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Neste Artigo

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  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Um protocolo é apresentado para extrair o conteúdo lipídico total da parede celular de uma ampla gama de micobactérias. Além disso, são mostrados protocolos de extração e analíticas dos diferentes tipos de ácidos micólicos. Um protocolo cromatográfico de camada fina para monitorar esses compostos micobacterianos também é fornecido.

Resumo

As espécies de micobactérias podem diferir umas das outras na taxa de crescimento, presença de pigmentação, morfologia da colônia exibida em mídia sólida, bem como outras características fenotípicas. No entanto, todos eles têm em comum o caráter mais relevante das micobactérias: sua parede celular única e altamente hidrofóbica. As espécies de micobactérias contêm um complexo ligado à membrana-covalente que inclui arabinogalactan, peptidoglycan e longas cadeias de ácidos micólicos com tipos que diferem entre espécies de micobactérias. Além disso, as micobactérias também podem produzir lipídios localizados, não covalentemente ligados, em suas superfícies celulares, como dimicocerosates de fleiocerol (PDIM), glicólipídios fenólicos (PGL), glicopeptidolipids (GPL), acitretros (AT) ou mannoídeos fosfatidil-inositol (PIM), entre outros. Alguns deles são considerados fatores de virulência em micobactérias patogênicas, ou lipídios antigênicos críticos na interação hospedeira-micobactéria. Por essas razões, há um interesse significativo no estudo dos lipídios micobacterianos devido à sua aplicação em diversas áreas, desde a compreensão de seu papel na patogenicidade das infecções por micobactérias, até uma possível implicação como agentes imunomodulatórios para o tratamento de doenças infecciosas e outras patologias como o câncer. Aqui, é apresentada uma abordagem simples para extrair e analisar o teor total lipídico e a composição de ácido mcólico das células de micobactéria cultivadas em meio sólido usando misturas de solventes orgânicos. Uma vez que os extratos lipíduos são obtidos, a cromatografia de camada fina (TLC) é realizada para monitorar os compostos extraídos. O experimento de exemplo é realizado com quatro micobactérias diferentes: o mycolicibacterium brumae e Mycolicibacterium fortuitum, o atenuado Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG), e o patógeno oportunista de rápido crescimento Mycobacterium abscessus, demonstrando que métodos mostrados no presente protocolo podem ser usados para uma ampla gama de mycobacteria.

