Caracterização funcional de variantes ryr1 humanas expressas e endógenas

Resumo

Aqui são descritos métodos usados para estudar o efeito funcional das mutações RYR1 expressas endógenamente no Vírus Epstein Barr, linfócitos B humanos e células de satélite derivadas da biópsia muscular diferenciadas em miótubos.

Resumo

Mais de 700 variantes do gene RYR1 foram identificadas em pacientes com diferentes distúrbios neuromusculares, incluindo suscetibilidade de hipertermia maligna, miopatias centrais e miopatia centronuclear. Devido aos diversos fenótipos ligados às mutações RYR1, é fundamental caracterizar seus efeitos funcionais para classificar variantes transportadas pelos pacientes para futuras intervenções terapêuticas e identificar variantes não patogênicas. Muitos laboratórios têm se interessado em desenvolver métodos para caracterizar funcionalmente mutações RYR1 expressas nas células dos pacientes. Essa abordagem tem inúmeras vantagens, incluindo: mutações são expressas endógenamente, RyR1 não é super-expressa, o uso de células expressas heterólogas RyR1 é evitado. No entanto, uma vez que os pacientes podem apresentar mutações em diferentes genes além do RYR1, é importante comparar os resultados de material biológico de indivíduos que abrigam a mesma mutação, com diferentes origens genéticas. O presente manuscrito descreve métodos desenvolvidos para estudar os efeitos funcionais das variantes ryr1 expressas endógenamente em: (a) O vírus Epstein Barr imortalizou linfócitos B humanos e (b) células satélites derivadas de biópsias musculares e diferenciadas em miotubes. Alterações na concentração intracelular de cálcio desencadeadas pela adição de ativadores RyR1 farmacológicos são então monitoradas. O tipo de célula selecionada é carregado com um indicador de cálcio fluorescente ratiométrico e alterações intracelulares [Ca²⁺] são monitoradas tanto no nível de célula única por microscopia de fluorescência ou em populações celulares usando um espectrômetro. As curvasde resposta à dose agonista são então comparadas entre células de controles saudáveis e pacientes que abrigam variantes RYR1 levando a uma visão sobre o efeito funcional de uma determinada variante.

Introdução

Até o momento, mais de 700 variantes RYR1 foram identificadas na população humana e ligadas a vários distúrbios neuromusculares, incluindo suscetibilidade de hipertermia maligna (SM), rabdomiólise induzida pelo exercício, doença central do núcleo (CCD), doença multi-minicore (TM), miopatia centronuclear (CNM)^1,2,3 ; no entanto, estudos para caracterizar seus efeitos funcionais estão defasados e apenas aproximadamente 10% das mutações foram testadas funcionalmente. Diferentes abordagens experimentais podem ser usadas para avaliar o impacto de uma determinada variante RyR1, incluindo transfecção de células heterólogas como HEK293 e CÉLULAS CO-7 com codificação plasmida para o WT e mutante RYR1 cDNA^4,5, transdução de fibroblastos de camundongos dispédicos com plasmídeos e vetores codificando para o WT e mutante RYR1 cDNA, seguido de transdução com mio-D e diferenciação em miotubes⁶ , geração de modelos animais transgênicos portadores de mutantes RyR1s^7,8,9, caracterização de células de pacientes que expressam a variante RYR1 endndogenously^10,11,12. Tais métodos ajudaram a estabelecer como diferentes mutações afetam funcionalmente o canal RyR1 Ca^2+.

