In Vitro 3D Cell-Cultured Modelos arteriais para estudar a segmentação de drogas vasculares sob fluxo

Resumo

Aqui, apresentamos um novo protocolo para estudar e mapear a deposição direcionada dos portadores de drogas para células endoteliais em modelos de artéria humanas fabricadas, de tamanho real, tridimensionais sob fluxo fisiológico. O método apresentado pode servir como uma nova plataforma para o direcionamento de portadores de drogas dentro do sistema vascular.

Resumo

O uso de modelos tridimensionais (3D) de artérias humanas, que são projetados com as dimensões corretas e anatomia, permite a modelagem adequada de vários processos importantes no sistema cardiovascular. Recentemente, embora vários estudos biológicos tenham sido realizados utilizando tais modelos 3D de artérias humanas, eles não foram aplicados para estudar o direcionamento vascular. Este artigo apresenta um novo método para fabricar modelos arteriais humanos reconstruídos de tamanho real usando uma técnica de impressão 3D, forra-los com células endoteliais humanas (CE) e estudar partículas direcionadas sob fluxo fisiológico. Esses modelos têm a vantagem de replicar o tamanho fisiológico e as condições dos vasos sanguíneos no corpo humano usando componentes de baixo custo. Esta técnica pode servir como uma nova plataforma para estudar e entender a segmentação de medicamentos no sistema cardiovascular e pode melhorar o design de novas nanomedicinas injetáveis. Além disso, a abordagem apresentada pode fornecer ferramentas significativas para o estudo da entrega direcionada de diferentes agentes para doenças cardiovasculares sob fluxo específico do paciente e condições fisiológicas.

Introdução

Várias abordagens foram recentemente aplicadas utilizando modelos 3D de artérias humanas^1,2,3,4,5. Esses modelos replicam a anatomia fisiológica e o ambiente de diferentes artérias do corpo humano in vitro. No entanto, eles têm sido usados principalmente em estudos de biologia celular. Estudos atuais sobre direcionamento vascular de partículas para o endotélio incluem em simulações computacionais silico ^6,7,8, modelos microfluidos in vitro ^9,10,11, e in vivo modelos animais¹². Apesar dos insights que eles forneceram, esses modelos experimentais falharam em simular com precisão o processo de segmentação que ocorre nas artérias humanas, onde o fluxo sanguíneo e a hemodinâmica constituem fatores dominantes. Por exemplo, o estudo de partículas direcionadas a regiões ateroscleróticas na bifurcação da artéria carótida, conhecida por seu complexo padrão de fluxo de recirculação e gradiente de estresse de cisalhamento de parede, pode impactar a viagem tomada pelas partículas antes de atingirem o endotélio^13,14,15,16. Portanto, esses estudos devem ser realizados em condições que replicam o ambiente fisiológico, ou seja,tamanho, dimensão, anatomia e perfil de fluxo.

Recentemente, este grupo de pesquisa fabricou modelos arteriais humanos reconstruídos em 3D para estudar a deposição e direcionamento de partículas para a vasculatura¹⁷. Os modelos foram baseados em réplicas geométricas 3D de vasos sanguíneos humanos, que foram então cultivadas com CEs humanos que posteriormente forraram suas paredes internas. Além disso, quando submetidos a um sistema de perfusão que produz fluxo fisiológico, os modelos replicaram com precisão as condições fisiológicas. O sistema de perfusão foi projetado para perfumar fluidos a uma taxa de fluxo constante, utilizando uma bomba peristáltica em configurações de circuito fechado e aberto(Figura 1). O sistema pode ser usado como um circuito fechado para mapear a deposição de partículas e direcionar para as células semeadas dentro do modelo carótida. Além disso, pode ser usado como um circuito aberto para lavar partículas não aderentes no final dos experimentos e para limpar e manter o sistema. Este artigo apresenta protocolos para a fabricação de modelos 3D da bifurcação carótida humana, design do sistema de perfusão e mapeamento da deposição de partículas-alvo dentro dos modelos.

Protocolo

NOTA: Este protocolo descreve a fabricação de um modelo 3D da artéria carótida e pode ser aplicado para gerar qualquer outra artéria de interesse simplesmente modificando os parâmetros geométricos.

