Um método robusto para empacotar colunas C18 RP-nano-HPLC de alta resolução

Resumo

Aqui, apresentamos e avaliamos um protocolo para a confecção de colunas de cromatografia líquida de nanofluxo de fase reversa de baixo custo para caracterização de peptídeos usando fluxos de trabalho proteômicos LC-MS/MS.

Resumo

A alta complexidade prevalente em amostras biológicas requer separações cromatográficas com alta sensibilidade e resolução para serem efetivamente analisadas. Aqui, apresentamos um protocolo robusto, reprodutível e barato para a preparação de colunas de cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa de nanofluxo (RP-HPLC) para separação on-line de peptídeos analíticos antes da introdução e detecção por um espectrômetro de massa em fluxos de trabalho proteômicos tradicionais de baixo para cima. Dependendo do objetivo do experimento e das propriedades químicas dos analitos que estão sendo separados, os parâmetros ideais da coluna podem diferir em seus diâmetros internos ou externos, comprimento, tamanho de partícula, tamanho de poro, química de partículas de fase estacionária e a presença ou ausência de um emissor de eletrospray integrado na ponta. Um sistema interno de empacotamento de colunas não apenas permite a fabricação rápida de colunas com as propriedades desejadas, mas também reduz drasticamente o custo do processo. O protocolo otimizado para empacotar uma coluna de sílica fundida C18 AQ (aquosa) discutido aqui é compatível com uma ampla gama de instrumentos de cromatografia líquida para obter uma separação eficaz de analitos.

Introdução

As colunas de HPLC contribuíram imensamente para a produtividade nas áreas de pesquisa farmacêutica, médica e ambiental 1,2,3,4. Ter acesso a colunas de cromatografia de alta qualidade é uma etapa fundamental no fracionamento de analitos complexos. Na proteômica shotgun, a alta sensibilidade analítica é rotineiramente realizada pelo acoplamento da espectrometria de massa (MS) de ionização por eletrospray (ESI) à cromatografia de nanofluxo 5,6,7,8. A separação eficiente de milhares de peptídeos é fundamental nesta aplicação, pois permite que o espectrômetro de massa identifique e quantifique analitos com alta sensibilidade e resolução.

O campo de empacotamento de colunas para aplicações de espectrometria de massa testemunhou um tremendo crescimento nos últimos anos com avanços na compreensão dos princípios fundamentais de empacotamento de colunas relacionados à morfologia da fase estacionária, interações solvente-partícula e design de hardware, possibilitando a caracterização detalhada de uma ampla gama de biomoléculas em ambientes biológicos complexos 9,10,11,12,13,14 . Os esforços que destacam as considerações práticas no empacotamento de colunas analíticas para fins de LC-MS abriram caminho para que os laboratórios proteômicos desenvolvessem sistemas internos de empacotamento para atender aos seus interesses específicos com a promessa de desempenho máximo 15,16,17,18.

Colunas de nanospray com diâmetros internos na faixa de 50-150 μm e extremidades cônicas são adequadas para fins de ionização por eletrospray. No campo da proteômica shotgun, as separações são normalmente realizadas usando um gradiente de solvente fluindo através de uma fase estacionária apolar compactada, mais comumente sílica ligada à cadeia de carbono hidrofóbica (C8-C30) com tamanhos de partícula variando entre 1,7 a 3,5 μm 19,20,21,22. Os analitos eluidores são emitidos através de um emissor ESI integrado na coluna, o que garante a ionização suave dos analitos da fase de solução para íons gasosos. O acoplamento de colunas LC com ESI-MS avançou significativamente a aplicação da espectrometria de massa em tandem para estratégias proteômicas em ciências biomédicas.

Colunas LC com diâmetros internos estreitos resultam em picos cromatográficos mais estreitos e maior sensibilidade em relação a colunas de microfluxo de diâmetro mais alto e, portanto, são particularmente vantajosas com fluxos de trabalho proteômicos. Embora as colunas LC pré-embaladas disponíveis comercialmente sejam opções atraentes devido à sua conveniência e facilidade de uso, elas podem ser proibitivamente caras e menos flexíveis do que as opções internas. O objetivo deste trabalho é descrever uma abordagem de empacotamento de pasta tecnicamente simples e de baixo custo para preparar colunas de HPLC de fase reversa de diâmetro interno estreito usando capilares de sílica fundida e um sistema de bomba de pressão construído internamente para aplicações proteômicas.

