Geração e Cultura de Organoides Linguais Derivados de Células-Tronco do Gosto de Rato Adulto

Resumo

O protocolo apresenta um método para cultivo e processamento de organoides linguais derivados de células-tronco de sabor isoladas da papila de sabor posterior de camundongos adultos.

Resumo

A sensação de paladar é mediada por papilas gustativas na língua, que são compostas de células receptoras de sabor (TRCs) que renovam rapidamente. Essa rotatividade contínua é alimentada por células progenitoras locais e torna a função de paladar propensa à interrupção por uma infinidade de tratamentos médicos, o que, por sua vez, impacta severamente a qualidade de vida. Assim, estudar esse processo no contexto do tratamento medicamentoso é vital para entender se e como a função progenitora do sabor e a produção de TRC são afetadas. Dadas as preocupações éticas e a limitada disponibilidade do tecido de sabor humano, os modelos de camundongos, que têm um sistema de sabor semelhante aos humanos, são comumente usados. Em comparação com os métodos in vivo, que são demorados, caros e não favoráveis a estudos de alto rendimento, organoides linguais murinos podem permitir que experimentos sejam executados rapidamente com muitas réplicas e menos camundongos. Aqui, protocolos publicados anteriormente foram adaptados e um método padronizado para gerar organoides de paladar a partir de células progenitoras de sabor isoladas da papila circunvallada (CVP) de camundongos adultos é apresentado. Células progenitoras de sabor no LGR5 expresso CVP e podem ser isoladas através da classificação celular ativada por fluorescência (FACS) de camundongos portadores de um alelo Lgr5^{EGFP-IRES-CreERT2.} As células classificadas são banhadas em um sistema de cultura 3D baseado em gel matricial e cultivadas por 12 dias. Os organoides se expandem durante os primeiros 6 dias do período cultural por meio da proliferação e, em seguida, entram em uma fase de diferenciação, durante a qual geram todos os três tipos de células de paladar, juntamente com células epiteliais sem gosto. Os organoides podem ser colhidos após o amadurecimento no dia 12 ou a qualquer momento durante o processo de crescimento para expressão de RNA e análise imunohistoquímica. Padronizar métodos culturais para a produção de organoides linguais a partir de células-tronco adultas melhorará a reprodutibilidade e avançará organoides linguais como uma poderosa ferramenta de triagem de medicamentos na luta para ajudar pacientes que experimentam disfunção do sabor.

Introdução

Em roedores, as papilas gustativas linguais são alojadas em papilas fungiformes distribuídas anteriormente, papilas foliadas bilaterais posteriormente, bem como uma única papila circunvallada (CVP) na linha média posterodorsal da língua¹. Cada paladar é composto por células receptoras de sabor de 50-100 de curta duração, que renovam rapidamente as células receptoras de sabor (TRCs), que incluem células de suporte tipo I, células tipo II que detectam células doces, amargas e umami, e células tipo III que detectam células azedas^2,3,4. No mouse CVP, as células-tronco LGR5⁺ ao longo da lamina basal produzem todos os tipos de TRC, bem como células epiteliais não saborosas⁵. Ao renovar a linhagem de sabor, as células filhas LGR5 são primeiramente especificadas como células precursoras do sabor pós-mitótico (células tipo IV) que entram em uma papila gustativa e são capazes de se diferenciar em qualquer um dos três tipos TRC⁶. A rápida rotatividade dos TRCs torna o sistema de paladar suscetível à interrupção por tratamentos médicos, incluindo radiação e certas terapias medicamentosas^{7,8,9,10,11,12,13}. Assim, estudar o sistema de paladar no contexto da regulação de células-tronco do sabor e da diferenciação de TRC é vital para entender como mitigar ou prevenir a disfunção do sabor.

