Imagem 3D de fibras de colágeno PDL durante movimento dentário ortodôntico no modelo de murina mandibular

Resumo

Apresentamos um protocolo para geração de movimento dentário ortodôntico em camundongos e métodos para visualização 3D das fibras de colágeno e vasos sanguíneos do ligamento periodontal sem secção.

Resumo

O movimento dontário ortodôntico é um processo biológico complexo de remodelação de tecidos moles e duros alterados como resultado de forças externas. Para compreender esses complexos processos de remodelação, é fundamental estudar os tecidos dentários e periodontais dentro de seu contexto 3D e, portanto, minimizar quaisquer secções e artefatos tecuais. Modelos de camundongos são frequentemente utilizados em biologia desenvolvimentante e estrutural, bem como em biomecânica devido ao seu pequeno tamanho, alta taxa metabólica, genética e facilidade de manuseio. Em princípio, isso também os torna excelentes modelos para estudos odontológicos. No entanto, um grande impedimento é o tamanho do dente pequeno, os molares em particular. Este artigo visa fornecer um protocolo passo a passo para a geração de movimento dentário ortodôntico e dois métodos para imagem 3D do componente fibroso do ligamento periodontal de um molar mandibular de camundongos. O primeiro método apresentado baseia-se em uma configuração de micro-TC que permite a melhor imagem de aprimoramento de fase de tecidos de colágeno frescos. O segundo método é um método de limpeza óssea usando cinnamate etílico que permite a imagem através do osso sem secção e preserva fluorescência endógena. Combinando este método de compensação com ratos repórteres como Flk1-Cre; TdTomato proporcionou uma primeira oportunidade de imagem da vasculatura 3D no PDL e osso alveolar.

Introdução

O processo biológico básico subjacente no movimento dentário ortodôntico (OTM) é a remodelagem óssea. O gatilho para este processo de remodelação é atribuído a alterações na estrutura do ligamento periodontal (PDL) como estresse da matriz extracelular (ECM), necrose, bem como destruição e formação de vasos sanguíneos^1,2,3. Outros possíveis gatilhos para a remodelação óssea alveolar estão relacionados à detecção de força por osteocitos no osso, bem como a deformação mecânica do próprio osso alveolar; no entanto, seu papel na OTM ainda não é totalmente elucidado^4,5.

Apesar de muitos estudos que visam revelar relações estrutura-função do PDL durante o OTM, um mecanismo funcional claro ainda está para ser definido^6,7. A principal razão para isso é o desafio na recuperação de dados de um tecido mole (PDL) localizado entre dois tecidos duros (cementum e osso alveolar). Os métodos aceitos para coletar informações estruturais geralmente exigem fixação e seção que interrompem e modificam a estrutura PDL. Além disso, a maioria desses métodos produz dados 2D que, mesmo que não distorcidos, dão apenas informações parciais e localizadas. Uma vez que o PDL não é uniforme em sua estrutura e função, uma abordagem que aborda a estrutura 3D intacta de todo o complexo de osso dentário-PDL é justificada.

Este artigo descreverá um método para gerar um OTM em camundongos e dois métodos que permitem a visualização 3D das fibras de colágeno no PDL sem qualquer seção da amostra.

