Colheita e Desagregação: Um passo negligenciado na pesquisa de métodos de biofilme

Resumo

Este artigo detalha métodos que demonstram três técnicas comuns de coleta e desagregação de biofilmes em dois tipos de superfície, testes de robustez de um método de colheita e informações mínimas a serem consideradas ao escolher e otimizar técnicas de colheita e desagregação para aumentar a reprodutibilidade.

Resumo

Os métodos de biofilme consistem em quatro etapas distintas: o crescimento do biofilme em um modelo relevante, o tratamento do biofilme maduro, a colheita do biofilme da superfície e a desagregação dos aglomerados e a análise da amostra. Das quatro etapas, a colheita e a desagregação são as menos estudadas, mas ainda assim críticas quando se considera o potencial de viés de teste. Este artigo demonstra técnicas de colheita e desagregação comumente utilizadas para biofilme cultivado em três superfícies diferentes. As três técnicas de coleta e desagregação de biofilmes, obtidas a partir de uma extensa revisão da literatura, incluem vórtice e sônica, raspagem e homogeneização, raspagem, vórtice e sônicação. Dois tipos de superfície são considerados: duro não poroso (policarbonato e vidro borossilicato) e poroso (silicone). Além disso, fornecemos recomendações para as informações mínimas que devem ser incluídas ao relatar a técnica de colheita seguida e um método de acompanhamento para verificar o viés.

Introdução

A definição de biofilme evoluiu ao longo das últimas décadas e engloba a associação microbiana com uma variedade de superfícies biológicas e/ou não biológicas, inclusão de componentes nãocelulares1 que apresentam crescimento diferente e expressão ^genética2 dentro de uma matriz. O biofilme fornece proteção contra estresses ambientais, como a secagem, pode tornar a ação de desinfetantes químicos menos eficaz, resultando na sobrevivência de micróbios. Os sobreviventes dentro de um biofilme podem potencialmente fornecer uma fonte de microrganismos patogênicos que são uma preocupação de saúde ^pública3.

Os métodos de biofilme são compostos por quatro etapas, crescimento, tratamento, amostragem (colheita e desagregação) e análise. O crescimento, o primeiro passo, onde o usuário determina as condições de crescimento do organismo, temperatura, mídia, etc., é o mais considerado e relatado na literatura de biofilme4,5,6,7. A etapa de tratamento avalia os antimicrobianos (por exemplo, desinfetantes) para determinar sua eficácia, seja contra um biofilme ^maduro3,8,9 ou o antimicrobiano pode ser incorporado à superfície para determinar a capacidade do produto de prevenir ou reduzir o crescimento do biofilme10. O terceiro passo, amostragem, inclui etapas para colher o biofilme da superfície em que estava crescendo e desagregar os aglomerados removidos3,8,11. A quarta etapa, análise, pode incluir contagem de células viáveis, microscopia, medidas de fluorescência, desfechos moleculares e/ou uma avaliação de componentes ^matricia8,9. A avaliação dos dados fornece informações sobre o resultado de um experimento. Dos quatro, a amostragem é muitas vezes o passo mais negligenciado porque presume que a técnica de colheita de biofilme e/ou desagregação escolhida é 100% eficaz, muitas vezes sem ^{verificação11}.

Suspensões planctônicas de bactérias, muitas vezes consideradas homogêneas, requerem vórtice simples antes da análise. Os biofilmes, no entanto, são comunidades complexas compostas por microrganismos (procarióticos e/ou eucarióticos), exopolysacarídeos, proteínas, lipídios, DNA extracelular e células hospedeiras12. Passos além dos métodos tradicionais de cultura microbiológica planctônica são necessários para colher adequadamente o biofilme de uma superfície e, em seguida, desagregá-lo em uma suspensão celular única homogênea. Uma extensa revisão da literatura (informações não incluídas nesta publicação) demonstrou que a escolha da técnica de remoção e desagregação depende de uma série de fatores, incluindo espécies presentes no biofilme, superfície a que o biofilme está ligado (não poroso ou poroso), acessibilidade a superfícies de crescimento (cupom facilmente removível ou destruição física de aparelhos nos quais o biofilme está crescendo), geometria da superfície (área e forma), densidade de biofilme em superfícies de crescimento e equipamentos de laboratório disponíveis.