Os camundongos são um modelo tradicional para estudos in vivo em ciência do sabor, uma vez que possuem um sistema de sabor organizado de forma semelhante aos humanos^14,15,16. No entanto, os camundongos não são ideais para estudos de alto rendimento, pois são caros de manter e demorados para trabalhar. Para superar isso, métodos in vitro de cultura organoide têm sido desenvolvidos nos últimos anos. Organoides de paladar podem ser gerados a partir do tecido CVP nativo, um processo no qual organoides brotam do camundongo isolado CVP epitélio cultivado ex vivo¹⁷. Estes organoides exibem um epitélio multicamadas consistente com o sistema de sabor in vivo. Uma forma mais eficiente de gerar organoides que não requerem a cultura ex vivo CVP foi desenvolvida pela Ren et al. em 2014¹⁸. Adaptando métodos e meios de cultura desenvolvidos pela primeira vez para cultivar organoides intestinais, isolaram células lgr5-GFP⁺ progenitores únicas do mouse CVP e as banhavam em gel de matriz¹⁹. Essas células únicas geraram organoides linguais que se proliferam durante os primeiros 6 dias de cultura, começam a se diferenciar por volta do dia 8, e ao final do período cultural contêm células epiteliais sem gosto e todos os três tipos TRC^18,20. Até o momento, foram publicados múltiplos estudos utilizando o sistema de modelo organoide lingual^{17,18,20,21,22}; no entanto, os métodos e condições de cultura utilizados para gerar esses organoides variam entre as publicações (Tabela Suplementar 1). Assim, esses métodos foram ajustados e otimizados aqui para apresentar um protocolo padronizado detalhado para a cultura de organoides linguais derivados do LGR5⁺ progenitores do mouse adulto CVP.

Organoides linguais fornecem um modelo único para estudar os processos biológicos celulares que impulsionam o desenvolvimento e renovação das células do paladar. À medida que as aplicações dos organoides linguais se expandem e mais laboratórios se movem para utilizar modelos organoides in vitro, é importante que o campo se esforce para desenvolver e adotar protocolos padronizados para melhorar a reprodutibilidade. Estabelecer organoides linguais como uma ferramenta padrão dentro da ciência do sabor permitiria estudos de alto rendimento que provocam como células-tronco únicas geram as células-tronco diferenciadas do sistema de paladar adulto. Além disso, organoides linguais poderiam ser empregados para rastrear rapidamente drogas para potenciais impactos na homeostase do sabor, que poderia então ser investigada mais detalhadamente em modelos animais. Esta abordagem, em última análise, aumentará os esforços para criar terapias que melhorem a qualidade de vida dos futuros receptores de medicamentos.

Protocolo

Todos os procedimentos animais foram realizados em uma unidade credenciada pela AAALAC em conformidade com o Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, Lei de Bem-Estar Animal e Política de Serviços públicos de Saúde, e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Campus Médico da Universidade do Colorado Anschutz. Os camundongos LGR5^{EGFP-IRES-CreERT2} usados neste protocolo são do Laboratório Jackson, Stock No. 008875.

NOTA: As seguintes etapas devem ser concluídas antes de começar a garantir a progressão suave e oportuna do protocolo: definir banho de água para 37 °C, definir soluções de enzima centrífuga a 4 °C, fazer soluções de enzima de injeção e dissociação a partir das soluções de espase de 10 mg/mL, Colagenase e Elastase (ver Tabela de Materiais),remover gel de matriz a partir de -20 °C congelador (~750 μL necessário para uma placa de 48 poços) e descongelar submergindo o frasco no gelo para a 00 pelo menos 3-4 h, tubos de microcentrifuuge pré-casaco em FBS não diluídos balançando suavemente à temperatura ambiente por pelo menos 30 min (dois tubos de 2 mL para coleta de tecido, dois tubos de 1,5 mL para células dissociadas e um tubo de 1,5 mL para coleta de células únicas do classificador celular; remover o excesso de FBS antes de usar).

1. Isolamento do epitélio CVP

NOTA: Para obter células LGR5⁺ suficientes para uma placa completa de 48 poços, colete três CVPs LGR5-EGFP no mesmo tubo e processe simultaneamente. É importante ressaltar que colhe e processa o CVP de pelo menos um tipo selvagem de ninhado em paralelo em um tubo separado e utilize-o como um controle de gating para definir parâmetros FACS (ver Resultados Representativos).

