Estabelecendo um sistema de cultura esferoide epidérmico de alta produtividade para modelar a plasticidade das células-tronco de ceratinócito

Resumo

Aqui descrevemos um protocolo para o cultivo sistemático de esferoides epidérmicos na cultura de suspensão 3D. Este protocolo possui amplas aplicações para uso em uma variedade de tipos de tecido epitelial e para a modelagem de várias doenças e condições humanas.

Resumo

A desregulação epitelial é um nó para uma variedade de condições e doenças humanas, incluindo ferimentos crônicos, inflamação e mais de 80% de todos os cânceres humanos. Como tecido forro, o epitélio da pele é frequentemente sujeito a lesões e tem se adaptado evolutivamente adquirindo a plasticidade celular necessária para reparar tecido danificado. Ao longo dos anos, vários esforços foram feitos para estudar a plasticidade epitelial usando modelos in vitro e ex vivo baseados em células. No entanto, esses esforços têm sido limitados em sua capacidade de recapitular as várias fases da plasticidade celular epitelial. Descrevemos aqui um protocolo para a geração de esferoides epidérmicos 3D e células derivadas de esferoides epidérmicos de queratinócitos humanos neonatais. Este protocolo descreve a capacidade das culturas eferóides epidérmicas de modelar funcionalmente estágios distintos da plasticidade generativa de queratinócitos e demonstra que a re-platide epidérmica pode enriquecer culturas heterogênicas normais de queratinócitos (NHKc) para subpopulações intenα6^hi/EGFR^lo queraatinóte com características avançadas de tronco. Nosso relatório descreve o desenvolvimento e manutenção de um sistema de alto rendimento para o estudo da plasticidade da queratinócito da pele e da regeneração epidérmica.

Introdução

O epitélio estratificado dos mamíferos é a arquitetura epitelial mais complexa em todos os sistemas vivos e está frequentemente sujeito a danos e lesões. Como um tecido protetor, o epitélio estratificado evoluiu para gerar uma resposta complexa e eficaz de danos teciduais. Após a lesão, essas células devem ativar programas de plastifica de linhagem, que permitem migrar para o local lesionado e realizar o reparo^1,2,3. Essa resposta multifacetada ocorre em várias etapas sequenciais que permanecem mal compreendidas.

Um grande obstáculo no estudo do intrincado processo de regeneração epitelial está na escassez de sistemas de modelos de alto rendimento que podem capturar atividades celulares dinâmicas em estágios definidos de regeneração celular. Enquanto os modelos de mouse in vivo oferecem uma visão relevante sobre a cicatrização de feridas e mais intimamente recapitulam o processo regenerativo humano, seu desenvolvimento exige esforços trabalhosos e custo significativo, limitando sua capacidade de rendimento. Existe, portanto, uma necessidade crítica de estabelecer sistemas que permitam a investigação funcional da regeneração do tecido epitelial humano em alta escala de rendimento.

Nos últimos anos, várias tentativas foram feitas para enfrentar o desafio de escalabilidade. Isso é visto através de uma grande expansão de modelos inovadores baseados em células in vitro e ex vivo que imitam de perto o contexto regenerativo in vivo. Isso inclui avanços nas culturas organ-on-chip⁴, esferoide^5,organoide⁶e organotípica⁷. Esses sistemas baseados em células 3D oferecem vantagens únicas e apresentam limitações experimentais distintas. Até o momento, a cultura esferoide continua sendo o modelo de cultura celular 3D mais econômico e amplamente utilizado. E embora vários relatórios tenham indicado que culturas esferoides podem ser usadas para estudar características de células-tronco da pele, esses estudos têm sido conduzidos em grande parte com tecido animal^8,9, ou com fibroblastos dérmicos^10,sem praticamente nenhum relato caracterizando completamente as propriedades regenerativas das culturas esferoides epidérmicas humanas. Neste protocolo detalhamos o desenvolvimento funcional, a cultura e a manutenção das culturas eferóides epidérmicas de queratinócitos humanos normais (NHKc). Descrevemos igualmente a utilidade deste sistema para modelar as fases sequenciais da regeneração epidérmica e da plasticidade das células-tronco queratinócitos in vitro.