Aqui, são descritos métodos desenvolvidos para avaliar os efeitos funcionais das mutações RYR1. Vários parâmetros de homeostase intracelular de cálcio são investigados em células humanas expressando endógenamente o canal de cálcio RyR1, incluindo myotubes e Epstein Barr Virus (EBV) linfócitos Imortais. As células são obtidas de pacientes, expandidas na cultura e carregadas com indicadores de cálcio fluorescentes ratiométricos, como Fura-2 ou indo-1. Parâmetros que foram relatados para serem alterados por causa de mutações patogênicas RYR1, incluindo o repouso [Ca^2+],a sensibilidade a diferentes agonistas farmacológicos e o tamanho das lojas intracelulares Ca²⁺ são medidos tanto no nível de célula única, usando microscopia de fluorescência, ou em populações de células usando um fluorímetro. Os resultados obtidos em células de portadores de mutação são então comparados aos obtidos de membros da família de controle saudável. Esta abordagem demonstrou que: (i) muitas mutações ligadas ao MHS levam a um aumento no repouso [Ca²⁺] e uma mudança para a esquerda na curva de resposta de dose para despolarização induzida por KCl ou ativação farmacológica RyR1 com 4-cloro-m-cresol^10,11,12,13; (ii) mutações ligadas ao CCD levam a uma diminuição no pico [Ca²⁺] liberado pela ativação farmacológica do RyR1 e diminuição do tamanho se o Ca²⁺ intracelular armazena^12,13,14,15; (iii) algumas variantes não impactam a homeostase Ca2+¹³. As vantagens dessa abordagem experimental são: a proteína RyR1 não é superfostinada e os níveis fisiológicos estão presentes, as células podem ser imortalizadas (tanto células musculares quanto linfócitos B) fornecendo linhas celulares contendo mutações. Algumas desvantagens dizem respeito ao fato de que os pacientes podem carregar mutações em mais de um gene codificando proteínas envolvidas na homeostase de cálcio e/ou acoplamento de contração de excitação (ECC) e isso pode complicar conclusões experimentais. Por exemplo, duas variantes JP-45 foram identificadas na população de CONTROLE e sua presença e sua presença foi demonstrada para impactar a sensibilidade do receptor de dihidropyridina (DHPR) à ativação¹⁶. Os pacientes precisam estar disponíveis, o material biológico precisa ser coletado recentemente e as licenças éticas precisam ser obtidas nos conselhos éticos locais.

Protocolo

Os protocolos descritos abaixo estão em conformidade com as diretrizes éticas da Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ.

1. Preparação de Epstein Barr imortalizada linhas celulares B-linfócitos¹¹

1. Após o consentimento informado, colete 30 mL de sangue inteiro em tubos estéreis tratados com EDTA a partir da banda proband portadora de uma mutação RYR1 e de familiares saudáveis sem mutação.
   NOTA: Mantenha todas as soluções estéreis e trabalhe em uma capa de cultura de tecidos.
2. Isole as células mononucleares do sangue inteiro por meio de centrifugação gradiente de densidade (por exemplo, Ficoll-Hypaque, 0,077 g/L).
   1. Coloque 30 mL de sangue estéril em um tubo estéril cônico de 50 mL.
   2. Coloque a ponta de uma pipeta Pasteur contendo a mídia de centrifugação de gradiente de densidade na parte inferior do tubo e a camada 20 mL estéril de solução de mídia de centrifugação de gradiente de densidade lentamente sob o sangue.
   3. Centrifugar por 30 min a 900 x g a 18°-20°C, sem quebra.
      NOTA: A camada de célula mononuclear aparece como um anel nublado na interfase entre a camada de mídia de centrifugação de gradiente de densidade e a camada superior contendo plasma enriquecido por plaquetas.
3. Com uma pipeta estéril, remova suavemente a camada interfárica contendo células mononucleares (aproximadamente 3-5 mL) e transfira a solução para um tubo cônico estéril limpo de 50 mL.
4. Adicione 20 mL de soro fisiológico tampão de fosfato (PBS) para enxaguar células, centrífuga por 10 min a 600 x g à temperatura ambiente e resuspensar a pelota em PBS. Repita por um total de três vezes; isso garante que todos os meios de comunicação sejam removidos.
5. Após a última lavagem, resuspend as células em 1-2 mL de meio de cultura tecidual (meio RPMI suplementado com soro de bezerro fetal de 10%, 2 mM L-glutamina e 100 unidades de penicilina e estreptomicina). Coloque as células mononucleares (aproximadamente 1 x 10⁶ células) em um frasco de cultura tecidual T125 contendo 20 mL de meio de cultura tecidual.
6. Infectar células mononucleares com o vírus Epstein-Barr.
   1. Use supernacantes de culturas de linha celular B95.8 (contendo 10²-10³ unidades transformadoras/mL estocadas a -80 °C) como fonte de EBV.
   2. Resuspend 1 x 10⁶ células mononucleares da etapa 1,5 em 20 mL de meio de cultura tecidual e expô-los a 2 mL de supernasce da linha celular B95.8 na presença de ciclosporina A (concentração final de 0,2 μg/mL) para infecção.
7. Coloque o frasco em uma incubadora de cultura celular de 37 °C e permita que as células cresçam. Depois de uma semana mude o meio de cultura.
   NOTA: Uma vez que as células B começam a proliferar, elas formam aglomerados reconhecíveis e crescem rapidamente para que as culturas possam ser expandidas e congeladas.
8. Extrair o DNA genômico das linhas celulares B-linfócitos B imortalizadas do EBV^para confirmar a presença ou ausência da mutação dada.