Introdução

Mycobacterium é um gênero que compreende espécies patogênicas e não patogênicas, caracterizada por ter uma parede celular altamente hidrofóbica e impermeável formada por seus lipídios peculiares. Especificamente, a parede celular micobacteriana contém ácidos micólicos, que são α-alquila e β-hidroxis, nos quais o α-ramo é constante em todos os ácidos micólicos (exceto pelo comprimento) e a cadeia de β, chamada cadeia meromycolate, é uma longa cadeia alifática que pode conter diferentes grupos químicos funcionais descritos junto com a literatura (α-, α'-, metoxical Κ-, epóxi-, carboxy-, e ω-1-metoxi-mycolates), produzindo assim sete tipos de ácidos míclicos (I-VII)1. Além disso, outros lipídios com importância inquestionável também estão presentes na parede celular das espécies de micobactérias. Espécies patogênicas como Mycobacterium tuberculosis, o agente causador da tuberculose2 produzir fatores específicos de virulência à base de lipídios, como dimicocerosates de fleuorol (PDIMs), glicolipídio fenólico (PGL), di-, tri-, e penta-acyltrehaloses (DAT, TAT e PAT), ou sulfolipídios, entre outros3. Sua presença na superfície micobacteriana tem sido associada com a capacidade de modificar a resposta imune do hospedeiro e, portanto, a evolução e persistência do micobacterium dentro do hospedeiro4. Por exemplo, a presença de triacylglycerols (TAG) tem sido associada ao fenótipo hipervirulento da subadequação lineage 2-Pequim de M. tuberculosis, possivelmente devido à sua capacidade de atenuar a resposta imune hospedeiro5,6. Outros lipídios relevantes são lipooligosaccarídeos (LOSs) presentes em micobactérias tuberculosas e não intuberréuas. No caso de Mycobacterium marinum, a presença de LOSs em sua parede celular está relacionada à motilidade deslizante e à capacidade de formar biofilmes e interfere no reconhecimento por receptores de reconhecimento de padrões de macrófago, afetando a absorção e eliminação das bactérias por fagocitos hospedeiros7,8. Além disso, a ausência ou presença de alguns lipídios permite que membros da mesma espécie sejam classificados em diferentes morótipos com perfis virulentos ou atenuados ao interagir com células hospedeiras. Por exemplo, a ausência de glycopeptidolipids (GPL) no morfótipo áspero de Mycobacterium abscessus tem sido associado com a capacidade de induzir acidificação intrafarosômica e, consequentemente, apoptose celular9, ao contrário do morótipo liso que possui GPLs em sua superfície. Além disso, o conteúdo lipídico da parede celular micobacteriana está relacionado com a capacidade de modificar a resposta imune no hospedeiro. Isso é relevante no contexto do uso de algumas micobactérias para desencadear um perfil imunológico protetor contra diferentes patologias10,11,12,13. Foi demonstrado, por exemplo, que Mycolicibacterium vaccae, um micobacterium saprofítico, que atualmente está em ensaios clínicos de fase III como vacina imunoterapêutica para tuberculose, apresentam dois morfotipos coloniais. Enquanto o fenótipo liso, que contém um poliéster em sua superfície, desencadeia uma resposta Th2, o fenótipo áspero desprovido do poliéster pode induzir um perfil Th1 quando interage com células imunes hospedeiras14. O repertório de lipídios presentes na célula micobacteriana não depende apenas das espécies de micobactérias, mas também das condições das culturas micobacterianas: tempo de incubação15,16 ou composição do meio de cultura17,18. De fato, mudanças na composição média da cultura afetam a atividade antitumoral e imunoestimulatória de M. bovis BCG e Mycolicibacterium brumae in vitro17. Além disso, o perfil imunológico protetor desencadeado por M. bovis BCG contra M. tuberculosis desafio em modelos de camundongos também depende da mídia cultural em que M. bovis BCG cresce17. Estes poderiam então estar relacionados com a composição lipídica das micobactérias em cada condição cultural. Por todas essas razões, o estudo do conteúdo lipídico das micobactérias é relevante. Um procedimento visual para extrair e analisar a composição lipídica da parede celular micobacteriana é apresentado.

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Protocolo

1. Extração do total de lipídios não covalentes da micobactéria (Figura 1)

  1. Arranhe 0,2 g de micobactérias de uma mídia sólida e adicione a um tubo de vidro com tampas de parafuso de revestimento politetrafluoroethlene (PTFE). Adicione uma solução composta por 5 mL de clorofórmio e 10 mL de metanol (clorofórmio:metanol, 1:2).
    NOTA: Quando forem utilizados solventes orgânicos, apenas o recipiente de vidro deve ser utilizado. Não são permitidos recipientes plásticos. Além disso, são necessárias tampas de parafuso de forro PTFE para garrafas.
    ATENÇÃO: O clorofórmio é uma substância potencialmente tóxica e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
    ATENÇÃO: O metanol é uma substância potencialmente tóxica e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
  2. Deixe o tubo em constante agitação durante a noite para extrair lipídios não ligados ao covalente da superfície celular micobacteriana.
    NOTA: Se uma plataforma de agitação orbital não estiver disponível, a agitação constante pode ser substituída por agitação manual periódica com a maior frequência possível.
  3. Cubra um funil de vidro com um papel filtro, filtre os solventes orgânicos e colete-os em um tubo de vidro.
  4. Use um fluxo de gás nitrogênio para evaporar a fase líquida no tubo. Encha o tubo com gás nitrogênio, cubra e guarde a 4 °C.
    NOTA: Conecte uma pipeta pasteur de vidro ao fluxo de gás nitrogênio para evaporar especificamente o tubo desejado. Além disso, mantenha o tubo dentro de um aquecedor de bloco seco para tubos a 37 °C. Quando o solvente evaporar, encha o tubo com gás nitrogênio antes de fechá-lo.
  5. Adicione 15 mL de uma solução de clorofórmio:metanol (2:1) aos detritos celulares. Deixe o tubo em constante agitação durante a noite para extrair lipídios não ligados ao covalente da superfície celular micobacteriana.
    NOTA: Se uma plataforma de agitação orbital não estiver disponível, a agitação constante pode ser substituída por agitação manual periódica com a maior frequência possível.
  6. Deixe a mistura descansar por 1h. Com uma pipeta Pasteur, recupere os solventes orgânicos. Cubra um funil de vidro com um papel filtro e filtre os solventes orgânicos e colete-os no mesmo tubo de vidro anteriormente utilizado na etapa 1.3. Use um fluxo de gás nitrogênio para evaporar a fase líquida no tubo. Encha o tubo com gás nitrogênio, feche-o e armazene-o novamente a 4 °C.