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Protocolo

O protocolo de coleta e manuseio de amostras de pele e isolamento de queratinócitos humanos foi revisado pela Universidade da Carolina do Sul (UofSC) IRB e classificado como "pesquisa não envolvendo seres humanos", pois os espécimes de prepúcio eram descartes cirúrgicos produzidos durante procedimentos cirúrgicos de rotina (circuncisão de meninos recém-nascidos) e eram completamente desprovidos de identificação de informações. O protocolo também foi revisado e aprovado pelo Comitê de Biossegurança da UofSC regularmente, e todos os funcionários do laboratório foram submetidos a treinamento de biossegurança laboratorial. Todos os procedimentos foram realizados em concordância com as normas de segurança e ética da UofSC.

1. Isolamento e cultura de queratinócitos humanos a partir de tecido neonatal de prepúcio

1. Prepare o meio de lavagem adicionando 0,1 M de tampão HEPES a 500 mL de meio KSFM e ajuste-o a um pH de 7,2. Esterilize o meio em um filtro de vácuo de 500 mL (tamanho de poros de 0,22 μm). O meio basal MCDB 153-LB também pode ser usado como uma solução alternativa de lavagem no lugar do KSFM.
2. Em uma capa de fluxo laminar, lave o prepúcio neonatal com 5 mL de mídia de lavagem em um tubo cônico de 50 mL. Repita duas vezes.
3. Transfira prepúcio lavado para uma placa de Petri estéril. Usando um bisturi e fórceps, raspe os tecidos adiposos e soltos da camada dérmica. Relave o prepúcio com 5 mL de mídia de lavagem em um tubo cônico de 50 mL.
4. Coloque o lado da epiderme prepúcio em uma placa de 6 poços contendo 2 mL de enzima despase diluída em mídia de lavagem (50 U/mL).
5. Transfira a placa para uma incubadora por 4 horas (37 °C, 5% DE CO₂, 95% de umidade).
6. Remova o prepúcio da incubadora e, em condições estéreis, transfira-o para uma placa de Petri. Usando fórceps finos, separe a epiderme da camada de derme.
7. Coloque a epiderme em um tubo cônico de 15 mL contendo 2 mL de 0,25% Trypsin-EDTA. Usando um tubo sorológico de 5 mL, esmague mecanicamente a epiderme flutuante. Incubar por 15 min a 37 °C com vórtice periódico para 5 s a cada 5 min.
8. Após a incubação, adicione 2 mL de inibidor de trippsina de soja e misture por pipetação para neutralizar a trippsina.
9. Suspensão celular centrífuga por 2 min a 450 x g, e depois por 8 min a 250 x g.
10. Remova detritos flutuantes com fórceps, tomando cuidado para não desalojar a pelota celular. Aspirar cuidadosamente o supernaente da pelota celular.
11. Resuspend pelotas em 12 mL de meio KSFM-scm completo e placa em um prato de 10 cm. Incubar prato durante a noite (37 °C, 5% CO₂, 95% umidade).
12. No dia seguinte, remova o meio usando uma pipeta aspirando e substitua por 12 mL completo KSFM-scm. Repita nos dias 4 e 7.
13. Para manter o crescimento ideal das culturas normais de queratinócitos humanos (NHKc), as células de passagem 1:5 no dia 10 para evitar que as células atinjam maiores que 80% de confluência.