2. Medidas intracelulares ca²⁺

NOTA: Alterações na concentração intracelular de cálcio das linhas celulares B-linfócitos B transformadas em EBV podem ser monitoradas em populações celulares, com um espectrofluorômetro equipado com um agitador magnético e suporte de cuvette definido para 37 °C. Alternativamente, as alterações de Ca²⁺ podem ser monitoradas em células únicas por microscopia de fluorescência. Em ambos os casos as células são removidas do frasco de cultura tecidual, lavadas duas vezes com a solução de Krebs Ringer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 20 mM HEPES, 1 mM NaHPO₄, 5,5 mM de glicose, pH 7.4 contendo 1 mM CaCl₂) e contados .

1. Para experimentos em populações celulares usando um espectrofluorômetro^11,13,14
   1. Células resuspend em uma concentração final de 1 x 10⁷ células/ mL na solução de Krebs Ringer e incubar a 37°C por 30 min com uma concentração final de 5 μM Fura-2/AM.
   2. Centrífugas células a 900 x g por 10 min e resuspensá-las na solução de Krebs Ringer em uma concentração de 2 x 10⁶ células/mL.
   3. Meça as alterações de fluorescência (razão 340/380 nm) usando um espectrômetro equipado com um agitador magnético definido em velocidade máxima e definido para 37 °C.
   4. Pouco antes do experimento girar células a 900 x g por 5 min em um microcentrifuuge e rapidamente resuspensar a pelota em 1,5 mL da solução de Krebs Ringer com 0,5 mM EGTA, mas sem adição de Ca²⁺.
   5. Coloque as células em um 3 mL de espectrofluorômetro de vidro cuvette e registe a razão da fluorescência (excitação de 340 nm/380 nm, emissão de 510 nm).
   6. Obtenha uma linha de base estável (aproximadamente 30 segundos), adicione a concentração selecionada de agonista RyR1 (4-cloro-m-cresol, ou 4 cmc) e registe o transitório de cálcio.
      NOTA: Uma solução de estoque de 300 mM de 4 cmc feita em DMSO é usada como reagente inicial. Esta solução pode ser feita com antecedência, aliquoted e armazenada a -20 °C por vários meses.
   7. Realizar experimentos para diferentes concentrações de 4 cmc.
      NOTA: Inclua 75 μM, 150 μM, 300 μM, 450 μM, 600 μM, 750 μM a 1 mM para gerar uma curva de resposta de dose de agonista versus mudança em [Ca²⁺]. As diferentes concentrações de 4 cmc são obtidas adicionando o volume apropriado de 4 cmc da solução de estoque, diretamente no cuvette contendo as células carregadas Fura-2. Por exemplo, para uma concentração final de 300 μM 4 cmc, 1,5 μL da solução de estoque são adicionados ao cuvette contendo 1,5 mL de células na solução de Krebs Ringer. Para concentrações agonistas mais baixas, a solução de estoque de 300 mM deve ser diluída para 75 mM com DMSO e o volume apropriado adicionado ao cuvette contendo 1,5 mL de células na solução de Krebs Ringer.
   8. Adicione 400 nM thapsigargin às células para calcular a quantidade total de Ca²⁺ presente em lojas intracelulares. Regisso pico Ca²⁺.
   9. Plote o pico de cálcio induzido por uma dada concentração de 4 cmc versus o pico de cálcio induzido pela thapsigargin, que é considerado 100% e construa uma curva de resposta de dose de 4 cmc comparando células de um proband e parente saudável
2. Para experimentos em células únicas¹³
   1. Diluir a poli-L-lisina 1:10 no Estéril H₂O e pré-tratar as tampas de vidro por 30 minutos. Deixe secar sob uma capa de cultura de tecido estéril.
   2. Suspenda os linfócitos B transformados em EBV para uma concentração final de 1 x 10⁶ células/mL na solução de Krebs Ringer contendo 1 mM CaCl₂ e adicione uma concentração final de 5 μM Fura-2/AM.
   3. Coloque 1 mL de células nas tampas tratadas de poli-L-lisina e incubar a 37 °C em uma incubadora de cultura celular umidificada por 30 minutos para permitir que as células EBV grudem na tampa de vidro durante o carregamento.
   4. Coloque o deslizamento de cobertura na câmara de perfusão e inicie a perfusão (a uma taxa de 2 mL/min) com a solução de Krebs Ringer contendo 1 mM Ca²⁺.
   5. Use um microscópio fluorescente invertido (equipado com um objetivo de imersão em óleo de 40x (0,17 abertura numérica), filtros (BP 340/380, FT 425, BP 500/530) para registrar medições on-line, com um acessório de câmera de carga controlada por software (CCD).
   6. Adquira imagens em intervalos de 1 s a um tempo fixo de exposição (100 ms para comprimentos de onda de excitação de 340 e 380 nm. Use software de imagem para analisar mudanças na fluorescência. Meça o valor médio do pixel para cada célula em comprimentos de onda de excitação de 340 e 380 nm¹³.
   7. Para obter estimulação celular, use um estimulador de perfusão celular com 12 válvulas e adicione diferentes concentrações de 4 cmc. A válvula de descarga contém a solução de Krebs Ringer sem adição de Ca²⁺ mais 100 μM La³⁺ para monitorar a liberação de cálcio apenas de lojas intracelulares.
   8. Construa uma curva de resposta de dose de 4 cmc versus mudança em [Ca²⁺], conforme descrito acima.

