Inflação do ar dos pulmões murinos com fixação vascular de perfusão

Resumo

Apresentado é um método de inflação do ar com fixação vascular de perfusão dos pulmões que preserva a localização de células dentro das vias aéreas, alvéolos e interstícios para análises estrutura-função. A pressão constante das vias aéreas é mantida com uma câmara de inflação do ar, enquanto fixação é perfundida através do ventrículo direito. Pulmões são processados para estudos histológicos.

Resumo

A histologia pulmonar é frequentemente usada para investigar as contribuições fornecidas pelas células do espaço aéreo durante a homeostase pulmonar e a patogênese da doença. No entanto, métodos de fixação comumente usados baseados em instillação podem deslocar células do espaço aéreo e muco para vias aéreas terminais e podem alterar a morfologia tecidual. Em comparação, as técnicas vasculares de fixação da perfusão são superiores na preservação da localização e morfologia das células dentro dos espaços aéreos e do revestimento mucosal. No entanto, se a pressão positiva das vias aéreas não for aplicada simultaneamente, regiões dos pulmões podem entrar em colapso e capilares podem se aprofundar nos espaços alveolares, levando à distorção da anatomia pulmonar. Aqui, descrevemos um método barato para a inflação do ar durante a fixação da perfusão vascular para preservar a morfologia e localização das vias aéreas e células alveolares e interstício em pulmões murinos para estudos histológicos a jusante. A pressão de ar constante é entregue aos pulmões através da traqueia de uma câmara selada e cheia de ar que mantém a pressão através de uma coluna líquida ajustável enquanto fixação é perfundida através do ventrículo direito.

Introdução

A histologia pulmonar representa o padrão ouro para avaliar a arquitetura pulmonar durante a saúde e a doença e é uma das ferramentas mais utilizadas pelos pesquisadores pulmonares¹. Um dos aspectos mais críticos dessa técnica é o isolamento e preservação adequados do tecido pulmonar, uma vez que a variabilidade nesta etapa pode levar à má qualidade do tecido e resultados errôneos^1,2,3. Em animais vivos, o volume pulmonar é determinado pelo equilíbrio entre o recuo elástico interno do pulmão e as forças externas transmitidas da parede torácica e do diafragma pela tensão superficial. Assim, quando o tórax é introduzido, forças externas são perdidas e o pulmão entra em colapso. Seções histólógicas preparadas a partir de pulmões colapsados têm uma aparência lotada e as fronteiras entre compartimentos anatômicos (ou seja, espaços aéreos, vasculatura e interstício) podem ser difíceis de distinguir. Para contornar esse desafio, os pesquisadores frequentemente inflam os pulmões durante a fixação química para que o tamanho e a arquitetura do espaço aéreo seja mantido.

Os pulmões podem ser inflados com ar ou líquido. A pressão necessária para inflar os pulmões ao mesmo volume difere entre a inflação do ar e do líquido devido às forças intermoleculares na interface ar-líquido. Maior pressão (por exemplo, 25 cmH₂O) é necessária durante a inflação do ar do que a inflação líquida (por exemplo, 12 cmH₂O) para superar a tensão superficial e abrir o alvéolo colapsado⁴. Uma vez recrutados alvéolos, uma pressão mais baixa pode manter os alvéolos abertos ao mesmo volume que os platôs da curva de volume de pressão, e as pressões se igualam em todo o pulmão de acordo com a lei de Pascal^4,5,6,7,8.

Existem dois métodos principais de inflação e fixação pulmonar para preservar os pulmões murinos para a histologia. Mais comumente, os espaços aéreos são instilados com líquido - muitas vezes contendo um fixador. A principal vantagem dessa abordagem é que ela é relativamente fácil e requer pouco treinamento. Embora a instilação intratraqueal de fixação possa ser preferida em estudos que se concentram na vasculatura, o líquido que é incutido através da traqueia tende a empurrar células proximais das vias aéreas e mucinas para regiões mais distais do espaço aéreo, enquanto a inflação do ar não^{1,3,4,9,10,11}. Além disso, o desprendimento inadvertido de leucócitos do epitélio durante a inflação líquida altera sua morfologia, dando-lhes artefatosamente uma aparência simples e arredondada^4,10,11,12. Finalmente, a inflação dos pulmões com líquido pode comprimir involuntariamente o interstício^4,10,11. Juntos, esses fatores podem distorcer a anatomia normal e as distribuições celulares dentro dos pulmões preservados, limitando assim a técnica.

