Indução de hipotermia de curta duração em ratos usando modelos para estudos que examinam relevância clínica e mecanismos

Resumo

Este artigo descreve dois métodos de indução de hipotermia de curto período em ratos. O primeiro método de indução rápida, emprega resfriamento ativo usando ventiladores e spray de etanol para uma rápida diminuição da temperatura. O segundo método é um método de resfriamento gradual. Isso é conseguido usando a combinação de anestesia isoflurane e a redução das configurações de temperatura no tapete de calor homeotémico. Isso resulta em uma diminuição gradual da temperatura corporal do núcleo sem o uso de quaisquer dispositivos de resfriamento externos. 

Resumo

Hipotermia terapêutica (TH) é uma poderosa estratégia neuroprotetora que forneceu evidências robustas para neuroproteção em estudos pré-clínicos de distúrbios neurológicos. Apesar das fortes evidências pré-clínicas, a TH não mostrou eficácia em ensaios clínicos da maioria das doenças neurológicas. Os únicos ensaios bem-sucedidos que empregavam hipotermia terapêutica foram relacionados à parada cardíaca em adultos e lesão isquêmica hipoxica em recém-nascidos. Investigações adicionais sobre os parâmetros de seu uso e comparações de desenho de estudos entre estudos pré-clínicos e clínicos são justificadas. Este artigo demonstra dois métodos de indução de hipotermia de curta duração. O primeiro método permite a indução rápida de hipotermia em ratos usando spray de etanol e ventiladores. Este método funciona resfriando a pele, que tem sido menos comumente utilizada em ensaios clínicos e pode ter diferentes efeitos fisiológicos. O resfriamento é muito mais rápido com essa técnica do que é alcançável em pacientes humanos devido a diferenças na relação superfície/volume. Junto com isso, também é apresentado um segundo método, que permite uma taxa de resfriamento clinicamente alcançável para hipotermia de curta duração. Este método é fácil de implementar, reproduzível e não requer resfriamento ativo da pele.

Introdução

TH é a prática de resfriamento da temperatura corporal ou cerebral, a fim de preservar a viabilidade e a função do órgão/sistema^1,2. O papel da hipotermia na neuroproteção tem sido investigado e tem mostrado benefícios em uma série de modelos pré-clínicos de doenças neurológicas como derrame^3,hemorragia subaracnóide⁴e lesão cerebral traumática⁵. Em termos de aplicações clínicas, o TH tem mostrado eficácia em pacientes pós-parada cardíaca e em lesão hipoxica-isquêmica neonatal⁶.

A indução de TH é obtida usando métodos de resfriamento superficial ou endovascular. A maioria dos estudos pré-clínicos de hipotermia realizam o resfriamento superficial aplicando água ou etanol na pele do animal, ou usando uma manta de resfriamento para atingir a temperatura-alvo¹. Em humanos, o resfriamento sistêmico da superfície é alcançado usando sacos de gelo e cobertores de resfriamento^7,8. O resfriamento mais rápido tem sido mostrado em pacientes usando métodos endovasculares, que acoplam uma infusão de indução de soro fisiológico frio através de um cateter intravenoso ou intra-arterial, com a colocação de um dispositivo de resfriamento endovascular dentro da veia cava^{inferior 9,10}. Por exemplo, uma temperatura-alvo moderada de 33 °C pode ser alcançada em 1,5 h com resfriamento endovascular em comparação com 3-4 h com resfriamento superficial em pacientes¹¹. A abordagem endovascular também se tornou mais popular nos últimos anos porque tem sido relatada para reduzir alguns dos efeitos colaterais vistos no resfriamento sistêmico da superfície, como^{tremores 12,13}. O ensaio clínico europeu multicêntrico e randomizado fase III de hipotermia para derrame isquêmico (EUROHYP-1) utilizou principalmente resfriamento superficial¹⁴. Resultados publicados recentemente neste estudo mostraram que o tremor foi uma complicação importante e pode ter limitado a capacidade de atingir a temperatura-alvo¹⁰. A resposta arrepiante é conhecida por ser impulsionada principalmente pela temperatura da pele. Alguns esforços foram feitos para desenvolver um método de resfriamento endovascular de roedores^15,mas a natureza altamente invasiva da técnica em comparação com a usada em humanos, corre o risco de confundir quaisquer resultados obtidos a partir desse modelo.