Quando o biofilme é colhido de uma superfície, a suspensão celular resultante é heterogênea. Se essa suspensão não uniforme for enumerada com precisão, ela deve ser desagregada em células individuais. As placas viáveis assumem que uma unidade formadora de colônias se origina de uma bactéria. Se os agregados de biofilme forem colocados no meio de crescimento, é impossível distinguir células individuais que poderiam levar a estimativas imprecisas. Por exemplo, durante o teste de eficácia desinfetante, se um tratamento remover o biofilme de forma muito eficaz de uma superfície em comparação com o controle, a redução do tronco pode parecer artificialmente grande em comparação com o controle. Por outro lado, um desinfetante químico que fixa biofilme em uma superfície em comparação com o controle parecerá ter uma redução menor do ^tronco11. Esse tipo de cenário pode levar a uma interpretação tendenciosa dos dados experimentais.

Em preparação para a publicação, uma revisão da literatura determinou que abordagens comuns à colheita e desagregação do biofilme incluem raspagem, swabbing, sonicação, vórtice ou uma combinação destes. A raspagem é definida como remoção física de biofilme de superfícies com uma vara estéril, espátula ou outra ferramenta. Swabbing refere-se à remoção de biofilme de superfícies com uma vara de ponta de algodão ou outro material absorvente fixo. A sônica refere-se à interrupção do biofilme das superfícies através de ondas ultrassônicas distribuídas através da água. Vortexing refere-se ao uso de uma batedeira para alcançar um vórtice líquido da amostra dentro de um tubo. A homogeneização utiliza lâminas rotativas para tesourar aglomerados de biofilme colhidos em uma única suspensão celular. Neste artigo, apresentamos três métodos de colheita e desagregação para dois tipos de superfície diferentes, duros/não porosos e porosos.

Uma lista de informações mínimas recomendadas que os pesquisadores devem incluir nos métodos seções de publicações é fornecida. Esperamos que a inclusão dessas informações permita que outros pesquisadores reproduzam seu trabalho. Não há um método perfeito de colheita e desagregação, portanto, recomendações de como verificar a técnica também são fornecidas.

Três métodos comuns para colher e desagregar biofilme de superfícies comuns de crescimento são demonstrados neste artigo. Essas informações permitirão aos pesquisadores entender melhor a precisão e o viés geral de um método de teste de biofilme. Os métodos descritos são os seguintes: (1) Um biofilme pseudomonas aeruginosa cultivado em cupons de policarbonato (superfície não porosa dura) sob cisalhamento de fluidos elevados no Reator de Biofilme CDC é colhido e desagregado após uma combinação de cinco passos de vórtice e sonicação para alcançar a colheita de biofilme e desagregação (2) A Aeruginosa biofilme cultivado em cupons de vidro borossilicato (superfície não porosa dura) no reator de fluxo de gotejamento sob cisalhamento de baixo fluido é colhido e desagregado usando raspagem e homogeneização (3) Um biofilme Escherichia coli cultivado em tubos de silicone (superfície porosa) é colhido e desagregadoreg usando raspagem, seguido de sonicação e vórtice.