Os modelos murinos são amplamente utilizados para experimentos in vivo em medicina, biologia do desenvolvimento, entrega de medicamentos e estudos estruturais. Eles podem ser geneticamente modificados para eliminar ou melhorar proteínas e funções específicas; eles fornecem controle de desenvolvimento rápido, repetível e previsível; eles também são fáceis de imagem devido ao seu pequeno tamanho⁸. Apesar de suas muitas vantagens, os modelos de camundongos em pesquisas odontológicas não são utilizados com frequência, especialmente quando as manipulações clínicas são justificadas, principalmente devido aos dentes de pequeno porte. Modelos animais como ratos^9,10,11, cães^12,13, porcos^14,15,16 e macacos¹⁷ são usados com mais frequência do que ratos. Com o recente desenvolvimento de técnicas de imagem de alta resolução, as vantagens de utilizar um modelo de mouse para decifrar os processos complicados em OTM são inúmeras. Este artigo apresenta um método para gerar um movimento mesial do dente molar na mandíbula com níveis constantes de força que desencadeiam a remodelação óssea. A maioria dos experimentos de OTM em roedores são feitos na maxila, uma vez que a mobilidade da mandíbula e a presença da língua adicionam outro nível de complexidade. No entanto, a mandíbula tem muitas vantagens quando a integridade estrutural 3D é desejada. Pode ser facilmente dissecado como um osso inteiro; em algumas espécies pode ser separado em duas mandíbulas hemi através da sífilis fibrosa; é compacto, plano e contém apenas os dentes sem espaços sinusos. Em contraste, a maxila é uma parte do crânio e intimamente relacionada a outros órgãos e estruturas, assim é necessária uma seção extensiva para dissecar o osso alveolar com os dentes associados.

Utilizando uma câmara de umidade interna acoplada a um sistema de carregamento dentro de uma micro-TC de alta resolução que permite o aprimoramento de fase, desenvolvemos um método para visualizar tecidos fibrosos frescos em 3D como descrito anteriormente^{9,18,19,20,21,22,23}. Tecidos frescos são escaneados imediatamente após o animal ser sacrificado sem qualquer coloração ou fixação, o que reduz artefatos teciduais, bem como alterações de propriedades biomecânicas. Esses dados 3D podem ser utilizados para análises de distribuição e direção das fibras descritas em outros lugares¹⁹.

O segundo método de imagem tecidual 3D apresentado aqui é baseado na limpeza óptica da mandíbula que permite a imagem das fibras PDL através do osso sem qualquer secção. Curiosamente, também permite a visualização das fibras de colágeno do próprio osso, porém isso não será discutido aqui. Em geral, existem dois métodos para limpeza tecidual. A primeira é a limpeza baseada em aquoso, onde a amostra está imersa em uma solução aquosa com um índice refrativo superior a 1,4, seja através de uma simples imersão, hiperhidratação ou incorporação de hidrogel. No entanto, esse método é limitado ao nível de transparência, bem como à preservação estrutural do tecido e, portanto, requer fixação do tecido. O segundo método que produz amostras altamente transparentes e não requer fixação é o método de compensação baseado em solventes^24,25. Geramos um método de compensação modificado à base de solventes baseado em etil-3-fenilprop-2-enoato (etil cinnamate, ECi) para as amostras mandibulares. Este método tem as vantagens de usar um agente de compensação de grau alimentar não tóxico, encolhimento mínimo de tecidos e preservação de proteínas fluorescentes.

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram realizados em conformidade com as Diretrizes do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Harvard (Protocolo nº 01840).