A temperatura é o principal modulador dos processos biológicos no corpo e é fortemente regulada pela homeostase. Portanto, qualquer manipulação da temperatura corporal pode ter riscos associados. A duração do resfriamento é um fator que pode ter limitado o sucesso dos ensaios clínicos de hipotermia. Estes ensaios utilizam um método de resfriamento de longa duração, com muitos mantendo hipotermia de 24-72 h¹¹. Esta duração prolongada representa um risco de infecção durante o protocolo de resfriamento. A pneumonia é a complicação mais comum por hipotermia, afetando entre 40-50% dos pacientes submetidos ao procedimento¹³. Isso contrasta com o que normalmente é visto em estudos em animais de hipotermia, onde é utilizado um paradigma de curta duração (1-6 h)³. O sucesso desses estudos pré-clínicos em animais provavelmente resultará na adaptação da hipotermia de curta duração para o uso em ensaios clínicos. Como resultado, é necessário ter um modelo animal de hipotermia de curta duração que se assemelha às taxas de resfriamento de futuros ensaios clínicos. Mais detalhes relativos a outros parâmetros de temperatura e a validade da hipotermia de curta duração foram discutidos em vários artigos de revisão^1,16,17,18.

Demonstrado aqui é um modelo gradual de resfriamento que é mais clinicamente alcançável do que os modelos experimentais de hipotermia atuais. Este novo método tem uma taxa muito mais lenta de resfriamento e, portanto, o tempo de segmentação da temperatura está mais próximo do alcance daqueles vistos em ensaios clínicos de hipotermia¹¹. Também evita o resfriamento direto da superfície, que tem efeitos fisiológicos específicos, pode, portanto, ser mais comparável ao resfriamento endovascular, que tem sido o método de resfriamento mais utilizado em ensaios clínicos^9,12. Este modelo permite que os animais sejam resfriados gradualmente ao longo de 2h seguidos de um curto período de manutenção na temperatura alvo. Além disso, o método de hipotermia de curto prazo de resfriamento rápido¹⁹ também é demonstrado. O método de resfriamento rápido permite que a temperatura-alvo seja alcançada rapidamente após o início da hipotermia. Embora essa abordagem não seja tão clinicamente relevante quanto o método de resfriamento gradual, é útil para estudos que visam explorar os mecanismos de neuroproteção de hipotermia para potencialmente imitar seus poderosos efeitos neuroprotetores farmacologicamente. Este método também tem aplicações potenciais fora da neurociência e pode ser adaptado a qualquer número de estudos pré-clínicos. Outra vantagem de ambos os métodos em comparação com outras abordagens é que eles são baratos e não necessitam de equipamentos especializados. Por fim, este protocolo também demonstra a implantação de dataloggers de temperatura, uma vez que o aquecimento pós-operatório e o monitoramento são importantes para prevenir hipotermia pós-operatória inadvertida, com seu potencial de confundir os resultados do estudo²⁰.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais estavam de acordo com o Código australiano de Prática para o Cuidado e Uso de Animais para Fins Científicos e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Ética Animal da Universidade de Newcastle (A-2013-343 e A-2020-003). Além dos métodos de indução de hipotermia descritos abaixo, os seguintes protocolos são rotineiramente feitos em conjunto com hipotermia: cannulação de linha femoral para monitorar a pressão arterial e a frequência cardíaca²¹, e curso experimental²².

1. Implantação de datalogger

NOTA: O dispositivo datalogger usado neste protocolo não foi capaz de fornecer leitura em tempo real da temperatura corporal. A leitura é possível uma vez que o datalogger tenha sido removido do animal e conectado de volta ao computador. Como resultado, a sonda de temperatura retal é usada para fornecer informações em tempo real durante o processo de resfriamento e reaquecimento. Além disso, a sonda retal também é vital para este método porque o tapete de calor cirúrgico no qual o animal é colocado durante o procedimento é regulado pelo sistema de sonda retatal. O datalogger também serve a um propósito valioso de fornecer dados de temperatura em ratos livremente em movimento e acordados e é importante para garantir que a temperatura normal do corpo seja mantida após o reaquecimento. Portanto, ambos os dispositivos de monitoramento de temperatura são importantes para este protocolo.