1. Eutanize os camundongos com asfixia de CO₂ de acordo com as regulamentações da IACUC, seguido de um método secundário aprovado, como toracotomia bilateral, luxação cervical, decapitação ou exsanguinação.
2. Use uma grande tesoura de dissecção estéril para cortar as bochechas e quebrar a mandíbula. Levante a língua e corte o frênulo lingual para separar a língua do chão da cavidade oral. Corte a língua e colete-a em salina tamponada de fosfato de Dulbecco (dPBS) com Ca²⁺ e Mg²⁺.
3. Remova e descarte a língua anterior cortando apenas antes da eminência intermolar com uma lâmina de barbear(Figura 1A, linha tracejada). Use uma limpeza de tarefa delicada para remover qualquer cabelo e excesso de líquido da língua posterior.
4. Encha 1 mL de seringa com 200-300 μL de solução de enzima de injeção (concentração final: 2 mg/mL tipo-I Colagemnase e 5 mg/mL Dispase II em Ca²⁺/Mg²⁺-contendo dPBS, diluído de 10 mg/mL soluções de estoque) e insira uma agulha de 30 G x 1/2 logo acima da eminência intermolar(Figura 1B, seta preta)até apenas antes do CVP (Figura 1B, caixa preta). Injete a solução enzimante por baixo e nas bordas laterais do CVP entre o epitélio e os tecidos subjacentes (lamina propria, músculo). Retire a seringa lentamente e continuamente da língua à medida que a injeção for realizada.
5. Incubar a língua em dPBS ca²⁺/Mg²⁺livre a temperatura ambiente por precisamente 33 min.
6. Faça pequenos cortes no epitélio bilateralmente e apenas anterior ao CVP usando uma tesoura de dissecção fina extra, e descasque suavemente o epitélio levantando-o com fórceps finos. Uma vez que o epitélio da trincheira esteja livre do tecido conjuntivo subjacente, coloque-o em um tubo vazio de microcentrifuuge de 2 mL pré-revestido com FBS. Faça o aparador epitelial antes ou depois de desacoplar o epitélio CVP (Figura 1C, D).

2. Dissociação do epitélio CVP

NOTA: A dissociação do epitélio CVP e do revestimento são representadas graficamente na Figura 2.

1. Adicione o coquetel de enzima dissociação (concentração final: 2 mg/mL tipo I Collagenase, 2 mg/mL Elastase e 5 mg/mL Dispase II em Ca²⁺/Mg²⁺-contendo dPBS, diluído a partir de 10 mg/mL soluções de estoque) para tubos contendo epithelia CVP descascada (200 μL por CVP). Incubar em um banho de água de 37 °C por 45 min. Vórtice brevemente a cada 15 minutos.
   NOTA: Pré-aquecimento 0,25% Trypsin-EDTA em banho de água de 37 °C durante os últimos 15 minutos de incubação de coquetéis enzimados.
2. Após a incubação, o vórtice (três pulsos) em seguida triturar com uma pipeta Pasteur de vidro por 1 min. Após as peças de tecido se instalarem, pipeta o supernascer contendo a primeira coleção de células dissociadas, em novos tubos de microcentrifuuge revestidos de FBS de 1,5 mL correspondentes ao genótipo. Processe ainda mais as peças de tecido restantes conforme descrito na etapa 2.3. abaixo.
   1. Gire o supernante por 5 min a 370 x g e 4 °C para as células de pelotas.
   2. Remova o supernascimento resultante e resuspenque a pelota celular no Buffer de Classificação celular Ativado por Fluorescência (FACS) (1 mM EDTA, 25 mM HEPES (pH 7.0) e 1% FBS em PBS ca²⁺/Mg²⁺-free (50 μL por CVP)). Guarde no gelo.
3. Ao realizar as etapas 2.2.1 e 2.2.2, dissociar as peças de tecido restantes da etapa 2.2 adicionando 0,25% de trypsin-EDTA (200 μL por CVP) aos tubos originais de microcentrifuge de 2 mL e incubar em um banho de água de 37 °C por 30 minutos. Vórtice brevemente a cada 10 minutos.
4. Após a incubação, o tubo contendo pedaços de tecido (três pulsos) em seguida, triturar com uma pipeta Pasteur de vidro por 1 min. Após as peças de tecido se instalarem, pipeta o supernacido nos tubos de microcentrifuus de 1,5 mL contendo células da etapa 2.2.2. Descarte os tubos que contenham os pedaços de tecido restantes.
   1. Gire os tubos com células dissociadas por 5 min a 370 x g e 4 °C para células de pelotas.
   2. Remova as pelotas de células supernascidas e resuspendas em Buffer FACS (100 μL por CVP). Guarde no gelo.
5. Passe as células através de um filtro de malha de nylon de 30 μm e adicione DAPI_(emissão λ = 450 nm) às misturas celulares antes do FACS. Isole células Lgr5-GFP⁺ via FACS usando o canal de proteína fluorescente verde (excitação_λ = 488 nm;_emissão λ = 530 nm). Classifique as células usando um bico de 100 μm em um novo tubo de microcentrifusagem revestido de FBS de 1,5 mL contendo 300 μL de Ca²⁺/Mg²⁺ dPBS grátis. Coloque as células no gelo até chapeamento.