3. Preparação de miotubes humanos a partir de biópsias musculares^10,12,15

NOTA: Diferentes métodos têm sido usados por diferentes laboratórios para obter myoblasts e miotubes derivados de células satélites. Abaixo está a descrição do método utilizado na Basileia.

1. Enxágüe a biópsia muscular com PBS estéril para remover o excesso de sangue e corte em pequenos fragmentos de cerca de 0,5-1 mm.
2. Prepare 6 pratos de cultura de tecido com inserção. Adicione 1,5 mL de médio de crescimento muscular humano a cada poço e 0,5 mL de meio de crescimento muscular humano a cada inserção.
   NOTA: O meio de crescimento é feito da seguinte forma: 500 mL do meio modificado da Águia de Dulbecco com alta glicose, ou DMEM (4,5 mg/mL), contendo 10% de soro de cavalo, 5 insulina ng/mL, glutamina de 3 mM, penicilina G de 600 ng/mL e estreptomicina, e 7 mM HEPES, pH 7.4. O meio de crescimento muscular esquelético disponível comercialmente também pode ser usado.
3. Coloque 2-3 pequenos fragmentos musculares em cada inserção(Figura 1A) e coloque pratos de cultura na incubadora de cultura celular (5% CO₂, 37 °C). Após aproximadamente 8-10 dias, as células satélites podem ser vistas crescendo fora e ao redor da biópsia muscular, anexada à inserção(Figuras 1,B e C, flechas).
4. Liberar um número suficiente de células da biópsia (após aproximadamente 10-14 dias), trypsinize da seguinte forma:
   1. Retire todo o meio de cultura, enxágue as células uma vez com 1 mL de PBS, adicione 0,5 mL de solução de trippsina/EDTA (0,025% trypsin e 0,01% EDTA) e incubar a 37 °C por 5 min.
   2. Adicione 1 mL de meio de crescimento às células para neutralizar o efeito da trippsina e transferir as células satélites para um novo frasco de cultura celular T25; adicionar 3 mL de meio de crescimento e colocar as células em uma incubadora de cultura celular (5% CO₂, 37 °C).
   3. Altere o meio de crescimento no dia seguinte para remover o EDTA e, posteriormente, mude o meio uma vez por semana.
5. Quando os myoblasts forem aproximadamente 75% confluentes, tente e transfira-os para a tampa de vidro tratada com laminina.
   NOTA: Como proporção, as células que crescem em um frasco T25 devem ser transferidas para uma tampa de vidro tratada com laminina de 43 mm de diâmetro. A mancha de tampa de vidro deve ser colocada dentro de uma placa de cultura de tecido de 60 mm de diâmetro contendo 3 mL de meio de crescimento.
6. Cultivar células no deslizamento de vidro em meio de crescimento em uma incubadora de cultura celular (5% CO₂, 37 °C) mudando o meio uma vez por semana. Com 90% de confluência, mudar para meio de diferenciação composta da seguinte forma: DMEM de alta glicose (4,5 mg/mL), 0,5% de albumina de soro bovino, 10 ng/mL fator de crescimento epidérmico, 0,15 mg/mL creatina, 5 ng/mL insulina, 200 mM glutamina, 600 ng/mL penicilina G e estreptomicina, e 7 mM HEPES, pH 7.4). O meio de diferenciação comercialmente disponível também pode ser utilizado. Mude o meio de diferenciação uma vez por semana.
7. Após 7-10 dias em meio de diferenciação, miótubos multinucleados são visíveis. Avalie as alterações em [Ca²⁺] dentro de uma semana, conforme descrito abaixo.