1. Anestesiar o rato Wistar macho de 10-12 semanas com isoflurano (5% para indução e 2-2,5% para manutenção) em uma mistura de 50% N₂ e 50% O_2.
2. Após a indução, coloque o rato na posição propensa em um tapete de calor cirúrgico.
3. Posicione o rato para que o nariz esteja sentado no cone do nariz. Segure o nariz com fita cirúrgica para garantir que nenhum gás esteja escapando.
4. Raspe a pele do abdômen inferior direito e injete no local subcutâneamente com um anestésico local, Bupivacaína 0,2 mL, 0,05%.
5. Aplique solução antisséptica na região recém-raspada.
6. Utilizando ferramentas cirúrgicas esterilizadas, faça uma incisão longitudinal de 2 cm ao longo da região abdominal direita, proximal à coxa direita. Faça a incisão profunda o suficiente para expor o espaço na linha da coxa ventral.
7. Use hemostats e fórceps para criar um 'bolso' sob a pele que é grande o suficiente para segurar o dispositivo.
8. Insira o dispositivo datalogger de monitoramento de temperatura no bolso e feche o músculo e a pele usando suturas de seda 5-0. O método subcutâneo descrito aqui é preferido para o método intra-peritoneal, pois é menos invasivo e permite uma melhor recuperação após o procedimento.
9. Certifique-se de que o datalogger e a sonda retal estejam calibrados cruzadamente para monitoramento de temperatura (ver Discussão).
10. Certifique-se de que o datalogger não está descansando contra o tapete de calor do animal após a inserção, pois isso influenciará as leituras de temperatura.

Figura 1: Implantação de dispositivo datalogger. (A) Painéis da esquerda para a direita mostram uma incisão de aproximadamente 2 cm sendo feita no lado direito do abdômen inferior do rato. (B) O datalogger de monitoramento de temperatura foi inserido subcutâneamente na incisão do bolso. (C) A incisão foi fechada com suturas de nylon. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Indução de hipotermia ativa (rápida) para estudos mecanicistas

1. Configurado para hipotermia (ver Figura 2). Coloque duas bancadas de réplica com grampos em ambos os lados do corpo do rato.
2. Conecte um ventilador de 60 mm 12 v/130 mA a cada suporte de réplica garantindo que os ventiladores sejam direcionados para a parte inferior da parte de trás do rato. A distância entre o grampo e o rato é de aproximadamente 20 cm. O ventilador usado deve ter uma velocidade de 4.000 rpm.
3. Tenha uma lâmpada de calor animal pronta ao lado ou em uma terceira bancada de réplica.
4. Inicie a hipotermia ajustando o tapete de calor animal à temperatura alvo desejada. Neste exemplo, 32,5 °C é a temperatura-alvo (3,75 na unidade de controle de temperatura).
5. Ligue os dois ventiladores e aplique de três a quatro sprays de 70% de etanol (garrafa de spray plástico padrão) na parte inferior da parte inferior do rato. Ruffle pele animal ao pulverizar para uma indução de resfriamento mais rápida.
   NOTA: O etanol é usado como uma solução preferida sobre a água porque tem uma taxa mais rápida de evaporação e, portanto, resulta em indução de hipotermia mais rápida.
6. Tome cuidado para não sobressaturar a pele, pois isso pode contribuir para ultrapassar a temperatura alvo.
   NOTA: Os ventiladores acelerarão a evaporação do etanol e o processo de resfriamento.
7. Permita intervalos curtos entre as aplicações do etanol, mantendo um olho atento à temperatura retal do rato.
8. Cesse qualquer outra aplicação de etanol uma vez que a temperatura retal atinge dentro de 1 °C de temperatura-alvo.
9. Desligue ambos os ventiladores uma vez que a temperatura tenha atingido dentro de 0,5 °C de temperatura-alvo (33 °C neste caso).
   NOTA: Desligar ventiladores antes que a temperatura-alvo seja atingida ajuda a evitar que o rato se esvaa além da temperatura necessária.
10. Deixe a temperatura cair para 32,5 °C.
    1. Se ocorrer excesso de cuidados, use lâmpada de calor animal para aquecer levemente o animal de volta ao alvo. A assistência de um ventilador pode ser usada para evitar uma superação reaqueça.
11. Uma vez que a temperatura alvo é atingida e estabilizada, continue monitorando a temperatura. A temperatura geralmente permanecerá muito estável durante o restante do período de hipotermia sem a necessidade de pulverização, uso de ventiladores ou uso de lâmpada de calor.
12. Para reaquecimento do animal no final da hipotermia, ajuste a temperatura do tapete de calor de volta para 37 °C (6 na unidade de controle de temperatura usada neste exemplo) e permita que o animal se contraia em um período de 30 minutos.
    NOTA: As configurações de temperatura nas unidades de controle de temperatura podem variar e podem, portanto, ser necessárias para determinar as configurações para hipotermia e normotermia de destino em dispositivos individuais.