1. Movimento ortodôntico de dente

1. Para gerar uma cama de rato, use uma plataforma de plástico plana com uma cunha em forma de encravado, encostou em 45° de enceinte. O encores de cabeça pode ser gerado cortando uma caixa de plástico.
   1. Eleve a extremidade da cabeça da plataforma para gerar um ângulo de aproximadamente 30° entre o encorfeito da cabeça e o plano de mesa. Conecte um clipe de papel grosso dobrado (0,036" de diâmetro) à extremidade lateral da cabeça para segurar os incisivos superiores.
   2. Na extremidade da cauda, gere uma superfície elevada à qual uma corrente de energia ortodôntica pode ser anexada para segurar os incisivos inferiores. Consulte a Figura 1 para uma plataforma de exemplo.
2. Anesthetize mouse por injeção intraperitoneal de xilazina a 10 mg/kg e cetamina 100mg/kg usando seringa de 1 mL e uma agulha calibre 27.
3. Coloque o mouse anestesiado na plataforma personalizada e imobilize a mandíbula superior, enganchando os incisivos superiores no loop do clipe de papel. Abra a mandíbula inferior do mouse com a corrente de energia ortodôntica ligada nos incisivos inferiores. Mantenha as bochechas retraídas com o retrátil da boca mini-colibri.
4. Coloque a plataforma sob um microscópio cirúrgico ou qualquer outro estereoscópio que possa atingir a ampliação de 5-6x.
5. Aplique 50 μL de soro fisiológico (aproximadamente 1 gota) nos olhos do rato para evitar a desidratação da córnea. Reabastecer soro fisiológico a cada 20 minutos.
6. Corte um pedaço de um fio de alumínio (0,08 mm de diâmetro) de 1 cm de comprimento. Deslize o fio do lado bucal linguly na área interproxmal abaixo do ponto de contato entre o primeiro e o segundo molares usando um suporte de agulha microcirúrgica. Deixe a borda livre de 2 mm na frente do primeiro molar para ser enfiada na extremidade da mola.
7. Corte um pedaço de bobina de titânio de níquel (NiTi), em torno de 7 a 9 fios de comprimento.
   NOTA: As propriedades elásticas da bobina fornecerão força constante para o movimento ortodôntico. O comprimento total não treinado da bobina deve ser menor do que a distância entre o incisivo e o molar. Tenha em mente que são necessários 2 fios extras em cada extremidade para ancorar a bobina até o dente. O fio de alumínio é selecionado para reduzir os artefatos de varredura, como o endurecimento do feixe durante a micro-tomografia computadorizada.
8. Insira mola de bobina NiTi (diâmetro de fio de 0,15 mm, diâmetro da bobina interna de 0,9 mm; fornece uma força de 10 g) entre o primeiro molar inferior e o incisivo inferior. Use a ligadura de arame inserida ao redor do primeiro molar na etapa 1.6, gire o fio firmemente em torno de 2 fios da mola da bobina para fixar a bobina no lado molar.
9. Para garantir o nível de força uniforme, use exatamente 3 roscas ativas entre o primeiro molar e o incisivo. Remova temporariamente a corrente de alimentação do incisivo e enrole 2 a 3 roscas não treinadas sobre o incisivo para ancorar a bobina. Deslize os fios para baixo para a margem gengival livre incisivo.
10. Coloque uma camada de resina composta esvoaçante na borda incisal da bobina e cure-a com luz de cura dental. Substitua a corrente de alimentação após a cura da resina.
11. Usando a mesma luz de cura, aqueça a bobina NiTi por 20 s. Isso vai apertar a bobina NiTi. A colocação finalizada é mostrada Figura 1C.
12. Deixe o lado contralateral intacto ou insira uma farsa, como o fio entre o primeiro e o segundo molares.
13. Coloque o mouse anestesiado sob uma luz aquecida para manter o mouse aquecido até a recuperação.
14. Coloque o mouse de volta em uma gaiola individual e monitore diariamente. Nenhuma mudança de dieta é necessária durante o movimento ortodôntico.
    NOTA: O dispositivo OTM de um lado causa algum desconforto, mas não prejudica a alimentação. No entanto, a inserção de dispositivos em ambos os lados não é aconselhável devido à quantidade adicional de desconforto. A medicação para dor não é necessária a menos que sinais externos de dor sejam vistos.