4. [Ca²⁺]_i medidas de razão determinadas com Fura-2

1. Tampas de vidro de cargalip miotubes cultivados com Fura-2/AM (concentração final de 5 μM) diluídos em DMEM por 30 min a 37 °C. Brevemente, remova o meio de diferenciação das células cultivadas do deslizamento de vidro e adicione um meio de diferenciação fresco de 2 mL. Adicione 10 μL de Fura-2 AM de uma solução de estoque de 1 mM e incubar 30 min em uma incubadora de cultura celular (5% CO₂, 37 °C).
2. Transfira a tampa de vidro para a câmara de perfusão e enxágue células com a solução de Krebs Ringer contendo 2 mM CaCl₂.
3. Realize medições on-line [Ca²⁺] conforme descrito acima na seção de célula única EBV com o uso de um objetivo FLUAR de imersão de água de 20x (abertura numérica de 0,17).

Resultados

[Ca²⁺]_i medições em populações de linfócitos B imortalizados pelo EBV
Linfócitos B primários expressam o isoform RyR1 que funciona como um canal de liberação ca²⁺ durante os processos de sinalização estimulados pelo receptor de antígeno celular B¹⁷. A imortalização de células B com EBV, procedimento rotineiramente utilizado por geneticistas para obter linhas celu...

Discussão

Os protocolos descritos neste artigo foram utilizados com sucesso por vários laboratórios para estudar o impacto das mutações RYR1 na homeostase do cálcio. As etapas críticas das abordagens descritas neste artigo tratam da esterilidade, habilidades e técnicas de cultivo celular e disponibilidade de material biológico. Em princípio, o uso de linfócitos B imortalizados pelo EBV é mais simples e permite gerar linhas celulares contendo canais mutantes RyR1. As células podem ser congeladas e armazenadas em nitrog?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-chloro-m-cresol	Fluka	24940
Blood collection tubes	Sarstedt	172202
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
caffeine	Merk	102584
Cascade 125+ CCD camera	Photometrics
Cascade 128+ CCD	Photometrics
Creatine	Sigma-Aldrich	C-3630
DMEM	ThermoFisher Scientific	11965092
DMSO	Sigma	41639
EGTA	Fluka	3778
Epidermal Growth Factor (EGF)	Sigma-Aldrich	E9644
Ficoll Paque	Cytiva	17144002
Foetal calf serum	ThermoFisher Scientific	26140079
Fura-2/AM	Invitrogen Life Sciences	F1201
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630049
Horse serum	Thermo Fisher Scientific	16050122
Insulin	ThermoFisher Scientific	A11382II
Ionomycin	Sigma	I0634
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
Laminin	ThermoFisher Scientific	23017015
Lanthanum	Fluka	61490
Microperfusion system	ALA-Scientific	DAD VM 12 valve manifold
Origin Software	OriginLab Corp	Software
Pennicillin/Streptomycin	Gibco Life Sciences	15140-122
Perfusion chamber POC-R	Pecon	000000-1116-079
poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P8920
RPMI	ThermoFisher Scientific	21875091
Spectrofluorimeter	Perkin Elmer	LS50
Thapsigargin	Calbiochem	586005
Tissue culture dishes	Falcon	353046
Tissue culture flask	Falcon	353107
Tissue culture inserts	Falcon	353090
Trypsin/EDTA solution	ThermoFisher Scientific	25300054
Visiview	Visitron Systems GmbH	Software
Zeiss Axiovert S100 TV microscope	Carl Zeiss AG
Zeiss glass coverslips	Carl Zeiss AG	0727-016