Um método alternativo de preservação do tecido é a fixação vascular da perfusão. Neste método, fixação é perfundida na vasculatura pulmonar através da veia cava ou do ventrículo direito. Este método preserva a localização e morfologia das células no lúmen do espaço aéreo. No entanto, a menos que os pulmões sejam inflados durante a fixação da perfusão, é provável que o tecido pulmonar entre em colapso.

A inflação do ar com fixação vascular de perfusão aproveita os pontos fortes de cada uma das técnicas de fixação acima. Aqui fornecemos um protocolo para esta técnica. Os materiais e equipamentos que são necessários são relativamente baratos e podem ser facilmente obtidos e montados. A configuração completa, mostrada na Figura 1A,fornece pressão constante das vias aéreas para os pulmões por meio de uma coluna ajustável e cheia de fluidos, enquanto uma bomba peristáltica fornece fixação através do ventrículo direito. Pulmões com morfologia preservada podem então ser processados para análises estruturais-função.

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Protocolo

Todos os métodos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Saúde Nacional Judaica.

NOTA: O protocolo é organizado em três componentes. O primeiro componente detalha a construção da inflação do ar com equipamento de perfusão/fixação. Uma segunda seção descreve como configurar o equipamento para um experimento. A seção final descreve como preparar o animal e realizar o experimento.

1. Construção do aparelho da coluna de água (Figura 1B)

1. Remova o êmbolo de uma seringa de ponta de deslizamento de 60 mL.
2. Conecte fita ao redor da seringa na marca de 30 mL. Ajuste a altura da seringa para esta marca para a pressão inicial de inflação de 25 cmH₂O. É também aqui que o nível de água na coluna deve estar durante todo o procedimento. Rotule a fita como "25 cm" (como retratado na Figura 1A) ou "inflação".
   NOTA: Uma pressão de inflação de 25 cmH₂O é usada para garantir o recrutamento de espaços aéreos colapsados. Uma vez recrutados alvéolos, a pressão é reduzida para 20 cmH₂O para garantir que os espaços aéreos não sejam distendidos.
3. Meça 5 cm da fita em direção à extremidade do êmbolo e conecte outro pedaço de fita à seringa. Mova a seringa para baixo para esta marca para reduzir a pressão de inflação para 20 cmH₂O durante a fixação. Rotule a fita como "20 cm" (como retratado na Figura 1A) ou "fixação".
4. Conecte 180 cloreto de polivinil (PVC) na extremidade da ponta de deslizamento da seringa. O comprimento da tubulação depende da distância entre a câmara de inflação da seringa e do ar (aproximadamente 25-30 cm).
5. Coloque uma camiseta estilo luer (2) masculino (1,219 polegadas de comprimento, 0,904 polegadas de altura, 0,0904 polegadas de diâmetro interno) na outra extremidade da tubulação. Este Luer macho se conectará à torneira da câmara de inflação do ar (Passo 2.4).

2. Construção da câmara de inflação do ar(Figura 1C)

1. Faça dois furos (aproximadamente 4 mm de diâmetro) em um recipiente plástico de 500 mL com uma tampa de parafuso. Os orifícios devem ser do mesmo tamanho da fêmea Luers (1.224 polegadas de comprimento, 0,312 polegadas de altura, 0,098 polegadas de diâmetro interno).
   NOTA: Podem ser utilizados recipientes vazios ou tampões para a câmara de inflação do ar.
2. Cubra fios de luers fêmeas com fabricante de junta de silicone e coloque o lado menor nos orifícios pré-perfurados do recipiente.
3. Adicione a gasete de silicone ao redor das luers fêmeas onde elas entram no recipiente para garantir uma vedação apertada a ar.
4. Dane-se uma torneira de mão única na luer feminina inferior na câmara de inflação do ar.
5. Corte a tubulação ao comprimento de aproximadamente 25 cm e conecte Luers masculinos às extremidades livres da tubulação. Ligue o Luer macho em uma extremidade da tubulação à luer fêmea livre na câmara de inflação do ar. O outro Luer macho se conectará ao recipiente de processamento de animais.