1. Design e fabricação de uma bifurcação 3D do modelo de artéria carótida humana

1. Escolha imagens de pacientes ou geometrias previamente estudadas da bifurcação da artéria carótida humana e crie um modelo de design auxiliado por computador do molde que precisa ser impresso.
   NOTA: A bifurcação da artéria carótida tem uma entrada e duas tomadas. É importante projetar uma moldura de molde 3D ao redor da artéria e suportes temporários de impressão entre a estrutura e o molde da artéria(Figura 2A-C).
2. Imprima as geometrias usando uma impressora 3D. Corte os suportes temporários de impressão e use lixa para polir e suavizar os moldes, especialmente nas áreas onde os suportes foram cortados. Enxágüe o modelo lixado com álcool isopropílico para remover o pó plástico e deixe secar completamente em uma capa química por 2-3 h.
   NOTA: Aqui, os moldes impressos foram feitos de resina clara v4 (Figura 2D,E).
3. Para dissolver facilmente o plástico, pulverize os moldes com laca transparente dentro de uma capa química e deixe secar ao ar por 1h. Repita este 3x.
   NOTA: Aqui, foi usado spray claro 2X ultra cover, mas qualquer outro tipo deve ser adequado desde que não seja laca de madeira. Confirme se não há plástico exposto porque o plástico pode reagir com o silicone e evitar que ele se solidifique corretamente. A qualidade da superfície pulverizada determinará a qualidade da superfície do modelo final de silicone.
4. Corte slides/tiras retangulares transparentes de plástico liso das mesmas dimensões do quadro de moldes, e cole-os usando a laca para o quadro em todos os lados e de um lado da moldura, de tal forma que ela será selada na parte inferior e aberta na parte superior. Aplique a laca usando uma escova de tinta dentro de uma capa química, e deixe que os slides sequem completamente por pelo menos 24 h(Figura 2F).
5. Para preparar a mistura de borracha de silicone, adicione silicone líquido com seu agente de cura (proporção de massa 1:10) em uma placa de plástico e mexa bem para garantir a mistura completa. Para o modelo carótida, adicione 54 g do silicone e 6 g de seu agente de cura.
6. Esfrie a mistura por 15 min a 4 °C, depois desgas-la em um desiccador a vácuo até que todas as bolhas de ar tenham sido eliminadas. Coloque o molde no desiccator (com o lado aberto virado para cima), despeje lentamente a mistura de silicone no molde e remova novamente as bolhas de ar até que a mistura esteja clara.
7. Deixe o molde ficar com o silicone durante a noite à temperatura ambiente (se possível, deixe-o no desiccator sem vácuo). Se a mistura não tiver secado totalmente, incuba-a a 60 °C por mais algumas horas.
8. Uma vez que a mistura esteja totalmente seca, remova os slides transparentes e mergulhe o modelo em acetona absoluta por 48 h em uma capa química até que o plástico esteja totalmente dissolvido. Remova as sobras de plástico com uma vara de madeira. Para evaporar a acetona presa dentro do modelo, incuba-a a 60 °C por pelo menos 4 dias antes da semeadura celular.

2. Cultura celular e semeadura em modelos

1. Prepare três conectores para o modelo carótida: um para a entrada e dois para as tomadas (ver Tabela de Materiais). Esterilize o modelo e os conectores por irradiação ultravioleta em uma capa biológica por 20 minutos.
2. Cubra os modelos com 4 mL de fibronectina de 100 μg/mL (em salina tamponada de fosfato de 1x, (PBS)) por 2 h a 37 °C ou durante a noite a 4 °C. Injete a solução de fibronectina no modelo através da entrada usando uma seringa de plástico de 5 ou 10 mL. Remova a fibronectina através da tomada e lave o modelo com meio CE.
3. Suspender 2,5 × 10⁶ células/mL células endoteliais de veias umbilicais humanas (HUVECs, passagem < 6), e encher o modelo com 4 mL de suspensão celular utilizando uma seringa plástica de 5 ou 10 mL(Figura 3A). Coloque o modelo em uma rotadora dentro de uma incubadora (37 °C) a uma velocidade de 1 rpm por 48 h para garantir a semeadura homogênea. Certifique-se de que o modelo está bem conectado ao rotador(Figura 3B). Troque o meio após 24h dentro de uma capa biológica, e retorne à rotadora dentro da incubadora por mais 24h.
   NOTA: Após 24 horas, as células são semeadas e podem ser imagens usando um microscópio.
4. Retire o modelo do rotador e lave com 1x PBS usando uma seringa de plástico de 10 mL. Para fixar as células, incubar as células com 4 mL de 4% de paraformaldeído (PFA) ao modelo por 15 minutos dentro de uma capa química e, em seguida, enxaguar 3x com PBS. Adicione 4 mL de PBS e armazene a 4 °C até o experimento(Figura 3C). Manche as células dentro do modelo usando protocolos de coloração padrão (por exemplo, coloração nuclear com 4′,6-diamidino-2-fenilômado (DAPI), Figura 3D).