Protocolo

1. Vórtice e sônica

1. Cresça um biofilme P. aeruginosa maduro de 15442 cultivado de acordo com o ASTM Standard E25622.
2. Ao final do período de crescimento de 48 horas, prepare-se para tratar os cupons de biofilme e amostra de acordo com o ASTM Standard E28718
3. Asepticamente insira protetores de respingo autoclaved em tubos cônicos estéreis de 50 mL usando fórceps esterilizados por chamas. Repita para todos os tubos que receberão tratamento. Tubos para cupons de controle não precisam de um protetor de respingo.
4. Remova asepticamente uma haste selecionada aleatoriamente do Reator de Biofilme CDC. Enxágüe cupons para remover células frouxamente anexadas mergulhando suavemente a haste em 30 mL de água tampão estéril.
5. Segure a haste paralela à parte superior do banco, sobre um tubo cônico vazio e estéril de 50 mL e usando uma chave Allen esterilizada por chamas, solte o parafuso definido para soltar um cupom revestido de biofilme no tubo. Repita para o número desejado de cupons. Remova os protetores de respingo e coloque em um recipiente separado para esterilização.
6. Usando uma pipeta sorológica de 5 mL, pipeta lentamente 4 mL do tratamento ou controle nos tubos para que o líquido flua pelo interior da parede do tubo.
7. Toque suavemente na parte inferior do tubo para que quaisquer bolhas de ar sob o cupom sejam deslocadas. Permitir 30 - 60 s entre cada adição.
8. Ao final do tempo de contato especificado, pipeta 36 mL de neutralizador nos tubos na mesma ordem que o tratamento (ou controle) foi aplicado.
   NOTA: O volume final de tratamento combinado e neutralizador é importante para determinar com precisão a densidade do tronco de biofilm.
9. Vórtice cada tubo na configuração mais alta para 30 ± 5 s. Certifique-se de que um vórtice completo seja alcançado.
   NOTA: Deve-se ter cuidado ao emitir cupons pesados, como aço inoxidável em frascos de vidro onde possa ocorrer quebra.
10. Determine o número ideal de tubos por banho e colocação dentro do rack do tubo de ensaio antes de processar amostras reais. Se processar várias amostras, confirme que a temperatura da água no banho sonicating é de 21 ± 2 ^oC.
11. Coloque tubos no rack de tubo suspensos no sonicator desgassed de tal forma que o nível de água no banho seja igual ao nível líquido em tubos. Sonicate a 45 kHz, 100% de potência e função Normal para 30 ± 5 s. Repita os ciclos de vórtice e sônica e termine com um vórtice final (5 ciclos no total).
    NOTA: Estes tubos com o biofilme colhido e desagregado são a diluição ¹⁰⁰ ou 0.
12. Amostra diluída em série em água tamponada. Placa no ágar R2A usando método de revestimento apropriado. Incubar a 36 ± 2 ^oC por 24 h. Conte colônias conforme apropriado para o método de chapeamento usado e dados de registro.

2. Raspagem e homogeneização

1. Cresça um biofilme P. aeruginosa maduro ATCC 15442 de acordo com o ASTM Standard E264713.
2. Configure a estação de amostragem para incluir placa de amostragem, 95% de etanol em um béquer, queimador de álcool, hemostats, ferramenta de remoção de cupom, béquers com água de diluição estéril e tubos de diluição para enxaguar os cupons.
3. Desligue a bomba. Remova uma tampa de canal e use uma ferramenta de remoção de cupom estéril e hemostats para remover o cupom, tomando cuidado para não perturbar o biofilme.
4. Enxágüe o cupom imergindo suavemente, com um movimento fluido, em 45 mL de água de diluição estéril (contida em um tubo de centrífuga de 50 mL). Inverta imediatamente o movimento para remover o cupom.
5. Coloque o cupom em um béquer contendo 45 mL de água de diluição estéril. Raspe a superfície do cupom coberto de biofilme em uma direção descendente por aproximadamente 15 s, usando uma espátula estéril ou raspador. Enxágüe a espátula ou raspadora mexendo-a no béquer. Repita o processo de raspagem e lavagem 3-4 vezes, garantindo a cobertura completa da superfície do cupom.
6. Enxágüe o cupom segurando-o em um ângulo de 60° sobre o béquer estéril e tubos de 1 mL de água de diluição estéril sobre a superfície do cupom. Repita para um total de 5 enxágues. O volume final no béquer é de 50 mL.
   NOTA: O volume final de tratamento combinado e neutralizador é importante para determinar com precisão a densidade do tronco de biofilm.
7. Substitua cada tampa do canal à medida que os cupons forem removidos.
8. Trabalhando no armário de biossegurança, homogeneize a amostra de biofilme raspada. Conecte uma sonda homogeneizadora estéril ao homogeneizador, coloque a ponta da sonda no líquido, ligue o homogeneizador e aumente até 20.500 rpm.
9. Homogeneize a amostra para 30 s. Abaixe os RPMs e desligue o homogeneizador.
10. Higienize a sonda entre amostras de biofilme homogeneizando um 9 mL de diluição estéril em branco a 20.500 rpm por 30 s como descrito acima. Homogeneize um tubo de 9 mL de 70% de etanol para 30 s, desprende a sonda e deixe ficar no tubo de etanol por 1 min. Homogeneize dois espaços adicionais de diluição.
    NOTA: Pode ser utilizado um teste homogeneizador descartável para cada amostra.
11. Diluir as amostras em água tamponada. Placa no ágar R2A usando o método de revestimento apropriado. Incubar placas a 36 ± ^2oC por 24 h, contar colônias conforme apropriado ao método de chapeamento utilizado e registrar dados.