Protocolo

1. Preparação da ponta capilar

1. Usando uma pedra de clivagem cerâmica, corte cerca de 60-70 cm de um capilar de sílica fundida revestido de poliimida com um diâmetro interno (ID) de 75 μm e um diâmetro externo (OD) de 360 μm.
2. Segure o capilar com as mãos aproximadamente no meio de seu comprimento, deixando um espaço de 4-5 cm entre os dedos e aqueça a área no espaço enquanto o gira sobre a chama de uma lâmpada de álcool. Polir a área queimada usando um lenço de papel com baixo teor de fiapos embebido em metanol até que o vidro fique visível. (Figura 1).
   NOTA: 4-5 cm do capilar de sílica fundida revestido com poliimida precisam ser expostos e polidos antes de serem carregados no extrator a laser.
3. Para puxar um emissor em forma de cone para ESI, use um extrator de ponta de laser com configurações especiais de programa de um valor de calor de 300 (equivalente a 2 Watts de potência do laser), uma velocidade de 10 (equivalente a 0.25 mm/s) e um atraso de 180 milissegundos para obter uma ponta de ~ 1-5 μm de diâmetro (Figura 2 e Figura 3A). Carregue a parte polida do capilar no extrator a laser e pressione a tração, resultando em duas colunas capilares vazias prontas para serem embaladas.
   NOTA: A inspeção frequente da ponta em qualquer etapa é feita usando um microscópio. As configurações provavelmente serão diferentes entre os extratores a laser e precisarão ser determinadas empiricamente.

2. Polimerização/condicionamento da ponta

1. Para reter as partículas da fase estacionária no tubo capilar, prepare uma frita porosa a partir de uma mistura de duas soluções de silicato de potássio e formamida. Faça a solução imediatamente antes de usar em um tubo de 2 mL e misture usando um vórtice.
   1. Misture duas soluções de silicato de potássio com proporção de SiO₂ / K₂O de 2,50 (p / p) e 1,65 (p / p) e formamida na proporção de 1: 3: 1 (v / v / v), respectivamente. Por exemplo, misture 100 μL de silicato de potássio com proporção de SiO₂/K₂O de 2,50 (p/p), 300 μL de silicato de potássio com proporção de SiO₂/K₂O de 1,65 (p/p)) e 100 μL de formamida seguida de vórtice. Esta solução irá polimerizar quando aquecida e produzir uma frita porosa.
2. Mergulhe a ponta capilar puxada a laser no licor-mãe claro da suspensão de fritas (não o precipitado) por cerca de 10-20 segundos, permitindo que ela penetre cerca de 5 mm na ponta por ação capilar. Dependendo da largura da ponta, pode ser necessário manter a ponta imersa por mais tempo na solução frita. Geralmente, o tempo de imersão é menor se a ponta for mais larga, pois a solução pode entrar na ponta mais rapidamente.
3. Coloque um ferro de solda quente (ajustado a 350 ° F) ao longo da ponta para iniciar a polimerização da solução de frita enquanto inspeciona o capilar sob o microscópio. Consulte a Figura 3 para ver a ponta puxada antes (Figura 3A) e depois da polimerização (Figura 3B).
4. Para evitar o bloqueio do emissor após a polimerização da frita, mergulhe a ponta da coluna em uma solução de ácido fluorídrico (HF) a 50% por 5 minutos (a configuração é ilustrada na Figura 4). A gravação HF também confere uma geometria plana em forma de cone à coluna, aumentando sua longevidade. Após a gravação em HF, certifique-se de que a ponta da coluna esteja bem lavada, primeiro com neutralizador de HF e depois generosamente com água para proteger contra o contato com o ácido.
   CUIDADO: O HF é um produto químico altamente perigoso e corrosivo. Recomenda-se extremo cuidado durante o manuseio para evitar a exposição. Certifique-se de que o HF seja manuseado em todos os momentos com proteção adequada dentro de um exaustor identificado com uma placa dizendo "Perigo! Toxinas agudas".
   1. Por segurança, use jalecos regulares e antiinflamáveis, além de camadas duplas de luvas de nitrilo e neoprene, durante o manuseio de HF.
      NOTA: É opcional fritar pontas capilares; no entanto, torna a coluna significativamente mais resistente ao entupimento e aumenta sua longevidade. Colunas capilares de sílica fundida vazias com um emissor de eletrospray integrado estão disponíveis comercialmente e podem ser usadas para substituir as etapas 1 e 2, se necessário.