3. Chapeamento de células Lgr5-EGFP

1. Determine o volume de suspensão celular LGR5⁺ recebida do citômetro de fluxo.
2. Com base no número de células obtidas do classificador, calcule o número de células por μL. Em seguida, determine o volume necessário para obter o número desejado de células para chapeamento (usamos 200 células por poço de uma placa de 48 poços) e transfira esse volume total de células suspensas para um novo tubo de microcentrifuagem.
3. Gire o tubo por 5 min a 370 x g e 4 °C para as células de pelota (pelotas podem não ser visíveis). Remova o supernatante e coloque o tubo no gelo.
4. Resuspenque suavemente a pelota celular na quantidade apropriada de gel de matriz (15 μL por poço para placas de 48 poços); pipeta para cima e para baixo suavemente para distribuir completamente as células em gel de matriz. Coloque 15 μL de mistura matriz gel/célula no centro de cada poço. Mantenha o tubo de microcentrifuagem no gelo em um tubo cônico de 50 mL durante o revestimento para evitar que o gel de matriz geleia. Continue a misturar mistura matriz gel/célula ao longo do revestimento, pipetando para cima e para baixo a cada três poços para garantir uma distribuição uniforme das células através dos poços.
5. Coloque a placa na incubadora (37 °C, 5% DE CO₂, ~95% de umidade) por 10 minutos para permitir gelagem de geleia de geleia matricial. Em seguida, adicione 300 μL de temperatura ambiente WENRAS + Y27632 mídia para cada poço e devolva a placa para a incubadora.

4. Manutenção organoide

NOTA: Os organoides são cultivados em mídia organoide convencional (WENR) que compreendem eGF recombinante e mídia 50% condicionada contendo Wnt3a, Noggin e R-spondin²³. Medicamentos A8301 e SB202190 são adicionados nos primeiros 6 dias do período cultural para otimizar o crescimento (mídia WENRAS) (Figura 5), depoisremovidos para promover a diferenciação (mídia WENR)²⁰. Y27632 é adicionado para os dois primeiros dias de cultura para promover a sobrevivência. As condições da mídia relativas ao cronograma da cultura são apresentadas na Figura 4.

1. Dois dias após o revestimento, remova as mídias WENRAS + Y27632 de cada poço usando uma pipeta de 1 mL, garantindo nenhuma contaminação cruzada. Adicione 300 μL de mídia WENRAS na lateral do poço para não interromper o gel de matriz. Devolva a placa para a incubadora.
2. Alterar a mídia a cada 2 dias, utilizando os meios de comunicação apropriados para a fase cultural(Figura 4). Mantenha os organoides até o dia 12, quando os organoides estiverem prontos para a colheita.

5. Processamento de RNA

1. Colhendo organoides para RNA
   1. Coloque placa de 48 poços no gelo por 30 minutos para despolimerizar o gel de matriz.
   2. Usando uma pipeta de 1 mL, puxe a mídia organoide; então, à medida que a mídia é devolvida ao poço, use a ponta da pipeta para coçar e quebrar ainda mais o gel de matriz. Transfira o conteúdo para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL, agrupando o conteúdo de três poços em um tubo. Centrifugar os tubos por 5 min a 300 x g em temperatura ambiente.
   3. Remover o máximo de supernanato de mídia possível sem remover quaisquer organoides; em seguida, gire os tubos novamente por 5 min a 300 x g em temperatura ambiente.
   4. Remova a mídia restante e resuspenque os organoides em 350 μL tampão de lise + β-mercaptoetanol (βME) (10 μL βME por tampão de 1 mL de lise). Coloque as amostras no gelo para extração imediata de RNA ou armazene a -80 °C.
2. Análise quantitativa de RT-PCR
   1. Meça a quantidade de RNA via espectotômetro. RNA de transcrição reversa usando um kit de síntese cDNA.
   2. Misture cDNA equivalente a RNA de 5 ng com primers pré-validados para frente e reverso de 200 nM(Tabela 1) e PCR Master Mix fluorescente. Execute a reação qRT-PCR para 40 ciclos a: 95 °C para 15 s, depois 60 °C para 60 s.