3. Indução de hipotermia gradual de início clinicamente alcançável sem resfriamento ativo da pele

1. Atinja hipotermia reduzindo a temperatura do tapete de calor homeoérmico regulado pela temperatura do núcleo em pequenos incrementos à temperatura alvo necessária. No exemplo ilustrado (Figura 3B),foi utilizado um incremento de 1 °C a cada 30 min.
2. Esfrie o animal para atingir a temperatura durante o período desejado (2 h no exemplo descrito). Uma vez resfriado, mantenha-se no alvo para o intervalo desejado. Normalmente, nenhuma intervenção adicional é necessária se eles forem mantidos no tapete de calor homeotémico definido para a temperatura alvo desejada.
3. Não é necessário resfriamento externo com este protocolo, pois a anestesia impede a regulação normal da temperatura corporal do núcleo.
   NOTA: Os requisitos isoflurane declinam com hipotermia. Na maioria dos animais, uma concentração inicial de isoflurane de 2% pode ser reduzida em incrementos de 0,1% a cada 20-30 min a 1,5% para manter a frequência respiratória estável (>50 respirações/min), frequência cardíaca e pressão arterial, e preservar a supressão das respostas reflexas.
4. Para reaquecir o animal após hipotermia, ajuste o tapete de calor para permitir que o animal se reaqueça durante o intervalo desejado. No exemplo, o reaquecimento com um único ajuste de 37 °C (6 na unidade de controle de temperatura fhc usado no exemplo) foi alcançado ao longo de um período de 30 min.
   1. Para estudos de longo prazo que requerem recuperação animal, mantenha os animais em uma gaiola que é colocada meio sobre um tapete de calor para permitir que o animal se foroque termoregular e evite hipotermia pós-operatória inadvertida.
   2. O paracetamol retal (250 mg/kg) pode ser administrado para recuperação e alívio da dor durante a noite. Injeções salinas subcutâneas (2 x 1,5 mL) também podem ser dadas para evitar a desidratação da anestesia e procedimentos cirúrgicos.

Resultados

Figura 3A é uma representação de como um rato Wistar responde à hipotermia usando a abordagem de resfriamento rápido. A indução de hipotermia é obtida pelo uso de ventiladores e 70% de spray de etanol. Hipotermia a uma meta de 32,5 °C é alcançada em 15 min. Deve-se tomar cuidado para garantir uma interação delicada entre o uso da lâmpada de calor e o spray de etanol para manter a temperatura-alvo. Como pode ser visto a partir da Figura 3A, observa-se um leve aumento de temperatura, que pode ocorrer se o resfriamento não for cessado de cerca de 0,5 °C acima da temperatura-alvo. O alvo é mantido e estabilizado na marca de 30 min e o reaquecimento é iniciado em 1,5 h.

A Figura 3B mostra o protocolo gradual em que a temperatura-alvo até 33 °C é atingida a 2h e mantida por 30 min antes de reaquecimento a 2,5 h. Aqui, a temperatura é ajustada em incrementos que prolongam a duração necessária para atingir a temperatura-alvo. As linhas pontilhadas verticais em ambos os gráficos representam a duração do resfriamento.

As figuras 3A e Figura 3B são obtidas a partir do dispositivo datalogger. No início do experimento, o datalogger é programado para iniciar o registro antes da implantação. No final do experimento, o datalogger é removido do animal e conectado ao leitor de temperatura fornecido via porta USB. O software (por exemplo, eTemperature) lê e gera os dados, que podem então ser exportados para um software de planilha.

Figura 2: Configuração do protocolo de resfriamento rápido. (A) Dois ventiladores (seta preta) estavam situados sobre a região inferior traseira do rato. Na iniciação da hipotermia, ambos os ventiladores foram ligados e o spray de etanol foi aplicado na parte inferior das costas. A combinação de etanol e ventilador facilita e acelera a hipotermia para atingir rapidamente a temperatura-alvo. (B) Uma lâmpada de calor (seta branca) foi usada para evitar a superação da hipotermia. Uma vez que a temperatura-alvo foi atingida, a lâmpada de calor foi usada para evitar que a temperatura do núcleo do rato caísse mais baixo. Uma vez estabilizado o alvo, a lâmpada de calor e/ou ventilador restante foi desligado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Indução de hipotermia utilizando métodos ativos (A) e gradual (B) ( A) A A Temperatura-alvo foi atingida em 15 minutos usando o processo de resfriamento ativo e foi mantida por 60 minutos no exemplo acima antes do animal ser rewarmed. (B) A temperatura-alvo foi atingida em 2h usando o método de resfriamento gradual e foi mantida por 30 minutos antes do animal ser rearmado. Regiões sombreadas em ambos os gráficos representam pontos de tempo em que a temperatura-alvo foi mantida. Linhas perpendiculares pontilhadas em ambos os gráficos referem-se à duração geral do resfriamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Os procedimentos descritos aqui são facilmente implementados, não invasivos, e proporcionam reduções confiáveis e reprodutíveis na temperatura corporal do núcleo para uma temperatura alvo desejada.