3. Projeto do sistema de perfusão

1. O sistema de perfusão tem duas entradas e dois tubos de saída. Mescle as duas entradas em um único tubo de ID de 4 mm e novamente em dois tubos de ID de 6 mm, que se conectam à bomba peristáltica. Mescle os dois tubos de ID de 6 mm que saem da bomba peristáltica em um único tubo de 4 mm e conecte-o a um amortecedor de oscilação para eliminar quaisquer oscilações da bomba. Use uma garrafa de boca estreita de 250 mL com uma tampa de três orifícios como amortecedor.
2. Conecte um orifício à entrada da bomba, feche o segundo com uma rolha que é usada para ventilação de pressão em emergências e estenda o terceiro orifício (que é a saída) até a parte inferior da garrafa.
3. Conecte o amortecedor à entrada do modelo carótida cultivado usando o tubo de saída. Mescle as duas tomadas do modelo a uma tubulação, que será a saída do sistema (Todas as tubulações são de 4 mm de ID).
4. Divida a tubulação de saída em dois tubos de saída (um para o circuito fechado e outro para o recipiente de resíduos no circuito aberto). Coloque um grampo plástico em cada tubo.
   NOTA: A combinação de grampos abertos/fechados determinará se o sistema está em uma configuração de circuito fechado ou aberto. Como mostrado na Figura 1, se os grampos a e d estiverem próximos enquanto b e c estiverem abertos, o sistema é um circuito fechado; o inverso traz o sistema para a configuração do circuito aberto.
5. Prepare três recipientes: um que pode conter fluido de 300 mL (para circuito fechado) e outros dois de 1 L cada: um para lavagem e outro para resíduos (para circuito aberto).

4. Configuração de circuito fechado: experimento de perfusão e imagem

1. Adicione 300 mL de PBS ao contêiner de circuito fechado, o que é suficiente para encher todo o sistema, incluindo o tubo e o modelo. Coloque um tubo de entrada e um tubo de saída (grampos abertos b e c) dentro do recipiente.
2. Encha o recipiente de lavagem 1 L com água destilada (para lavar no final do experimento), e deixe o outro recipiente de resíduos de 1 L vazio. Coloque a outra tubulação de entrada e saída (grampos de fechamento a e d) nos recipientes de lavagem e resíduos, respectivamente.
3. Tire o modelo carótida cultivado por célula fixa do armazenamento de 4 °C e esvazie o PBS. Conecte a entrada e as tomadas da carótida conforme descrito nas etapas 3.3-3.4. Não deixe o modelo seco por muito tempo. Uma vez que o modelo esteja conectado, ative a bomba para perfundir o fluido.
4. Coloque o modelo carótida sob o microscópio. Abra a tubulação antes da entrada e depois da saída do modelo carótida. Coloque a bomba peristáltica a 10 rpm e ligue-a. Aumente a velocidade em incrementos de 5 rpm, a cada 4-5 min. Certifique-se de que não há vazamentos.
5. A 100 rpm, o que equivale à taxa de fluxo máximo da forma de onda fisiológica da artéria carótida humana (~400 mL/min), adicione partículas fluorescentes de poliestireno carboxil (PS) (2 μm, a uma concentração de 1,6 μg/mL) aos 300 mL de PBS no contêiner de circuito fechado. Imagem da região de interesse a cada 10 s por 1,5 h (imagens ou vídeos ainda únicos conforme necessário).