2. Micro-tomografia de fibras PDL em mandíbulas hemi-mandíveis frescas

1. Montagem da hemi-mandíbula (Figura 2)
   1. Após a duração desejada do movimento ortodôntico, sacrifique o rato através de deslocamento cervical. Remova a mandíbula e se separe em mandíbulas hemi.
      NOTA: Como a amostra não será fixada, é fundamental realizar a dissecção da mandíbula e a montagem o mais rápido possível, idealmente dentro de 30 minutos.
   2. Remova o tecido mole circundante suavemente com uma limpeza limpa sem fiapos.
   3. Remova o dispositivo ortodôntico usando tesouras microcirúrgicas e pinças sob um microscópio estéreo com pelo menos 4x de ampliação.
   4. Mantenha a amostra úmida em um volume de 1,5 mL, tubo de microcrédito, juntamente com um pedaço de lenço sem fiapos umedecido com água.
   5. Coloque resina composta dentária embalada no slot amostral no palco e coloque a hemi-mandible fresca no composto. Antes de montar certifique-se de que a superfície óssea em contato com o composto dentário esteja livre de quaisquer tecidos moles e seco, caso contrário, o composto dental não será curado adequadamente.
   6. Ajuste a posição da hemi-mandíbula até que o primeiro molar esteja centrado no sulco médio do palco. Certifique-se de que a superfície oclusal é horizontal. Cure o composto quando estiver satisfeito com o posicionamento.
      NOTA: Podem ser colocadas pequenas quantidades adicionais de compósitos dentários nas laterais da hemi-mandíbula e/ou em todo o incisivo para ajudar na estabilização da amostra.
   7. Coloque umedecimento sem fiapos umedecido dentro das piscinas de umidade no estágio amostral. Coloque composto dentário na superfície oclusal do primeiro molar. Antes de fechar a câmara, certifique-se de que nada bloqueie o caminho do raio-x no nível da amostra.
   8. Afixe a câmara no micro-CT. Enrosque a câmara no estágio da amostra microcsicular para que o movimento durante a imagem seja minimizado.
   9. Ligue os raios-X e tire imagens 2D enquanto baixa a bigorna verticalmente, até que a ponta da bigorna esteja cercada pelo composto, mas nenhum aumento na força é detectado.
   10. Uma vez que a bigorna esteja incorporada no composto, feche a fonte de raios-X. Em seguida, abra a câmara micro-CT e cure o composto através da janela plexiglass clara.
2. Configurações de microcsição
   1. Ajuste a tensão de origem para 40 kV e corrente para 200 μA. Utilizando um detector de ampliação de 10x, posicione a amostra dentro do quadro de visão. Use binning de 2 para as imagens capturadas.
      NOTA: Uma vez que o PDL é significativamente menos denso que o osso e o dente, visualizar o PDL requer maior potência e tempo de exposição. Este protocolo fornecerá configurações para visualizar o PDL.
   2. Defina o tempo de exposição de imagem única para 25 s. Definir a rotação do estágio amostral para uma faixa de 183 graus ou mais. Defina a varredura para 2500 projeções. Não utilize nenhum filtro de origem de raios-X, os exames resultantes têm um tamanho voxel de 0,76 μm de cada lado.
   3. Colete uma verificação de referência para reconstrução adequada de acordo com as diretrizes da microcs . Use 1/3 de imagens de referência como as projeções totais. Reconstrua o volume sem binning adicional, usando um algoritmo filtrado de projeção traseira.

3. Método de compensação(Figura 3)

1. Prepare cinco tubos de microcrédito de 1,5 mL.
2. Preparar 1,4 mL das seguintes soluções em tubos de micro centrífugas de 1,5 mL: 4% paraformaldeído (PFA) em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS), 50% de etanol (EtOH) em água desionizada (DI), 70% EtOH em água DI e dois tubos de 100% EtOH.
   NOTA: O PFA é usado para fixação da amostra. A limpeza do ECi também funcionará em amostras não fixas. Para limpar amostras não fixas, basta pular a etapa PFA.
3. Coloque a hemi-mandible dissecada em 4% pfa. Cubra com papel alumínio e coloque sobre o roqueiro em ajuste suave à temperatura ambiente por 6h.
4. Mova a hemi-mandible para 50% EtOH. Coloque-o no roqueiro coberto de luz por 16 horas.
5. Mova a hemi-mandible para 70% EtOH. Coloque-o no roqueiro coberto de luz por 16 horas.
6. Mova a hemi-mandible para 100% EtOH. Coloque-o no roqueiro coberto de luz por 16 horas.
7. Repita 3.6. no segundo tubo 100% EtOH.
8. Prepare 5 mL de ECi em um tubo de vidro ou polipropileno.
   NOTA: O ECi dissolve o poliestireno, mas não o polipropileno. Além disso, se não usar um tecido com proteínas fluorescentes, a amostra pode ser exposta à luz durante o procedimento de compensação.
9. Mova a hemi-mandible para o tubo ECi. Cubra o tubo com papel alumínio e coloque sobre o roqueiro em um ajuste suave por um mínimo de 12 h.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. A amostra desidratada pode ser armazenada em ECi à temperatura ambiente. O ponto de congelamento ou fusão de ECi é de 6,5 a 8,0 °C. Não armazene a 4 °C.
10. A hemi-mandíbula está pronta para imagem com microscópio de fluorescência.
    NOTA: Durante a imagem, a amostra deve ser imersa no ECi para permanecer opticamente transparente.