3. Construção do recipiente de processamento de animais (Figura 1D)

1. Faça um furo (aproximadamente 4 mm de diâmetro) na lateral de um grande recipiente plástico. O buraco deve ser o diâmetro da fêmea Luer. O recipiente de plástico é necessário para pegar a solução de fixação em excesso.
   NOTA: Foi utilizado um recipiente de armazenamento plástico de 30 cm x 22 cm e 3,8 L.
2. Cubra os fios de uma Luer fêmea com uma máquina de vareir de silicone e coloque o lado menor no orifício predrilled do recipiente.
3. Adicione a máquina de junta de silicone ao redor da Luer fêmea onde ela entra e sai do recipiente para garantir uma vedação apertada a ar.
4. Dane-se uma torneira de mão única na luer fêmea. A tubulação da câmara de inflação do ar vai anexar a esta torneira.

4. Preparação de soluções

1. Solução heparina
   1. Encha um recipiente com PBS e heparina sem cálcio (20 U/mL). Prepare um total de 10 mL solução de heparina para cada mouse. A heparina é um anticoagulante que impede a formação de coágulos sanguíneos nos vasos durante a fixação da perfusão. A solução de heparina será usada para retirar sangue dos pulmões antes da fixação da perfusão.
2. Solução fixa
   ATENÇÃO: Os fixativos podem apresentar um risco à saúde e devem ser usados em uma coifa química. Todos os aparelhos são montados em uma capa de fumaça química para evitar a inalação de fixativos.
   1. Encha um recipiente com PBS sem cálcio e paraformaldeído (concentração final de 4%). Prepare um total de 50 mL de solução fixativa para cada mouse.
      NOTA: O tipo de fixação utilizada pode variar e dependerá de estudos histológicos a jusante.

5.   Preparação de aparelhos de perfusão

NOTA: Uma bomba peristáltica é sugerida para a entrega de fluidos na vasculatura para garantir a taxa de fluxo constante. As seguintes instruções são para configurar a bomba peristáltica e podem ser diferentes para cada modelo. Alternativamente, se uma bomba peristáltica não estiver disponível, um segundo aparelho de coluna de água pode ser construído para perfuse fluidos a partir de uma altura de 35 cm H₂O.

1. Primeiro coloque a tubulação ao redor da montagem do rolo.
2. Fixar a tubulação nos postes entalhados.
3. Coloque as alavancas no lugar colocando primeiro a alavanca esquerda ao redor da tubulação e fixando-a no lugar com a parte superior e, em seguida, a alavanca direita.
4. Coloque a extremidade proximal da tubulação na solução de heparina e a extremidade distal no recipiente de processamento animal.
5. Solução de heparina pré-carga na tubulação, executando a bomba para expulsar o ar da tubulação.
6. Fixar uma agulha 25G x 5/8" na extremidade do lado esquerdo da tubulação.

6. Preparação de aparelhos de inflação do ar

1. Coloque a seringa para a coluna de água em um suporte de anel.
2. Meça uma altura vertical de 25 cm da plataforma animal até a marca da fita "25 cm" (Passo 1.2) na coluna de água.
3. Coloque a extremidade do tubo da coluna de água na torneira da câmara de ar.
4. Conecte um tubo da luer fêmea da câmara de ar à torneira do recipiente de processamento de animais.
   NOTA: Se a câmara de inflação do ar for construída como retratada na Figura 1C,a fixação da tubulação em ordem inversa pode causar o vazamento de água no tubo que se conecta à cânula traqueal.
5. Certifique-se de que a tampa da câmara de ar está bem fechada.
6. Certifique-se de que a torneira do lado de fora do recipiente de processamento de animais está fechada e a torneira na tubulação que leva da coluna de água para a câmara de inflação do ar está aberta.
7. Encha a seringa com água até a marca "25 cm". A água deixará a seringa através da tubulação para a câmara de ar. Uma vez que a pressão é igualada, a água vai parar de fluir.
   1. É possível que a água vaze lentamente para a câmara de inflação do ar à medida que a pressão do ar ambiente dentro da capô química flutua. Fique de olho no nível da água dentro da seringa e adicione mais, se necessário. Mantenha o nível da água na marca "25 cm" durante todo o procedimento.
      NOTA: Normalmente, os níveis de água permanecerão consistentes para a primeira parte da inflação do ar a 25 cmH₂O; no entanto, mais água provavelmente precisará ser adicionada à seringa durante a fixação. Se a água não parar de fluir, é provável que exista um vazamento de ar dentro da câmara de inflação do ar. Mais fabricante de junta de silicone pode precisar ser aplicado ao redor dos Luers para evitar vazamentos de ar.