2. Extração de ácido micólico por methanólise ácida (Figura 2A)

  1. Adicione 2-5 mL de solução esterificante em um tubo de vidro hermético com uma tampa de parafuso de forro PTFE. Adicione 0,2 g de biomassa de micobactéria no tubo de vidro.
    NOTA: A solução esterificante é formada pela mistura de 30 mL de metanol, 15 mL de tolueno e 1 mL de ácido sulfúrico. As células de micobactérias podem ser retiradas de culturas sólidas ou, mesmo de células delipidadas após a realização da extração de lipídios não covalentes totais de micobactérias (células remanescentes após filtragem na etapa 1.6).
    ATENÇÃO: O tolueno é uma substância inflamável e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
    ATENÇÃO: O ácido sulfúrico é uma substância corrosiva e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
  2. Misture o conteúdo por vórtice. Deixe a mistura ficar dentro de um banho seco a 80 °C durante a noite.
  3. Deixe o tubo esfriar até atingir a temperatura ambiente e, em seguida, adicione 2 mL de n-hexano ao tubo. Misture o conteúdo por vórtice por 30 s e deixe o tubo se instalar até que duas fases claras apareçam.
    ATENÇÃO: o n-hexano é uma substância inflamável, irritante, ambientalmente prejudicial e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
  4. Recuperar a fase superior correspondente à fase n-hexano. Transfira para um novo tubo.
  5. Repita o passo 2.3. Recupere a fase superior novamente e transfira-a para o mesmo tubo usado na etapa 2.4.
  6. Evaporar o conteúdo do tubo usando um fluxo de gás nitrogênio. Encha o tubo com gás nitrogênio, feche-o e armazene-o a 4 °C.

3. Extração de ácido micolico por saponificação e metilação (Figura 2B)

  1. Arranhe 0,2 g de micobactérias de uma mídia sólida e adicione a um tubo de vidro com uma tampa de parafuso PTFE.
  2. Adicione 2 mL de solução metanol-benzeno (80:20) contendo hidróxido de potássio de 5%. Misture o conteúdo por vórtice. Aqueça a mistura por 3h a 100 °C.
    ATENÇÃO: O benzeno é uma substância inflamável, cancerígena e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
  3. Deixe o tubo esfriar até a temperatura ambiente. Adicione 20% de ácido sulfúrico para acidificar as amostras para alcançar pH = 1.
  4. Adicione 3 mL de éter de dietil. Misture suavemente o conteúdo com vórtice.
  5. Que as duas fases se formem se estabelecendo. Recupere a fase do éter de dietil e transfira para um novo tubo. Repita o passo de lavagem por um total de três vezes.
  6. Lave o extrato de éter de dietil com 2 mL de água destilada e transfira a parte superior correspondente ao éter de dietil para um novo tubo. Repita o passo de lavagem por um total de três vezes.
  7. Adicione 2 g de sulfato de sódio anidro sobre o extrato de éter de dietil para secá-lo.
  8. Filtre a suspensão. Evaporar o conteúdo usando um fluxo de gás nitrogênio.
  9. Para realizar a etapa de metilação, dissolva 3 g de N-nitroso-N-metil ureia em uma solução pré-reformada formada por 45 mL de éter dietilo e 9 mL de 40% KOH em água destilada.
    ATENÇÃO: N-nitroso-N-metilurea é uma substância tóxica, irritante, cancerígena e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
  10. Transfira o supernatante (diazometano) para um novo frasco resfriado em gelo contendo pelotas de hidróxido de potássio (aproximadamente 30 g).
    NOTA: Se o supernaspe não for usado imediatamente, pode ser armazenado a -20 °C por uma máxima de 1h.
    ATENÇÃO: As pelotas de hidróxido de potássio são uma substância irritante e corrosiva. Este material deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual apropriados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrílho).
    ATENÇÃO: O diazometano é altamente tóxico e potencialmente explosivo. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar com vidro de segurança usando equipamentos de proteção individual apropriados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
  11. Adicione 2 mL da solução éter contendo diazometano, obtido na etapa 3.10, no extrato de éter dietil seco que contém ácidos micólicos, obtidos na etapa 3.8. Incubar por 15 minutos em temperatura ambiente.
  12. Evaporar a suspensão a 40 °C. Encha o tubo com gás nitrogênio, feche-o e armazene os lipídios metilados a 4 °C.
    NOTA: Evaporar o diazometano da solução éter sob a capa de fluxo laminar, até que o éter perca a cor amarela.