2. Gerando culturas de epidermófera da pele in vitro

1. Prepare uma mistura de 5% de agarose adicionando 2,5 g de agarose a 50 mL de salina tamponada de fosfato de 1x (PBS), em uma garrafa de vidro de 50 mL. Garrafa de autoclave sob ciclo líquido. Deixe esfriar até a temperatura ambiente.
2. Para preparar as placas, coloque a garrafa de vidro resfriada contendo solução agarose em um béquer plástico 1 L recheado com 200 mL de água deionizada (dH₂O). Derreter a mistura de agarose em um micro-ondas de nível de pesquisa por até 2 minutos, misturando o ágar a cada 60 s, inclinando suavemente a garrafa de um lado para o outro.
   ATENÇÃO: O derretimento do ágar no micro-ondas fará com que o recipiente de frasco fique extremamente quente, resultando em acúmulo de pressão. Liberar acúmulo de pressão a cada 30 s. Use equipamentos de proteção adequados para evitar ferimentos.
3. Adicione 3 mL de 5% de relados a 12 mL KSFM-scm pré-equipado a 42 °C para uma concentração final de 1% de agarose (wt/vol).
   Opcional: pré-aqueça as pipetas sorológicas e as pontas da pipeta para evitar a polimerização prematura do ágar macio.
4. Pipeta rápida 200 μL da mistura de 1% de ágar em poços individuais de uma placa de fundo redondo de 96 poços usando um pipettor multicanal(Figura 1A). Deixe a placa em ambiente estéril a 25 °C por 4h para permitir que a agarose polimerize completamente.
   NOTA: A experimentação pode ser interrompida aqui e continuada no dia seguinte. As placas de agarose polimerizadas podem ser mantidas a 37 °C até 24 h ou a 4 °C por até 48 h quando seladas com envoltório de parafilm. Placa quente a 37 °C em uma incubadora umidificada por pelo menos 1 h antes de usar.
5. Passagem de NHKc formador de spheroids aspirando mídia e células de lavagem em 2 mL de PBS. Aspire PBS e adicione 2 mL de 0,25% Trypsin-EDTA às células lavadas. Incubar por 5 min a 37 °C ou até que todas as células se desprendem completamente. Adicione 2 mL de Inibidor de Trippsina de Soja à placa e lave as células da placa em um tubo de 15 mL. Centrifugar a 250 x g por 5 min.
6. Resuspend pelotas em 1 mL de PBS. Quantifique a viabilidade celular usando coloração azul trypan e um hemocitómetro ou um contador de células automatizado.
7. Aliquot 2 x 10⁴ NHKc em 100 μL de KSFM-scm e semente em poços individuais de placa redonda de 96 poços previamente preparados. Incubar placa durante a noite (37 °C, 5% CO₂, 95% umidade).
8. Usando um microscópio de contraste de fase invertida, analise bem semeado para formação da epidermófera.
   NOTA: As epidermosfófilas humanas dos queratinócitos humanos normais podem permanecer viáveis na cultura de suspensão 3D por até 96 h, embora com uma diminuição considerável na viabilidade celular(Figura 2).

3. Ensaio de reesplação esferoide epidérmico

1. 24-48 h após a formação da epidermófera 3D, adicione 4 mL de KSFM-scm pré-armado a um prato de 6 cm. Use uma ponta de pipeta de 1 mL larga para transferir um único esferoide para a placa, garantindo não quebrá-lo. Alternativamente, amplie uma ponta de pipeta de 1 mL usando uma lâmina de barbear estéril para cortar a ponta.
2. Incubar a placa durante a noite (37 °C, 5% DE CO₂, 95% de umidade).
3. Analise o esferoide semeado para fixação na parte inferior da placa e observe para propagar células usando um microscópio de contraste de fase invertida(Figura 3). Alimentar células a cada 96 h removendo suavemente 2 mL da mídia dentro da placa e adicionando lentamente 2 mL de mídia KSFM-scm fresca à placa.
4. Passagem spheroid-derivado (SD) NHKc uma vez que atingem 70-80% de confluência e continuam com o ensaio de escolha. Monitore o SD-NHKc com frequência para evitar que as células atinjam total confluência na cultura, pois isso resulta em diferenciação prematura e prisão de crescimento celular(Figura 3E-F).
5. O ensaio de reseferóide epidérmico modelos de ensaio mediado por queratinócitos, capturando cada uma das fases sequenciais chave da plasticidade regenerativa epidérmica: a) manutenção homeostática, b) mobilidade de linhagem de estresse/mobilidade de linhagem de estresse d (Figura 1B; Tabela 2). Este ensaio também pode ser usado para produzir populações celulares para culturas organotípicas de jangadas ou para modelar neoplasia mediada pelo HPV, como demonstrado em nosso trabalho anterior ^11,12.