6. Imunohistoquímica

1. Colhendo e consertando os organoides
   1. Coloque placa de 48 poços no gelo por 30 minutos para soltar o gel de matriz.
   2. Remova a mídia organoide e adicione 400 μL de PBS gelado a cada poço. Em seguida, remova o PBS e adicione 400 μL de solução de recuperação celular gelada a cada poço. Arrase suavemente a 4 °C por 30 min.
   3. Cubra uma ponta de tubulação de 1 mL com 1% de BSA na PBS, e gentilmente in pipet conteúdo do poço para cima e para baixo para quebrar o gel de matriz. Transfira os organoides para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL colocado no gelo.
   4. Enxágüe cada poço com 300 μL PBS + 1% BSA e transfira quaisquer organoides restantes para os tubos correspondentes. Remova a solução de recuperação celular/PBS + BSA de cada tubo. Adicione 400 μL de PBS gelado e repita com outra lavagem pbs gelada.
   5. Remova o PBS e corrija organoides com 300 μL de 4% pfa gelado (em 0,1 M PB) por 20 minutos, incubando à temperatura ambiente. Remova pfa e enxágue organoides com PBS gelado de 400 μL.
   6. Remover PBS; em seguida, adicione 400 μL PBS + 1% BSA. Armazenar a 4 °C.
2. Coloração de imunofluorescência
   1. Enxágüe organoides em 500 μL PBS + 1% BSA. Em seguida, incubar organoides na solução de bloqueio (5% soro normal de cabra ou burro, 1% de albumina de soro bovino, 0,3% Triton X 100 em 1x PBS pH 7.3) por 2 h, balançando suavemente à temperatura ambiente.
   2. Adicione a solução de anticorpos primário (anticorpos primários diluídos na solução de bloqueio) e arrase suavemente por 3 noites a 4 °C.
   3. Lave organoides 4x por 1h com 500 μL PBS + 0,2% Triton, balançando suavemente à temperatura ambiente. Adicione solução secundária de anticorpos (anticorpos secundários diluídos em solução de bloqueio) e organoides rochosos durante a noite, protegidos da luz, a 4 °C.
   4. Lave organoides 3x por 1h com 500 μL PBS + 0,2% Triton, protegidos da luz e balançando suavemente à temperatura ambiente. Incubar com DAPI diluído 1:10.000 em 0,1 M PB por 20 min, balançando e coberto à temperatura ambiente.
   5. Lave os organoides 3x por 20 min com 0,1 M PB, balançando suavemente e cobertos à temperatura ambiente.
3. Montagem de organoides para microscopia confocal invertida.
   NOTA: As imagens passo a passo do processo de montagem do slide são mostradas na Figura 7.
   1. Crie um perímetro quadrado de 22 x 22 mm de espessura de ~1 mm de argila de modelagem não tóxica em um slide de microscópio.
   2. Remova 0,1 M PB do tubo de microcentrifuus e resuspende suavemente em 100 μL meio de montagem de escolha; então, transfira para o centro da praça de argila.
   3. Encha o quadrado de argila até que o meio de montagem esteja quase no topo. Em seguida, coloque as coberturas quadradas de 22 x 22 mm sobre a argila e pressione firmemente para baixo nas laterais da tampa para selar. Deixe curar de acordo com as instruções do fabricante (aqui, temperatura ambiente por 1-2 dias) e armazenar a 4 °C.

Resultados

Os camundongos possuem um CVP, localizado posteriormente na língua, a partir do qual as células-tronco LGR5⁺ podem ser isoladas(Figura 1A, caixa preta). A injeção de uma solução enzimápica dentro e ao redor do CVP (Figura 1B) resulta em um leve inchaço do epitélio e digestão do tecido conjuntivo. A digestão suficiente é alcançada após uma incubação de 33 min, o que permite a fácil separação do epitélio CVP do tecid...