5. Configuração de circuito aberto: a etapa de lavagem

1. Abra os grampos dos tubos de lavagem e resíduos nos recipientes de 1 L (grampos a e d), e feche imediatamente os grampos dos tubos de entrada e saída no recipiente de 300 mL (grampos b e c) para alterar o sistema de uma configuração de circuito fechado para aberto.
2. Deixe a maior parte da água fluir do recipiente de lavagem para o recipiente de resíduos a 100 rpm. Antes de ser completamente transferido, pressione parar na bomba peristáltica e feche os grampos do tubo antes da entrada e após a saída do modelo carótida.
3. Utilizando os filtros apropriados, capture imagens do modelo na região de interesse para mostrar a deposição e a adesão de partículas às células. Desconecte o modelo carótida. Adicione cuidadosamente e lentamente 4 mL de PBS com uma seringa de 10 mL através da entrada do modelo.
4. Conecte um "modelo manequim", (que também é um modelo carótida de borracha de silicone 3D usado apenas para lavar, sem células cultivadas) em vez do modelo carótida, e enxágue o sistema. Adicione mais 1 L de água e lave o sistema novamente até que toda a água seja transferida do recipiente de lavagem para o lixo. Desligue a bomba peristáltica.

6. Aquisição e análise de dados

1. Adquira um filme digital de depoimento de partículas na região de interesse com as imagens tiradas durante o experimento, utilizando um código de software personalizado (ver a Tabela de Materiais).
2. Para o mapeamento da deposição das partículas ao longo do modelo, ladrilhos múltiplas imagens para cobrir a região de interesse examinada (Figura 4A,B).
   NOTA: Um código de software personalizado pode ser escrito para quantificar o número de partículas aderidas em um local de interesse (um arquivo de amostra foi fornecido como Informações Suplementares)¹⁷.

Resultados

Este artigo apresenta um novo protocolo para mapear a deposição de partículas dentro de modelos de artéria humana 3D de tamanho real, que podem fornecer uma nova plataforma para pesquisa de entrega de medicamentos. Utilizando uma técnica de impressão 3D, foi fabricado um modelo da artéria de bifurcação carótida humana(Figura 2). O modelo era feito de borracha de silicone e semeado com CEs humanos (Figura 3). É importante ressaltar que este protocolo p...

Discussão

As abordagens atuais para estudar o direcionamento vascular de partículas ficam aquém na replicação das condições fisiológicas presentes no corpo humano. Apresentado aqui é um protocolo para fabricar modelos reconstruídos em 3D de artérias humanas para estudar partículas direcionadas às CES que revestem a artéria sob fluxo fisiológico aplicado usando um sistema de perfusão personalizado. Ao escolher o material para impressão 3D, é melhor usar um plástico transparente para evitar a transferência de pigm...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	FormLabs	PKG-F2-REFURB
Acetone, absolute (AR grade)
Connectors	Nordson Medical	FTLL013-1	Female Luer
		FTLL230-1	Female Luer
		FTLL360-1	Female Luer
		LP4-1	Male Luer Integral Lock
Damper	Thermo-Fisher Scientific	DS2127-0250	Nalgene Polycarbonate, Validation Bottle
Damper Cover	Thermo-Fisher Scientific	2162-0531	Nalgene Filling/Venting Closures
Elastosil Elastosil RT 601 A	Wacker	60003805
Elastosil RT 601 B	Wacker	60003817	The crosslinker
Endothelial Cell Media	ScienCell	1001
Fibrontectin	Sigma Aldrich	F0895-5mg
HUVEC	Lonza	CC-2519
Isopropyl alcohol, AR grade 99.5%			Remove plastic dust from the sanded model
Lacquer	Rust-Oleum		2X-Ultra cover Gloss Clear
Matlab	Mathworks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Microscope	Nikon	SMZ25
Microscope Camera	Nikon	DS-Qi2
Peristaltic pump	Watson Marlow	530U IP31	With 2 pumpheads: 313D
Plastic tube clamp	Quickun	1-2240-stopvalve-2pcs
Polystyrene Particles	Thermo-Fisher Scientific	F8827	Diameter = 2 µm
Printer resin	FormLabs	RS-F2-GPCL-04
Rotator	ELMI Ltd.		Intelli-Mixer RM-2
Solidworks	SolidWorks Corp., Dassault Systèmes		https://www.solidworks.com/
Tubing	Watson Marlow	933.0064.016	Tubing for the pump: 6.4 mm ID
All the other tubing: Silicon tubing: 4 mm ID