4. Análise de cromatografia de camada fina (TLC)

  1. Saturar a câmara TLC de vidro. Para isso, cubra uma das paredes da câmara TLC com um pedaço de papel filtro e deixe que ela esteja em contato com a fase móvel composta pela mistura de solventes. Coloque o volume restante do solvente na parte inferior da câmara TLC.
    NOTA: A parte inferior da câmara TLC deve ser coberta por pelo menos 1 cm da fase móvel. Nos experimentos atuais, foram utilizadas diferentes fases móveis para o desenvolvimento dos TLCs. Eles consistiam de 85 mL de n-hexano mais 15 mL de éter dietil; 100 mL de diclorometano; 90 mL de clorofórmio, 10 mL de metanol e 1 mL de água; 30 mL de clorofórmio, mais 8 mL de metanol, e 1 mL de água; 60 mL de clorofórmio, mais 35 mL de metanol, e 8 mL de água; Clorofórmio de 95 mL mais 5 mL de metanol; e 90 mL de éter de petróleo (60-80 °C) mais 10 mL de éter de ditila.
    NOTA: No TLC bidimensional, use n-hexano:acetona (95:5) na primeira direção três vezes, e use um único desenvolvimento com tolueno:acetona (97:3) na segunda direção para analisar a composição do ácido mcólico. Para analisar os PIMs, use clorofórmio:metanol:água (60:30:6) na primeira direção uma vez, e use clorofórmio:ácido acético:metanol:água (40:25:3:6) na segunda direção. Para analisar o PDIM e o AG, utilize o éter de petróleo (60-80 °C): acetato etílico (98:2) na primeira direção três vezes, e utilize um único desenvolvimento com éter de petróleo (60-80 °C): acetona (98:2) na segunda direção.
    ATENÇÃO: O éter de diethyl é uma substância potencialmente tóxica e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
    ATENÇÃO: O diclorometano é uma substância potencialmente tóxica e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
    ATENÇÃO: O éter de petróleo é uma substância inflamável, ambientalmente prejudicial e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
    ATENÇÃO: O ácido acético é uma substância inflamável e corrosiva em potencial. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
    ATENÇÃO: O acetato de etila é uma substância inflamável e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
    ATENÇÃO: A acetona é uma substância inflamável e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
  2. Feche a câmara TLC para saturar por pelo menos 20 minutos. Enquanto isso, dissolva os lipídios presentes no tubo de vidro em 0,2-1 mL de clorofórmio.
    NOTA: O volume utilizado para dissolver os lipídios pode ser modificado dependendo da concentração desejada ou esperada da amostra.
  3. Aplique 10 μL de cada suspensão usando um tubo de vidro capilar diretamente na placa TLC e deixe a amostra secar por 5 minutos à temperatura ambiente.
    NOTA: As amostras devem ser aplicadas na parte inferior da placa, deixando 1 cm de cada lado. As amostras devem ser separadas uma da outra por pelo menos 0,5 cm. Uma vez que a amostra é aplicada na placa, os tubos podem ser evaporados novamente com gás nitrogênio e armazenados a 4 °C para uso posterior.
  4. Insira a placa na câmara TLC saturada que contém a fase móvel. Permita que a fase móvel passe pelo TLC.
    NOTA: Qualquer movimento aplicado na câmara TLC afeta o solvente em funcionamento na placa e afeta a mobilidade lipídica. No caso de realizar tlc bidimensionais, duas câmaras TLC são necessárias para conter ambos os sistemas de elução.
  5. Retire a placa da câmara TLC quando o solvente atingir 1 cm de distância da extremidade superior da placa. Deixe a placa sob fluxo laminar até que a sílica esteja totalmente seca.
    NOTA: No caso de analisar a composição do ácido mórclico, utilizando n-hexano e diethyl-éter (85:15), repita as etapas 4.4 e 4,5 vezes mais, até executar a fase móvel três vezes sobre a placa TLC.
  6. Revelar a placa com a mancha necessária; aqueça a placa, se necessário.
    NOTA: No presente experimento, 15-20 mL das seguintes soluções foram utilizadas para pulverizar as placas TLC: 10% hidratofosfórico de ácido molybdatophosphoric no etanol até que a placa esteja amarela brilhante, seguida pelo aquecimento da placa a 120 °C; 5% no etanol de 20% α-naftol em ácido sulfúrico seguido de aquecimento da placa a 120 °C; Reagente azul de molhênio (1,3% óxido de molbênio em ácido sulfúrico de 4,2 M) até que as bandas de fosfato apareceram ou 1% de anthrone em ácido sulfúrico.
    ATENÇÃO: O hidratofosfórico de umidade é uma substância inflamável e corrosiva. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
    ATENÇÃO: O etanol é uma substância inflamável e perigosa em potencial. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
    ATENÇÃO: 1-Naftil é uma substância inflamável, corrosiva e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
    ATENÇÃO: O reagente de spray azul de molhênio é uma substância corrosiva, tóxica e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).