Rastreamento celular de fluorescência 4.3D

1. Em um prato de 6 cm, transfeto spheroid-formando culturas 2D monocamada NHKc com 1 μg de pMSCV-IRES-EGFP vetor plasmid carregando o gene de proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP). Incubar placa durante a noite (37 °C, 5% CO₂, 95% umidade) microscópio(Figura 4A).
   NOTA: É importante que a transfecção seja concluída em condições livres de antibióticos sem soro.
2. Sem remover a mistura de transfecção, adicione 2 mL de KSFM-scm pré-armado às células. Incubar placa durante a noite (37 °C, 5% CO₂, 95% umidade).
3. Aspire todas as mídias de transfecção de células de placa e alimentação com 3 mL de KSFM-scm pré-armados. Avalie a presença de células expressas por EGFP sob o canal FITC de um microscópio fluorescente.
4. Passagem e semente 2 x 10⁴ células transfectadas de EGFP em poços individuais de uma placa de fundo redondo previamente preparada. Incubar placa durante a noite (37 °C, 5% CO₂, 95% umidade). Visualize e monitore o movimento de^{células eferóides EGFP} sob o canal FITC de um microscópio de fluorescência(Figura 4B-C).
5. 24 h após o revestimento, adicione 3 mL de KSFM-scm pré-armado a um prato de 6 cm. Use uma ponta de pipeta de 1 mL larga para transferir um único esferoide para a placa, garantindo não quebrá-lo. Incubar placa durante a noite (37 °C, 5% CO₂, 95% umidade).
6. Observe e analise a propagação SD-NHKc^EGFP usando um microscópio de fluorescência. Alimentar células a cada 96 h removendo suavemente 2 mL da mídia dentro da placa e adicionando lentamente 2 mL de mídia KSFM-scm fresca à placa.
7. Colher SD-NHKC^EGFP para isolamento facs ou ensaios de escolha.

5. Caracterização de subséduas derivadas de esferoides (SD) pela FACS

1. Passagem SD-NHKc e culturas de monocamadas 2D autólogas correspondentes aspirando mídia antiga e células de lavagem em 2 mL de PBS. Remova o PBS e adicione 2 mL de 0,25% trypsin-EDTA às células lavadas. Incubar a 37 °C por 5 min ou até que todas as células se desprendem completamente.
2. Adicione 2 mL de Inibidor de Trippsina de Soja à placa e transfira células para um tubo de 15 mL. Centrifugar a 250 x g por 5 min.
3. Resuspend pelotas em 1 mL de PBS. Quantifique a viabilidade celular usando o azul trypan e um contador automatizado de células do hemócitometro.
4. Aliquot 100 μL contendo 0,1-4 x 10⁶ células NHKc a tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL. Coloque o tubo no gelo em um ambiente escuro, criado desligando luzes brilhantes dentro do capô laminar.
5. Adicione 2 μL de anti-integrinα6 conjugados fitc e 2 μL de anti-EGFR conjugado pe aos tubos para obter uma diluição de 1:50. Prepare um tubo sem anticorpos adicionados para servir como o controle não manchado. Incubar tubos no gelo no escuro ou a 4 °C por 30 min. O uso de contas ou uma linha SCC da pele pode servir como controle positivo, já que as células SCC da pele expressam níveis elevados de integrinα6 e EGFR.
6. Realize a análise de citometria de fluxo usando o citômetro de fluxo de escolha contendo lasers apropriados.
7. Use os controles negativos e positivos para estabelecer portões. Classificar a subpopulação de células de^lo integrinα6/EGFR; estas são a fração de células-tronco epidérmicas. Integrinα6^hi/EGFR^hi cells são a fração celular progenitora proliferativa. As células^{de oi} integrinα6^lo/EGFR são a fração celular progenitora comprometida(Figura 4D). A classificação dos tubos FACS deve conter pelo menos 1 mL de KSFM-scm gelado.
8. Teste para capacidade proliferativa de subpopulações celulares classificadas transferindo o conteúdo de cada tubo de classificação respectivo para um tubo cônico de 15 mL contendo 10x o volume de células classificadas em PBS. NOTA: É importante remover todas as células presas à borda, encanar a parede do tubo FACS de classificação várias vezes, pois os queratinócitos podem muitas vezes aderir lá.
9. Centrifugar tubos de 15 mL a 250 x g por 5 min. Remova a pelota supernascida e resuspendida em 12 mL de KSFM-scm. Transfira as células resuspended em uma placa de 6 cm e incubar durante a noite (37 °C, 5% DE CO_2,95% de umidade).
10. No dia seguinte, remova a mídia nas placas e adicione 8 mL de KSFM-scm pré-aquecido. Incubar a 37 °C, 5% DE CO₂, 95% de umidade. Re-alimentar células com 12 mL de meio a cada 3 dias até 70-80% confluentes(Figura 4E).