7. Preparação de animais (Figura 2)

NOTA: Este procedimento foi modificado a partir de Gage et al¹³. Concluímos este procedimento em camundongos adultos do sexo masculino e feminino de idades variadas e notamos que não há viés de idade ou sexo.

1. Eutanize o animal com pentobarbital de sódio (150 mg/kg, intraperitoneally.). Certifique-se de que o animal está morto antes de iniciar a dissecação.
   NOTA: Enquanto este procedimento é realizado em animais eutanizados, este procedimento pode ser realizado em animais vivos para utilizar o coração para bombear perfusados em todo o animal.
2. Faça duas incisões laterais através da parede abdominal. Faça a primeira incisão abaixo da caixa torácica e a segunda acima dos quadris. Corte ao longo da linha média da incisão inferior em direção à incisão superior.
3. Usando uma tesoura sem corte, faça cuidadosamente uma incisão no lado lateral do diafragma. Os pulmões devem entrar em colapso assim que o diafragma for perfurado.
   NOTA: Deve-se tomar cuidado para evitar perfurar os pulmões. Um pulmão perfurado é menos provável de inflar durante etapas posteriores.
4. Corte transversalmente ao longo do diafragma para abrir a cavidade torácica.
5. Corte superiormente ao longo do esterno do processo xifoide até o entalhe jugular e lateralmente acima da caixa torácica para expor totalmente o coração e os pulmões. Fixar os lados da caixa torácica.
6. Faça uma incisão no pescoço acima da traqueia. Remova pele, músculo, glândula tireoide e tecido conjuntivo ao redor da traqueia.
7. Usando fórceps curvas, deslize dois pedaços de rosca ou sutura sob a traqueia posterior. Use um pedaço de sutura para manter o adaptador Luer-stub inflacionário no lugar, e use o outro em última análise para amarrar a traqueia na conclusão da inflação do ar e fixação vascular da perfusão.
8. Faça um pequeno buraco na traqueia usando uma agulha de 18G x 1" ou uma tesoura de mola Vannas.
9. Coloque um adaptador Luer-stub de 20G neste orifício na traqueia.
10. Amarre um fio ao redor da traqueia imediatamente distal para onde o adaptador Luer-stub entra para mantê-lo no lugar.
11. Transfira o animal para o recipiente de processamento de animais.
12. Conecte o adaptador Luer-stub à luer fêmea no interior do recipiente de processamento animal.