Existem várias etapas críticas no método de resfriamento rápido que incluem o seguinte. Não supersaturar o spray de etanol - deve-se tomar cuidado para não molhar o animal no etanol, pois isso vai interferir nos resultados. Monitorar o animal durante a indução de hipotermia deve ser tomado cuidado para monitorar de perto as respostas dos animais à indução rápida de hipotermia. Um alerta de perto da temperatura retal é importante para garantir que a temperatura não fique abaixo do alvo desejado- se isso acontecer, desligue os ventiladores e permita que a lâmpada de calor reaqueça suavemente o animal de volta ao alvo necessário.

Em ambos os métodos, o monitoramento fisiológico é importante para garantir o ajuste adequado da dose anestésica. Para resfriamento prolongado, a dose anestésico inadequada pode prolongar a duração do resfriamento. Neste caso, a concentração de isoflurane pode ser aumentada até que uma taxa de resfriamento adequada seja alcançada. Outro passo crítico é a calibração cruzada dos dispositivos de temperatura. Ao usar um tapete de calor regulado pela sonda de temperatura e um datalogger no mesmo experimento, é melhor a prática de cruzar o datalogger com a sonda retal, in vivo, já que pode haver pequenas variações na temperatura registrada dos dois dispositivos.

Esses métodos são adequados para estudos que desejam explorar o uso da hipotermia como tratamento potencial para distúrbios neurológicos. O objetivo específico do estudo deve ditar qual método é utilizado. Ambos os métodos podem ser classificados como resfriamento sistêmico da superfície, porém o segundo método não requer qualquer resfriamento ativo. O modelo de resfriamento gradual descrito acima tem aplicações potenciais importantes para o uso de hipotermia no tratamento isquêmico do AVC. Hipotermia de longa duração e suas complicações resultantes representam um desafio para pacientes idosos de AVC. Além disso, a resposta arrepiante dificulta a atingir a temperatura-alvo em alguns pacientes¹⁰. Embora a medicação anti-tremor possa ajudar a reduzir a resposta arrepiante, o resfriamento gradual de curta duração poderia amenizar mais efetivamente o problema. Ter um período de resfriamento mais curto também é provável que reduza a incidência de pneumonia frequentemente relatada em ensaios. Outro benefício potencial deste método de curta duração é que a velocidade do reaquecimento pode não ser tão importante quando comparada ao resfriamento de longa duração. Estudos clínicos muito precoces de resfriamento de longa duração em pacientes com infartos grandes descobriram que o reaquecimento rápido levou a grandes elevações na pressão intracraniana (ICP), que piorou o resultado e foi muitas vezes fatal. Isso levou ao desenvolvimento de paradigmas de reaquecimento gradual, que estenderam ainda mais a duração global do resfriamento. O resfriamento de curta duração só mantém a temperatura-alvo por um curto período e pode resultar menos provável em recuperação ICP. Trabalhos anteriores que investigaram o tratamento de hipotermia para elevação da ICP, utilizando um protocolo de resfriamento e reaquecimento rápido semelhante ao descrito aqui, não mostraram nenhuma elevação de recuperação da ICP após o reaquecimento^23,24.

Ensaios clínicos de hipotermia para tratamento isquêmico de AVC não foram capazes de traduzir os benefícios da hipotermia que são relatados em estudos experimentais. A incompatibilidade nas taxas de resfriamento e duração entre modelos experimentais e pacientes, são variáveis importantes que podem explicar essa discrepância. Ter um modelo experimental de hipotermia que melhor se assemelha à taxa clínica de resfriamento permitirá uma investigação mais informada sobre os benefícios da hipotermia como medida de tratamento para pacientes com AVC.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	ThermoFisher Scientific/ Ajax Finechem	AJA214-20LPL	Diluted with deionized water to give 70 % ethanol
Antiseptic solution (Chlorhexidine)	David Craig	A2957
Anaesthetic (Marcain)	Aspen	PS13977
Brushless fan motor	Sirocco	YX2505	2 x 12 V/130 mA
Heat lamp	Reptile One	AC220	240 V 50/60 Hz
Heat pad	FHC, Inc	40-90-2
Rectal probe	FHC, Inc	40-90-5D-02
Temperature controller	FHC, Inc	40-90-8D
Temperature Datalogger	Maxim	DS1922L-F5