6. Imunofluorescência e coloração de epidermosférteis para marcadores de células-tronco basais

1. Transfira epidermoses para tampas revestidas com poli-lisina. Permita que o SD-NHKc se propague até 75% de confluente.
2. Lave as células duas vezes em PBS (4 °C) por 5 min cada.
3. Fixar células com 4% de paraformaldeído (PFA) por 20 minutos à temperatura ambiente.
4. Células permeabilizes com 0,5% Triton X-100 em 1% de glicocina. Bloqueie usando 0,5% de BSA e 5% soro de cabra por 30 minutos à temperatura ambiente.
5. Incubar amostras com anticorpos contra P63 (1:200) e citokeratina 14 (1:200) em solução de bloqueio durante a noite a 4 °C.
6. Lave três vezes com PBS (4 °C) contendo Interpol 20 (PBST), seguida de incubação com anticorpos secundários FITC-e Alexa 568 (diluição de 1:1000).
7. Núcleos de manchas com 4', 6-diamidino-2-fenilôndole (DAPI) (diluição 1:5000) antes da montagem das células.
8. Observe células usando um microscópio com capacidade fluorescente com linhas laser FITC e PE(Figura 4F).

7. Análise transcricional das culturas da epidermófera

1. Configurar placas triplicadas de culturas NHKc de baixa passagem para isolar o RNA pode ser de culturas derivadas de monóbóias, esferoides da mesma linha celular autóloga.
2. As epidermómos correspondentes da piscina 3-5 em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL. Colher separadamente culturas autólogas de SD-NHKc e monocamadas 2D.
3. Isole o RNA total dos três grupos.
4. Realize a transcrição reversa com 1 μg de RNA total.
5. Utilizando cDNA, execute PCR em tempo real, utilizando GAPDH como controle interno(Tabela 1).
6. Validar o tamanho do produto amplicon por eletroforese de gel agarose (2% v/v).
   NOTA: Para o perfil transcriômico de culturas epidermóferas usando análise de microarray de genoma inteiro, isole o RNA total das culturas de massa de um único doador NHKc e correspondente SD-NHKc do mesmo doador, em seis réplicas cada.
7. Avalie a qualidade do RNA usando um bioanalílise para alcançar os Números de Integridade do RNA (RIN) variando de pelo menos 9,0 a 9,1.
8. Realize experimentos de microarray amplificando e biotiningando amostras totais de RNA.
9. Transcreva reversa 100 ng de RNA total por amostra em ds-cDNA usando primers aleatórios NNN contendo uma sequência de promotor de polimerase T7 RNA.
10. Adicione a polimerase T7 RNA às amostras de cDNA para amplificar o RNA e, em seguida, copie o RNA para ss-cDNA. Degrade o excesso de RNA usando RNase H.
11. Fragmentar moléculas de SSCDNA e rotular com biotina.
12. Amplie amostras rotuladas por 16 h a 45 °C.
13. Hibridize amostras usando um forno de hibridização e um kit de lavagem e mancha.
14. Matrizes hibridizadas de lavagem e coloração.
15. Digitalize os arrays usando um sistema e uma estação de trabalho do computador.
16. Após a conclusão das varreduras de array, importe arquivos de intensidade celular (CEL) em software de console de expressão e processe no nível genético usando arquivo de biblioteca e algoritmo robust Multichip Analysis (RMA) para gerar arquivos CHP.
17. Depois de confirmar a qualidade dos dados no Expression Console, importe arquivos CHP contendo sinais de expressão log2 para cada teste em um software de análise de transcriptome para analisar respostas transcricionais específicas do tipo celular usando uma análise unidirecional entre os sujeitos de variância.

8. Avaliação da eficiência formadora de colônias SD-NHKc

1. Aspirar a mídia das placas quando as células atingirem 70-80% de confluência. Lave as células três vezes em PBS (4 °C) por 5 min cada.
2. Fixar células com 3 mL de 100% de metanol (4 °C) por 15 min. Lave três vezes em PBS por 5 min cada.
3. Células de manchas em 3 mL de 10% Giemsa por 30 min. Lave três vezes em PBS por 5 min cada. Deixe as células secarem durante a noite.
4. Analisar a formação de colônias no dia seguinte e quantificar o número de colônias obtidas

