a área a ser dissecada com 70% de etanol para desinfetar a área e evitar que a pele contamine a amostra.
5. Faça cuidadosamente uma pequena incisão perpendicular à linha média com uma tesoura cirúrgica na dermis inferior do abdômen inferior, certificando-se de puxar a pele para cima e para longe dos órgãos internos. Continue a incisão interiormente, ao longo da linha média, até que o esterno foi atingido. Uma vez exposta a cavidade peritoneal e os órgãos internos visíveis, separe suavemente o baço do tecido conjuntivo e coloque em um tubo de homogeneização separado.
6. Pesar baço e enxaguar com PBS, como descrito para o tecido do leito da ferida.
   NOTA: Outros órgãos de interesse podem ser colhidos da mesma forma.
   1. Ao fazer a incisão inicial, tome cuidado para evitar perfurar os intestinos ou outros órgãos.
7. Homogeneize amostras em tubos pré-preenchidos de 2 mL do moinho de contas usando um homogeneizador de bancada a 5 m/s para 60 s, duas vezes.
8. Para enumerar a UFC, diluir em série amostras e placa spot em ágar seletivo. Para diluição serial, pipeta 100 μL da amostra em 900 μL de PBS em um tubo de 1,5 mL, vórtice e repetição 5 vezes. Pipeta 10 μL de cada diluição em uma placa de ágar, como mostrado na Figura 3.
   NOTA: Se for necessária uma quantitação mais precisa da UFC, espalhe 100 μL de cada diluição da amostra através de placas de ágar separadas.

8. Avaliação ex vivo de dispersão ( Figura4)

1. Ferir camundongos e infectar com aproximadamente 10⁴ PAO1 como descrito acima, e depois eutanásia 48 h após a infecção.
2. Remova cuidadosamente o curativo com fórceps, utilizando técnica estéril e sem perturbar o leito da ferida.
3. Use uma tesoura cirúrgica estéril para cortar o perímetro do leito da ferida longe da pele não infectada usando fórceps para levantar uma extremidade do leito da ferida e tesoura para extirir tecido infectado da camada muscular por baixo e ao redor do tecido não infectado. Divida amostras de cama de ferida em partes iguais ou use inteiro.
4. Coloque o tecido da ferida em tubos vazios e pré-pesados de 2 mL homogeneizadores do moinho de contas. Em seguida, pese os tubos novamente depois de adicionar a amostra. Calcule o peso da amostra por:
   peso após adicionar amostra - peso antes de adicionar amostra.
5. Adicione 1 mL de PBS e inverta suavemente o tubo 3-5 vezes para enxaguar a amostra e remover quaisquer células planctônicas. Remova e descarte o PBS.
6. Adicione 1 mL de tratamento GH (ou PBS como controle negativo) à amostra e incubar por 2h a 37 °C com agitação a 80 rpm.
7. Remova a solução de dispersão de biofilmes e coloque em um tubo separado de 1,5 mL. Isto contém as células dispersas.
8. Adicione 1 mL de PBS à amostra de tecido restante e inverta suavemente 3-5 vezes para enxaguar todas as células dispersas restantes. Remova e descarte o PBS.
9. Adicione 1 mL de PBS ao tecido restante e homogeneize a 5 m/s por 60 s usando um homogeneizador de bancada.
10. Diluir em série a solução de células dispersas e a amostra de tecido homogeneizado colocando 100 μL de amostra em 900 μL de PBS em um tubo de 1,5 mL, e repetindo cinco vezes para um total de 6 diluições.
11. Placa spot 10 μL de cada diluição em ágar seletivo de mídia (por exemplo, Pseudomonas Isolation Agar for P. aeruginosa) e incubar as placas a 37 °C durante a noite.
12. Conte a UFC e calcule o 'percentual disperso' como (CFU em supernasal/ (CFU em CFU supernante+ em tecido biofilme)) x 100.

Resultados

Neste experimento, camundongos webster suíços de 8 a 10 semanas foram infectados com 104 UFC de PAO1 carregando a luminescence plasmid pQF50-lux. Como descrito acima, foi permitida uma infecção estabelecer-se por 48 horas antes de administrar tratamentos de 3 x 30 min de PBS (controle de veículo) ou 10% GH (tratamento) para digerir o EPS biofilme. Os camundongos foram retratados antes do tratamento, logo após o tratamento (0h) e às 10h e 20h após o tratamento. Figura 2A e<...

Discussão

Aqui descrevemos protocolos que podem ser utilizados para estudar a eficácia dos agentes de dispersão de biofilmes. Esses protocolos podem ser facilmente adaptados para uso com diferentes tipos de agentes dispersivos, espécies bacterianas ou amostras ex vivo, incluindo amostras de debridamento clínico. Este protocolo também fornece um modelo clinicamente relevante para coletar e estudar células bacterianas dispersas. Os fenótipos de células bacterianas dispersas têm se mostrado distintos dos das célula...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Fisher	14823434	Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle	Fisher	14823434	Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt	Fisher	BP1760-5	Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase	MP Biomedicals	2100447	Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)	ZooPharm	RX216118	Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase	MP Biomedicals	2150583	Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream	Walmart	287746	Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips	Fisher	12-460-536	Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL	Fisher	101406	Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer	MP Biomedicals	6VFV9	Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus	Vortech Pharmaceuticals	0298-9373-68	Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)	Fisher	15340151	Used to homogenize samples for plating
Isoflurane	Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN	Sigma Aldrich	K4138	Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller	Fisher	BP1426-2	Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable	Diamond Back Drugs	2468	Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem	Sigma Aldrich	PHR1772-500MG	Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges	Fisher	13-761-52	Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain	Ref [13]	N/A	PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes	Fisher	PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x	Fisher	BP3991	Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing	Mckesson	66024007	Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar	VWR	90004-394	Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M.	Walmart		Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisher	22-363-750	Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors	Fisher	89515	Can also use curved scissors
Swiss Webster mice	Charles River	551NCISWWEB	Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL	Fisher	14823434	Used to administer drugs and enzyme treatment