In situ Exploração de Murine Megacaryopoiesis usando Microscopia eletrônica de transmissão

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para analisar a ultraestrutura dos megacaiócitos in situ usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM). As medulas ósseas murinas são coletadas, fixas, embutidas em resina epóxi e cortadas em seções ultrafinas. Após a coloração de contraste, a medula óssea é observada sob um microscópio TEM a 120 kV.

Resumo

A diferenciação e a maturação dos megacaiócitos ocorrem em estreita associação com os componentes celulares e extracelulares da medula óssea. Esses processos são caracterizados pelo aparecimento gradual de estruturas essenciais no citoplasma de megacaitosto, como um núcleo poliploide e polilobulado, uma rede interna de membrana chamada sistema de membrana demarcação (DMS) e os grânulos densos e alfa que serão encontrados em plaquetas circulantes. Neste artigo, descrevemos um protocolo padronizado para o estudo ultraestrutural in situ de megacariócitos murinas utilizando microscopia eletrônica de transmissão (TEM), permitindo a identificação de características-chave que definem seu estágio de maturação e densidade celular na medula óssea. As medulas ósseas são lavadas, fixas, desidratadas no etanol, embutidas em resina plástica e montadas para geração de seções transversais. Seções semifinas e finas são preparadas para observações histológicas e TEM, respectivamente. Este método pode ser usado para qualquer célula de medula óssea, em qualquer instalação EM e tem a vantagem de usar pequenos tamanhos de amostra permitindo a combinação de várias abordagens de imagem no mesmo mouse.

Introdução

Os megacariócitos são grandes células poliploides especializadas, localizadas na medula óssea, responsáveis pela produção de^{plaquetas 1}. Elas se originam de células-tronco hematopoiéticas através de um intrincado processo de maturação, durante o qual os precursores de megacaitos aumentam progressivamente de tamanho, enquanto passam por extensas alterações morfológicas concomitantes no citoplasma e núcleo². Durante o amadurecimento, os megacaitos desenvolvem uma série de elementos estruturais distintos, incluindo: um núcleo polilobulado, invaginações da membrana superficial que formam o sistema de membrana de demarcação (DMS), uma zona periférica desprovida de organelas cercadas pela rede citoesqueletal baseada em actina, e inúmeras organelas, incluindo α-granulos, granulos densoss, lysosomes, e múltiplos complexos de Gol. No nível ultraestrutural, uma grande modificação observada é a compartimentação citoplasmática em regiões discretas delimitadas pelo DMS³. Esse extenso fornecimento de membranas alimentará a extensão de longos processos citoplasmados na fase inicial de produção de plaquetas, que depois se remodelará em plaquetas dentro da circulação. Qualquer defeito durante a diferenciação e maturação do megacaito pode afetar a produção de plaquetas em termos de contagem de plaquetas e/ou função plaqueta.

A microscopia eletrônica de transmissão de camada fina (TEM) tem sido a abordagem de imagem escolhida há décadas fornecendo ultraestrutura de alta qualidade de megacaiócitos que moldaram nossa compreensão da fisiologia da trombopoiese^4,5. Este artigo se concentra em um método TEM padronizado que permite capturar o processo de biogênese plaquetária que ocorre in situ dentro do microambiente nativo da medula óssea, que também poderia servir de base para analisar qualquer tipo de célula de medula óssea. Fornecemos exemplos ultraestruturais do desenvolvimento de megacaiócitos de imaturos a totalmente maduros, que estendem processos citoplasmicos à microcirculação dos sinusoides⁶. Descrevemos também um procedimento fácil para quantificar os diferentes estágios de maturação de megacariote, instruindo sobre a capacidade de regeneração e produção de plaquetas da medula óssea.

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as normas europeias 2010/63/UE e o Comitê de Ética dos Experimentos Animais da Universidade de Estrasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). O protocolo é mostrado esquematicamente na Figura 1.

1. Coleta e fixação da medula óssea (Figura 1A)

ATENÇÃO: Este procedimento inclui substâncias cancerígenas, mutagênicas e/ou tóxicas e é realizado sob uma capa de extração química. Use equipamentos de proteção adequados, como luvas e óculos de proteção.

1. Prepare a solução fixativa composta por 2,5% de glutaraldeído no tampão de cacodilato (ver Arquivo Suplementar).
2. Coleta de medula óssea
   1. Use camundongos adultos C57BL/6 de ambos os sexos de 12 a 18 semanas de idade. Eutanize os camundongos por asfixia de CO₂ e luxação cervical.
   2. Com um par de tesouras finas, corte a pele ao redor da coxa e use pinças para descascar a pele. Retire a extremidade da pata e corte entre o quadril e a coxa. Desprender a tíbia do fêmur cortando a articulação do joelho e removendo tecido aderente nas tíbias e fêmures usando um bisturi.
   3. Remova as epífitas com uma lâmina afiada. Enquanto segura o fêmur com pinças, use uma seringa de 5 mL cheia de tampão de cacodilato com uma agulha de 21 G para lavar a medula óssea em um tubo de 15 mL preenchido com tampão de cacodilato de 2 mL. Para isso, insira o bisel da agulha na abertura da medula óssea e pressione lentamente o êmbolo até que a medula seja expelida.
3. Fixação da medula óssea por rápida imersão em fixação.
   1. Imediatamente após a descarga, use uma pipeta de plástico para transferir o cilindro de medula óssea para 1 mL de solução fixativa de glutaraldeído fresco (previamente preparado em 1,1) por 60 minutos à temperatura ambiente.
      NOTA: Para preservar o tecido, certifique-se de que todo o processo, desde a dissecção óssea até a etapa de fixação, seja concluído em menos de 10 minutos. Para a fixação, certifique-se de que a solução fixada esteja à temperatura ambiente para evitar choque térmico.