Discussão

Relatado aqui é um método eficiente e facilmente repetitivo para a cultura, manutenção e processamento de organoides linguais derivados de células-tronco de gosto de camundongos adultos. Verificou-se que o uso de três CVPs de camundongos Lgr5 de 8 a 20 semanas de idade-EGFP é suficiente para obter ~10.000 células GFP⁺ para uso experimental, resultando em 50 poços banhados a uma densidade de 200 células por poço em placas de 48 poços. A remoção da epitélio da trincheira CVP é otimizada ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG	Molecular Probes	A11056, RRID: AB_142628	1:2000
Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG	Molecular Probes	A11010, RRID:AB_2534077	1:2000
Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG	Invitrogen	A11075, RRID:AB_2534119	1:2000
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG	Molecular Probes	A31573, RRID:AB_2536183	1:2000
Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG	Molecular Probes	A21247, RRID:AB_141778	1:2000
DAPI (for FACS)	Thermo Fischer	62247
DAPI (for immunohistochemistry)	Invitrogen	D3571, RRID:AB_2307445	1:10000
Goat anti-CAR4	R&D Systems	AF2414, RRID:AB_2070332	1:50
Guinea pig anti-KRT13	Acris Antibodies	BP5076, RRID:AB_979608	1:250
Rabbit anti-GUSTDUCIN	Santa Cruz Biotechnology Inc.	sc-395, RRID:AB_673678	1:250
Rabbit anti-NTPDASE2	CHUQ	mN2-36LI6, RRID:AB_2800455	1:300
Rat anti-KRT8	DSHB	TROMA-IS, RRID: AB_531826	1:100
Equipment
2D rocker	Benchmark Scientific Inc.	BR2000
3D Rotator	Lab-Line Instruments	4630
Big-Digit Timer/Stopwatch	Fisher Scientific	S407992
Centrifuge	Eppendorf	5415D
CO2 tank	Airgas	CD USP50
FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator	Thermo Scientific	4110	184 L, Polished Stainless Steel
Incucyte	Sartorius	Model: S3	Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus
MoFlo XDP100	Cytomation Inc	Model: S13211997	Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus
Orbital Shaker	New Brunswick Scientific	Excella E1
Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4376600
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5417R
Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-1000
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi SV6
Thermal Cycler	Bio-Rad	580BR
Vortex	Fisher Scientific	12-812
Water bath	Precision	51220073
Media
A83 01	Sigma	SML0788-5MG	Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
B27 Supplement	Gibco	17504044	Stock concentration 50X, final concentration 1X
Gentamicin	Gibco	15750-060	Stock concentration 1000X, final concentration 1X
Glutamax	Gibco	35050061	Stock concentration 100X, final concentration 1X
HEPES	Gibco	15630080	Stock concentration 100X, final concentration 1X
Murine EGF	Peprotech	315-09-1MG	Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL
Murine Noggin	Peprotech	250-38	Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL
N-acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165	Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM
Nicotinamide	Sigma	N0636-100g	Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM
Pen/Strep	Gibco	15140-122	Stock concentration 100X, final concentration 1X
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1	Stock concentration 500X, final concentration 1X
SB202190	R&D Systems	1264	Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM
WRN Conditioned media			Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells
Y27632 dihydochloride 10ug	APExBIO	A3008-10	Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Other
1 ml TB Syringe	BD Syringe	309659
2-Mercaptoethanol, min. 98%	Sigma	M3148-25ML	β-mercaptoethanol
2.0 mL Microcentrifuge Tubes	USA Scientific	1420-2700
48-well plates	Thermo Scientific	150687
5 3/4 inch Pasteur Pipets	Fisherbrand	12-678-8A
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma Life Science	A9647-100G
Buffer RLT Lysis buffer	QIAGEN	1015750
Cell Recovery Solution	Corning	354253
Cohan-Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-02
Collagenase from Clostridium histolyticum, type I	Sigma Life Science	C0130-1G
Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear	R&D Systems	3533-005-02	Matrigel
Dispase II (neutral protease, grade II)	Sigma-Aldrich (Roche)	4942078001
Disposable Filters	Sysmex	04-0042-2316
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free)	Gibco	10010-023
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+	Sigma Life Sciences	D8662-500ML
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
EDTA, 0.5M (pH 8.0)	Promega	V4231
Elastase Lyophilized	Worthington Biochemical	LS002292
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-01
HEPES Solution	Sigma Life Science	H3537-100ML
HyClone Tryspin 0.25% + EDTA	Thermo Scientific	25200-056
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1706691
Modeling Clay, Gray	Sargent Art	22-4084
Needle	BD Syringe	305106
Normal Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Normal Goat Serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PowerSYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4367659
RNeasy Micro Kit	QIAGEN	74004
Safe-Lock Tubes 1.5 mL	Eppendorf	022363204
Sodium Chloride	Fisher Chemical	7647-14-5
Sodium Phosphate dibasic anhydrous	Fisher Chemical	7558-79-4
Sodium Phosphate monobasic anhydrous	Fisher Bioreagents	7558-80-7
SuperFrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Surgical Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14002-14
Triton X-100	Sigma Life Science	T8787-100ML
VWR micro cover glass	VWR	48366067	22x22mm