Resultados

Este artigo apresenta um método para produzir OTM, bem como dois métodos para imagem 3D de fibras de colágeno dentro do PDL sem qualquer secção. Para fins de pesquisa animal, quando o alinhamento dos dentes não é necessário, um movimento dentário é considerado ortodôntico se gera remodelação do osso alveolar em todos os níveis radiculares. O nível de força constante aplicado nos dentes é necessário para gerar um OTM confiável. Aqui, uma bobina NiTi de memória de forma ativada é usada para gerar uma f...

Discussão

Gerar OTM em camundongos é altamente desejado devido ao tamanho, genética e vantagens de manuseio. O uso da mandíbula proporciona um manuseio fácil tanto em termos de dissecção tecidual quanto de preparação de amostras e imagens. Aqui apresentamos um método para gerar OTM com movimento translacional do dente dentro do osso dentro de 7 dias de OTM. Utilizando este protocolo, a duração geral do movimento dos dentes pode ser estendida, uma vez que a bobina ativada fornece um nível de força constante para o movi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-mL BD Luer-Lok syringe	BD	309628
1X phosphate buffered saline	VWR Life Sciences	0780-10L
200 proof ethanol	VWR Life Sciences	V1016
Aluminum alloy 5019 wire	Sigma-aldrich	GF15828813	0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar.
Avizo 9.7	Thermo Fisher Scientific	N/A	Used to analyze microCT scans
Castroviejo Micro Needle Holders	Fine Science Tools	12060-01
Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm	Zeiss	N/A	Used for second harmonic generation imaging
Cone socket handle, single ended, hand-form	G.Hartzell and son	126-CSH3	Handle of the inspection mirror
EC Plan-Neofluar 5x/0.16	Zeiss	440321-9902	Used for light-sheet imaging
Elipar DeepCure-S LED curing light	3M ESPE	76985
Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL	Eppendorf	22363204
Ethyl cinnamate, >= 98%	Sigma-aldrich	W243000-1KG-K
Hypodermic Needle, 27G x 1/2''	BD	305109
Ketathesia 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-0702-1
KIMWIPES delicate task wipers	Kimberly-Clark	21905-026 (VWR Catalog number)	Purchased from VWR
LightSheet Z.1 dual illumination microscope system	Zeiss	LightSheet Z.1/LightSheet 7	Used for lightsheet imaging
LSM 880 NLO multi-photon microscope	Zeiss	LSM 880 NLO	Used for two-photon imaging
MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread	Hahnenkratt	6220	Front surface inspectrio mirror
MicroCT machine, MicroXCT-200	Xradia	MICRO XCT-200
Mini-Colibri	Fine Science Tools	17000-01
PermaFlo Flowable Composite	Ultradent	948
Procedure platform	N/A	N/A	Custom-made from lab materials
Routine stereo micscope M80	Leica Micosystems	M80
Sentalloy NiTi open coil spring	TOMY Inc.		A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona.
T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter	Orthodontics	SBLW109	0.009''(.23mm) diameter, Soft temper
X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-7085-1
Z100 Restorative, A2 shade	3M ESPE	5904A2