3. Preparação da fase estacionária

1. Suspenda 25-50 mg de partículas de sílica ReproSil-Pur 120 C18-AQ totalmente porosas com tamanho de partícula de 1,9 μm e tamanho de poro de 120 Å em 300 μL de metanol. Pipetar para cima e para baixo por cerca de 20 vezes para garantir uma mistura homogênea das partículas de lama em metanol.
2. Coloque o tubo contendo a suspensão de lama dentro da câmara da célula de pressão de um sistema de bomba de embalagem de coluna construído internamente, que por sua vez é instalado em cima de um agitador magnético, permitindo que as partículas de lama permaneçam em suspensão. Conecte a bomba ao tanque de hélio (<1500 psi) que opera a pressão constante para evitar a interrupção da pasta HPLC durante a embalagem. (Esquema representado na Figura 5).
3. Prenda a tampa da célula de pressão apertando-a no lugar com os parafusos, conforme mostrado na Figura 6A.
   NOTA: É importante apreciar a diferença na operação de uma bomba de HPLC e de uma bomba de embalagem de HPLC. Enquanto o primeiro é projetado para operar a uma taxa de fluxo constante, independentemente da contrapressão exercida pela fase estacionária na coluna, os sistemas de pressão de empacotamento HPLC operam a uma pressão constante para garantir o empacotamento ininterrupto e denso das partículas da fase estacionária em todo o comprimento da coluna capilar.

4. Embalando a coluna com fase estacionária

1. Passe primeiro o fundo da coluna (extremidade aberta não frita) através do encaixe apertado com os dedos na parte superior da bomba de pressão, de modo que a ponta da coluna aponte para cima. Empurre a coluna até tocar a base do frasco contendo pasta e retraia-a 1-2 mm acima da base. Aperte o encaixe com os dedos para prender a coluna na posição.
2. Conecte a bomba de embalagem a um tanque de gás hélio (pressão recomendada < 1500 psi) e ligue-a a uma pressão de ~ 1300 psi. O gás hélio entra na célula de pressão que abriga o frasco contendo a pasta através de uma válvula de três vias. Abra a válvula girando-a lentamente 180° no sentido horário.
   NOTA: Assim que o gás hélio começa a fluir dentro da câmara, ele empurra a pasta do tubo para o capilar. À medida que a pasta passa pela coluna, as partículas são retidas no capilar enquanto o solvente forma uma gotícula de líquido na ponta da coluna ( Figura 6B ).
   1. Se a formação de gotículas de líquido na ponta da coluna for retardada, chame rapidamente a ponta para garantir que esteja aberta. Nesta fase, uma fonte de luz colocada atrás da coluna pode ajudar a observar o progresso do processo de empacotamento (Figura 7). Para uma coluna com um ID de 75 μm, normalmente leva ~ 30-60 minutos para embalar um comprimento de cerca de 30 cm.
   2. Se o fluxo da pasta através da coluna parar ou diminuir, segure o capilar firmemente acima do encaixe apertado da bomba de embalagem e solte-o levemente girando cerca de um quarto de volta (pode ser ouvido um som sibilante de despressurização).
      NOTA: Isso permite que a coluna seja reposicionada sem a necessidade de despressurizar completamente a bomba.
   3. Agora reposicione suavemente a coluna movendo-a para cima e para baixo e, em seguida, reaperte o encaixe com os dedos, certificando-se de que a coluna não esteja tocando a base do frasco. Isso garante um fluxo uniforme da pasta através do capilar em todos os momentos.
   4. Se a medida acima mencionada não retomar a embalagem, feche a válvula, ventile a bomba de embalagem, desparafuse a tampa e inspecione a pasta para certificar-se de que não há precipitados. Também é possível que a extremidade da coluna esteja entupida com partículas sólidas de fase estacionária, caso em que cortar um pequeno pedaço da parte de trás do capilar pode ajudar a retomar o fluxo.
3. Embale alguns centímetros a mais do que o comprimento desejado no final da coluna para garantir o empacotamento completo das partículas estacionárias e minimizar a possibilidade de colocar bolhas de hélio na coluna compactada.