9. Determinar duplicações populacionais do SD-NHKc

1. Passagem SD-NHKc e culturas de monocamadas 2D autólogas correspondentes aspirando mídia antiga e células de lavagem em PBS de 2mL. Remova o PBS e adicione 2 mL 0,25% trypsin-EDTA às células lavadas. Incubar por 5 min ou até que todas as células se desprendem completamente (37 °C, 5% DE CO₂, 95% de umidade).
2. Adicione 2 mL de Inibidor de Trippsina de Soja à placa e transfira células para um tubo de 15 mL.
3. Centrifugar a 250 x g por 5 min.
4. Remova a pelota supernasce e resuspend em 12 mL de KSFM-scm.
5. Células de sementes em baixa densidade 1-2 x 10⁴ NHKc em pratos individuais de 10 cm e incubam durante a noite (37 °C, 5% DE CO_2,95% de umidade).
6. Placas de alimentação com 8 mL KSMF-scm no dia seguinte. Alimente a cada 4 dias até pelo menos 25% confluentes, depois se alimente a cada 2 dias.
7. Células de passagem em série 1:5 em 60 cm pratos até que a capacidade proliferativa celular esteja esgotada. Quantifique a viabilidade celular por manchas azuis de trypan. Determinar duplicações populacionais em cada passagem usando a fórmula: log(N/N₀) / log2, onde N representa o número total de células obtidas em cada passagem e N₀ representa o número de células banhadas no início do experimento.

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Resultados

Durante o ensaio da epidermófera da pele, as culturas NHKc são semeadas em poços revestidos de agarose de uma placa de 96 poços(Figura 1A). As células formadoras de esferoides devem se auto-agregar dentro de 48h. A formação de esferoides autônomos pode ser avaliada a partir de 24 horas usando um microscópio de contraste de fase invertido padrão. formação da epidermófera da pele e re-plating modelo de ensaio várias fases da regeneração do tecido epidérmico

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Discussão

O uso de sistemas de cultura esferoide 3D tem tido ampla utilidade na avaliação da haste celular. Esses sistemas têm sido demonstrados para melhorar o enriquecimento das células-tronco teciduais¹³, mas sua utilidade para o estudo de células-tronco epidérmicas humanas tem sido explorada limitadamente. Aqui, descrevemos uma estratégia para enriquecer células-tronco de queratinócitos humanos usando técnicas de cultura 3D. Neste sistema, o NHKc é cultivado como suspensões eferóides multic...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affymetrix platform	Affymetrix		For microarray experiments
Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file	Affymetrix		Process
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent		For microarray experiments
All Prep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80204	Used for RNA isolation
Analysis Console Software version 3.0.0.466			analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance
BD FACSAria II flow cytometer	Beckman		For flow cytometry
Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For confirming data quality
Cytokeratin 14	Santa Cruz Biotechnology	sc-53253	1:200 dilution
Dispase	Sigma-Aldrich	D4818	For cell media
FITC-conjugated anti-integrinα6	Abcam	ab30496	For FACS analysis
GeneChip Command Console 4.0 software	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For confirming data quality
GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific)	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For washing and staining of hybridized arrays
GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For hybridization and amplifycation of total RNA
GeneChip Hybridization Oven 640	Thermo Fisher Scientific		For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples
GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific).	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For washing and staining of hybridized arrays
GeneChip Scanner 3000 7G system	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		Scanning hybridized arrays
GeneChip WT PLUS Reagent Kit	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For amplifycation of biotinylating total RNA
Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2)	Cell Signaling Technology	8910	For cell media
Human Epidermal Growth Factor (hEGF)	Cell Signaling Technology	8916	For cell media
Human Insulin	Millipore Sigma	9011-M	For cell media
iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad)	Bio-Rad	1708880	Used for RT-qPCR
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1708890	Used for RT-qPCR
KSFM	ThermoFisher Scientific	17005041	Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin
KSFM-scm	ThermoFisher Scientific	17005042	Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin
MCDB 153-LB basal medium	Sigma-Aldrich	M7403	MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer
NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS	Stellar Scientific	NST230111	For immunostaining
P63	Thermo Scientific	703809	1:200 dilution
PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number )	BD Pharmingen	555997	For FACS analysis
pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector	Addgene	20672	For transfection
Promega TransFast kit	Promega	E2431	For transfection
Qiagen RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen		For microarray experiments
Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units	Thermo Scientific	09-740-63D	For cell media
Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope	Zeiss		Use with Axiovision Rel. 4.5 software