3. Raspagem, vórtice e sônica

1. Cresça um biofilme Escherichia coli maduro ATCC 53498 em tubos de cateter de ^silicone10.
2. Prepare materiais de amostragem: tubos de lavagem, tubo de centrífugas estéril, placa de Petri estéril vazia, hemostato de aço inoxidável esterilizado e tesoura, temporizador e régua.
3. Com a bomba pausada, use 70% de etanol para limpar a parte externa da tubulação. Meça 2 cm a partir da extremidade, evitando a área anexada ao conector, e marque a tubulação para determinar os locais de corte.
4. Com a tesoura esterilizada da chama, corte o tubo na marca de 2 cm e coloque o segmento em placa de Petri estéril vazia. Limpe a tubulação com 70% de etanol e reconecte a extremidade distal ao tubo de resíduo.
5. Enxágüe o segmento de tubos para remover células planctônicas. Com fórceps esterilizados pela chama, mergulhe suavemente o segmento de tubos em 20 mL de água de diluição estéril e, em seguida, remova imediatamente. Coloque o segmento em 10 mL de neutralizador.
6. Com fórceps esterilizados de chama, segure o segmento de tubulação e raspe com vara de aplicador de madeira estéril até que todas as áreas internas do tubo tenham sido raspadas. Ocasionalmente enxágue a vara nos 10 mL de neutralizador e coloque o segmento de volta no tubo de amostra. O segmento de tubulação raspada é a diluição de ¹⁰⁰ ou 0.
   NOTA: O volume final de tratamento combinado e neutralizador é importante para determinar com precisão a densidade do tronco de biofilm.
7. Vórtice cada tubo na configuração mais alta para 30 ± 5 s. Coloque o tubo no rack de tubo suspenso no sonicator de tal forma que o nível de água no banho seja igual ao nível líquido nos tubos. Sonicate a 45 kHz, 100% de potência e função Normal por 30 ± 5 segundos. Repita os ciclos de vórtice e sônica e termine com um vórtice final.
   NOTA: Este tubo com o biofilme colhido e desagregado é a diluição de ¹⁰⁰ .
8. Diluir as amostras em água tamponada. Placa no Tryptic Soy Agar usando o método de revestimento apropriado.
9. Incubar placas a 36 ± 2 ^oC por 24 h. Conde colônias conforme apropriado para o método de chapeamento usado, registrar dados e calcular a média aritmética.

Resultados

Validação/Confirmação de um Método de Colheita
Vários estudos realizados em nosso laboratório examinaram a capacidade de vórtice e sônica para colher efetivamente o biofilme cultivado no reator biofilme (ASTM E2562)² utilizando o Método Único do Tubo (ASTM E2871)⁸.

Um biofilme P. aeruginosa ATCC 15442 foi cultivado de acordo com aSTM E25622 em cupons de vidro borossilicato. Após 48 ...

Discussão

Informações mínimas para métodos de colheita e desagregação
Para criar dados reprodutíveis de biofilme em toda a comunidade científica, é imprescindível que os autores incluam o máximo de detalhes possível em relação a cada uma das etapas de crescimento, tratamento, amostragem e análise de um método de biofilme. A padronização dos métodos de biofilme tem auxiliado nesse esforço, pois permite ao pesquisador referenciar um método específico e quaisquer modificações relevantes. No...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical vials	Thermo Scientific	339652
100 mL glass beakers	Fisher Scientific	FB102100
5 mL serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-12D	For adding treatment to vials containing coupons.
50 mL serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-14C	For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time.
Applicator sticks	Puritan	807
Hemostats	Fisher Scientific	16-100-115
Metal spatula	Fisher Scientific	14-373
PTFE policemen	Saint-Gobain	06369-04
S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool	IKA	4446700	For homogenization of biofilm samples.
Scissors	Fisher Scientific	08-951-20
Silicone Foley catheter, size 16 French	Medline Industries	DYND11502
Silicone tubing, size 16	Cole-Parmer	EW96400-16
Splash Guards	BioSurface Technologies, Inc.	CBR 2232
T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser	IKA	3737001	For homogenization of biofilm samples.
Tubing connectors	Cole-Parmer	EW02023-86
Ultrasonic Cleaner	Elma	TI-H15
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	SI-0236
Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder	Scientific Industries	SI-V506