5. Acabamento da coluna e confecção da frita

1. Uma vez atingido o comprimento desejado do empacotamento, feche a válvula principal do tanque de gás hélio e aguarde no mínimo 15 minutos para garantir o empacotamento uniforme da coluna e permitir que o sistema se autodespressurize.
   NOTA: Para evitar a introdução de bolhas de He como resultado da sílica fundida vazia no final da coluna, recomenda-se um comprimento de embalagem mais longo. É fundamental que o processo de empacotamento seja continuado mesmo após a parte da coluna visível a olho nu ter sido embalada para levar em conta o comprimento do capilar dentro da câmara de pressão. Além disso, um comprimento de empacotamento mais longo é recomendado nos casos em que é necessário o reposicionamento repetido da coluna, pois isso resulta em menos bolhas de ar e maior eficiência de empacotamento.
2. Despressurize suavemente a câmara girando a válvula 180 graus no sentido anti-horário até sua posição original. Segure a coluna com força, desaperte o encaixe com os dedos e remova a coluna gradualmente. Esta etapa precisa ser feita com muito cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar.
3. Corte a extremidade da coluna em um comprimento de 25,5 cm. Durante a inspeção ao microscópio, use um ferro de solda quente a 350 ° F para remover um comprimento de 0.5 cm da pasta da extremidade traseira da coluna.
   1. Mergulhe a extremidade traseira da coluna na solução de frita restante da etapa 2.1 por cerca de 10 segundos e polimerize-a colocando um ferro de solda quente ao longo da parte de trás da coluna enquanto a inspeciona ao microscópio. A frita traseira garante que as partículas ReproSil-Pur 120 C18-AQ permaneçam na coluna e evita o refluxo durante as lavagens cromatográficas.
      NOTA: A frita na parte de trás da coluna também é opcional, mas torna a coluna mais robusta, como também foi observado para a frita frontal na etapa 2.

Resultados

Para avaliar o desempenho das colunas, 750 ng de digestores de peptídeos trípticos preparados a partir de lisados de células inteiras de células HEK293 foram fracionados on-line usando um capilar de sílica fundida de 25 cm de comprimento e 75 μm de diâmetro interno embalado internamente com partículas a granel de ReproSil-Pur 120 C18-AQ, conforme descrito no protocolo. Antes do carregamento da amostra, a coluna foi lavada com 6 μL de uma mistura de acetonitrila, isopropanol e H<...

Discussão

As estratégias proteômicas modernas dependem de separações cromatográficas de alta qualidade para analisar efetivamente sistemas biológicos complexos. Portanto, as colunas LC de nanofluxo de alto desempenho e custo-benefício são componentes cruciais de um regime de espectrometria de massa em tandem bem-sucedido destinado a caracterizar milhares de proteínas em um único fluxo de trabalho.

Neste estudo, avaliamos o desempenho e a confiabilidade de uma ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
99.99% Formamide acid	Sigma-Aldrich		for making frit
alcohol lamp	Any brand		For providing heat
Brechbuehler helium pressure cell	BioSurplus		for packing column
Ceramic column cutter	Any brand		for cutting silica capillary
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥ 99%	Sigma-Aldrich		Stored in a flammable cabinet
Formamide  ≥99.5%	Sigma-Aldrich		for making frit
Hydrofluoric acid (HF) (50%)	Fisher Scientific		for opening the emitter after polymerization
KASIL (Potassium Silicate Solution)	PQ Corporation		for making frit
Orbitrap Fusion Lumos	Thermo Fisher Scientific		for MS data acquisition
P2000 Laser Puller	Sutter		for pulling capillary
PTFE 1/16" Ferrule 0.4 mm ID (long) for Tube Fitting	Chromre	214104	For bomb setting
Reprosil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 um, 1g	Dr. Masch GmbH	r119.aq.0001	Batch 5910
Soldering	Any brand		For initiating polimerization
Stainless Steel Pipe Fitting, Hex Coupling, 1/4 in. Female NPT	Swagelok	SS-4-HCG	for bomb setting
TSP075375 fused silica, 75 µm ID x 360 µOD	MOLEX/Polymicro	1068150019	For column tubing
Ultimate 3000 UHPLC	Dionex		HPLC type