8. Inflação do ar, perfusão e fixação dos pulmões(Figura 2)

1. Coloque a agulha de 25G x 5/8" presa ao tubo do aparelho de perfusão no ventrículo direito do coração.
2. Corte a aorta abdominal para permitir que o sangue escorra do coração e promova o fluxo de perfusato através dos pulmões.
3. Abra a torneira do lado de fora do recipiente de processamento de animais para inflar os pulmões.
   NOTA: Pode levar tempo para os pulmões inflarem completamente. Observe o nível de água na seringa, não deve diminuir rapidamente a menos que haja um vazamento nos pulmões.
4. Infle os pulmões a 25 cmH₂O por 5 minutos. Inflação a 25 cmH₂O pré-condiciona o pulmão e auxilia no recrutamento de regiões pulmonares atelétricas.
   NOTA: Uma pequena quantidade de água pode precisar ser adicionada à seringa para manter a altura de 25 cm. Inflamação e/ou lesão pulmonar induzida experimentalmente pode influenciar a inflação dos pulmões. Neste caso, pode ser necessário aumentar a pressão de inflação até um máximo de 35 cmH₂O para auxiliar no recrutamento de regiões ateleticas.
5. Durante o último minuto da inflação pulmonar, ligue a bomba peristáltica para uma vazão de 10 mL/min. A solução de heparina deve fluir da garrafa através da tubulação para o animal.
   1. O objetivo da infusão de heparina é evitar a formação de trombos nos vasos. Assim, infundir heparina até que os pulmões fiquem brancos e sejam desprovidos de sangue. Se os pulmões não ficarem brancos, pode ser necessário o ajuste da agulha ventricular direita.
6. Depois de inflar por 5 minutos, desligue a bomba peristáltica e troque a tubulação de perfusão da solução de heparina para a fixação.
7. Abaixe a seringa da coluna de água para a marca "20 cm" (Passo 1.3). É normal que as bolhas de ar se movam dentro da coluna de água à medida que a pressão muda de 25 para 20 cmH₂O.
   1. Verifique o nível da água na seringa. Deve estar na marca "25 cm". Pode ser necessário adicionar mais neste momento.
8. Aguarde 1 min para permitir que os pulmões desinflarem de 25 a 20 cmH₂O.
9. Reinicie a bomba de perfusão a uma vazão de 6,5 mL/min.
10. Correção vascular por perfusão vascular por 10 a 15 minutos.

9. Extração de pulmões (Figura 3)

1. Amarre firmemente o segundo pedaço de rosca ao redor da traqueia distal ao adaptador Luer-stub. Remova o adaptador Luer-stub da traqueia.
2. Remova a agulha do coração.
3. Liberte os pulmões e o coração da cavidade torácica cortando o tecido conjuntivo posterior ao mediastino com uma tesoura cega. Tome cuidado para evitar perfurar os pulmões.
4. Remova cuidadosamente o coração dos pulmões.
5. Coloque os pulmões em fixação durante a noite.
   NOTA: A duração da variação fixa depende de estudos histológicos a jusante.
   1. Coloque os pulmões em um tubo cônico de 50 mL contendo 20-25 mL de fixação. Coloque a rosca que protege a traqueia através da abertura do tubo cônico e fixe pelos fios da tampa. Inverta o tubo cônico para garantir que os pulmões flutuantes inflados pelo ar permaneçam totalmente submersos em fixação, caso contrário, flutuarão até o topo do líquido.
6. Processe os pulmões para estudos histológicos.

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Resultados

Em um tórax intacto, os pulmões são mantidos abertos por forças externas aplicadas pela parede do peito através do espaço pleural^6,14. Quando o diafragma é introduzido durante a dissecção, a integridade do espaço pleural é abolida e os pulmões devem entrar em colapso(Figura 2A, 2B). Para rees expander os pulmões, a inflação do ar é realizada. Como primeiro passo, 25 cm de pressão da água são aplica...

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Discussão

Embora comumente usados, métodos de fixação baseados em intratraqueal deslocam leucócitos das vias aéreas e podem alterar a arquitetura pulmonar normal. O método de inflação do ar com fixação vascular de perfusão que é fornecido neste protocolo supera essas armadilhas e preserva com mais precisão a anatomia pulmonar. As chaves para obter tecido de alta qualidade a partir do método de fixação vascular da perfusão incluem o monitoramento cuidadoso das pressões da inflação do ar, evitar vazamentos de ar ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer	Cole-Parmer	Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF	Stopcock
BD 60 mL syringe, slip tip	BD	309654	Syringe used to construct the water column
BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8	BD Biosciences	305122	Needle for vascular perfusion/fixation
Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer	Nordson Medical	FTLLBMLRL-1	Female Luer
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3393	Heparin solution.
Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge	BD Biosciences	427564	Luer-Stub Adapter
Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee	Nordson Medical	LT787-9	Male Luer
Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing	ThermoFisher Scientific	8000-9020	Tubing
Paraformaldehyde Aqueous Solution - 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline
Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker	Permatex	81724	Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers
Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium	Corning	21-040-CV	Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions
Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container	Sterilite	0342	Animal processing container