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Resultados

Com o objetivo de mostrar uma ampla gama de lipídios presentes em diferentes espécies de micobactérias, M. bovis BCG foi selecionado por ser micobactérias ásperas e de crescimento lento. O áspero e rápido crescimento M. fortuitum e M. brumae foram adicionados no procedimento e, finalmente, o morfotipo liso de M. abscesso também foi incluído. Essas quatro espécies nos permitem visualizar um amplo espectro de lipídios derivados de micobactérias, como acitrehaloses (AT), GPLs,...

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Discussão

Um protocolo simples considerado como o método padrão-ouro para a extração de compostos lipídicos não covalentes ligados da parede celular micobacteriana é apresentado. Uma visualização adicional por TLCs unidimensionais dos lipídios extraídos de quatro micobactérias diferentes é mostrada.

Duas misturas combinadas consecutivas de clorofórmio e metanol para recuperar o teor lipídico das células micobacterianas é a mistura de solvente mais utilizada23

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi financiada pelo Ministério da Ciência, Inovação e Universidades da Espanha (RTI2018-098777-B-I00), pelos Feder Funds e pela Generalitat da Catalunha (2017SGR-229). Sandra Guallar-Garrido é beneficiária de um contrato de doutorado (FI) da Generalitat de Catalunya.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic AcidMerck100063CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur
AcetoneCarlo Erba400971NCAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000
AnthroneMerck8014610010Anthrone for synthesis.
BenzeneCarlo Erba426113CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l
Capillary glass tubeMerckBR708709BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark
ChloroformCarlo Erba412653CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L
Dry block heaterJ.P. Selecta7471200
DicloromethaneCarlo Erba412622CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L
Diethyl etherCarlo Erba412672CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L
Ethyl AcetatePanreac1313181211CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO
Ethyl Alcohol AbsoluteCarlo Erba4146072CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L
Glass funnelVidraFOCDURA.2133148 1217/1
Glass tubeVidraFOCVFOC.45066A-16125Glass tube with PTFE recovered cap
MethanolCarlo Erba412722CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L
Molybdatophosphoric acid hydrateMerck51429-74-4CAUTION.
Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3%SigmaM1942-100MLCAUTION.
n-hexaneCarlo Erba446903CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L
n-nitroso-n-methylureaSigmaN4766CAUTION
Orbital shaking platformDDBiolab995018NB-205L benchtop shaking incubator
Petroleum ether (60-80ºC)Carlo Erba427003CAUTION. Petroleum ether 60 - 80°C RPE - For analysis 2.5 L
SprayerVidraFOC712/1
Sodium sulphate anhydrousMerck238597
Sulfuric acid 95-97%Merck1007311000CAUTION. Sulfuric acid 95-97%
TLC chamberMerckZ204226-1EARectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm
TLC plateMerck1057210001TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u
TLC Plate HeaterCAMAG223306CAMAG TLC Plat Heater III
TolueneCarlo Erba488551CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L
VortexFisher Scientific10132562IKA Agitador IKA vórtex 3
1-naphtholSigma-Aldrich102269427CAUTION.

Referências

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