2. Incorporando medula óssea em agarose

NOTA: O tecido de medula não é suficientemente coeso para manter sua integridade durante as diferentes etapas de lavagem e o material pode ser facilmente perdido. Para superar esse problema, a medula é coberta por um gel de ágar antes da desidratação.

1. Prepare a solução agarose conforme descrito no Arquivo Suplementar.
2. Lave a medula fixa da seção 1.3 no tampão de cacodilato e transfira-a cuidadosamente para um slide de vidro usando uma pipeta de plástico. Usando uma pipeta quente, aplique rapidamente uma gota de ágar líquido de 2% no cilindro de medula óssea.
   NOTA: O ágar se solidifica rapidamente durante o resfriamento. Para garantir uma cobertura homogênea da medula óssea, a solução de ágar deve ser mantida aquecida até que seja depositada no slide.
3. Coloque rapidamente o deslizamento no gelo até que o ágar se solidifique (1-2 min).
4. Sob um microscópio, use uma lâmina afiada para cortar e descartar as extremidades do cilindro de medula óssea devido a uma possível compressão tecidual nessas áreas. Transfira os blocos de medula em tubos de microcentrifuus de 1,5 mL contendo 1 mL de tampão de cacodilato.

3. Incorporando medula óssea em resina

ATENÇÃO: Os componentes da resina são tóxicos; alguns são cancerígenos e devem ser tratados com cuidado sob uma capa de extração química. Use equipamentos de proteção adequados, como luvas e óculos de proteção. O tetroxida de ósmio é altamente volátil à temperatura ambiente e seus vapores são muito prejudiciais aos olhos, nariz e garganta. Antes de ser descartado, 2% de tetroxida de ósmio deve ser neutralizado adicionando o dobro do volume de óleo vegetal.

1. Prepare a resina epóxi conforme descrito no Arquivo Suplementar.
2. Incorporação de resina
   NOTA: Mantenha as amostras nos mesmos tubos de microcentrifuuuge durante incubações em banhos sucessivos de ósmio, acetato de urânyl e etanol. Aspire os supernantes com uma pipeta Pasteur. O volume de solução utilizado para cada banho deve ser igual a pelo menos 10x o volume da amostra.
   1. Corrija os blocos com 1% de osmium no tampão de cacodilato por 1h a 4 °C, lave uma vez no tampão de cacodilato e, em seguida, uma vez em água destilada.
   2. Colora com acetato de 4% de urano em água destilada por 1h, lave duas vezes em água destilada.
   3. Desidratar através de uma série classificada de etanol em água destilada: 4 vezes em 75% de etanol por 5 min, seguido por 3 vezes em 95% etanol por 20 min e depois 3 vezes em 100% etanol por 20 min. Nesta etapa, retire uma seringa de resina epóxi do congelador.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado em 100% de etanol por 1h.
   4. Para obter infiltração uniforme e polimerização de resina epóxi dentro da medula, incubar primeiro os blocos em 2 banhos sucessivos de óxido de propileno por 15 minutos.
   5. Adicione uma mistura de 1:1 de óxido de propileno 100% e resina epóxi e incubar por 1h. Coloque as amostras em um agitador rotativo lento à temperatura ambiente.
   6. Adicionar resina 100% epóxi deixe a amostra para incubação durante a noite sob agitação.
   7. Adicione resina 100% epóxi para incubação de 2 h, ainda sob agitação.
   8. Sob um microscópio, coloque os blocos de medula em moldes planos de silicone. Orientar amostras para permitir a secção transversal subsequente de toda a medula óssea. Encha os moldes com resina epóxi e coloque-os a 60 °C por 48 h.
      NOTA: Todas as soluções (exceto etanol e óxido de propileno) são filtradas através de filtro de 0,22 μm para evitar a contaminação das amostras. Para garantir a polimerização adequada da resina, evite bolhas enquanto encha os moldes.

4. Secção ultrathin(Figura 1B)

NOTA: A transmissão EM requer seções de tecido fino através das quais os elétrons podem passar gerando uma imagem de projeção do interior das células, estrutura e organização de organelas internas (grânulos, órticulum endoplasmático, Golgi) e o arranjo de membranas celulares intracelulares.

1. Monte o bloco de amostra em um suporte ultra-microtóm mestom. Coloque no suporte da amostra. Corte as amostras em 45° para remover o excesso de resina ao redor do tecido com um cortador de fresagem de diamante rotativo ou tungstênio.
2. Monte as amostras no ultramicroome com uma lâmina de faca de diamante equipada com um tanque de água. Corte seções transversais de 500 nm e 100 nm de espessura para análises histológicas e TEM, respectivamente. Colete seções flutuantes na superfície da água com um laço.
3. Deposite a seção de 500 nm de espessura em um escorregador de vidro e seções de 100 nm de espessura em 200 grades de cobre de malha fina com um filtro de papel por baixo. Prepare cinco grades para uma condição: manche duas grades primeiro e mantenha as três grades restantes como backup, se necessário.

5. Mancha azul toluidina para histologia

NOTA: As seções de coloração para histologia são importantes por três razões: 1) para garantir que o tecido seja realmente cortado e não a resina, 2) para verificar a qualidade da inclusão, e 3) para avaliar rapidamente a amostra de medula. Se isso não estiver correto, corte mais fundo no bloco.

1. Seque as seções semifinas deslizem sobre uma placa de calor (60 °C).
2. Adicione 1% de toluidina azul/1 % de borato de sódio em água destilada nas lâminas e aqueça em uma placa quente (60 °C) por 1-2 min. Lave os slides com água destilada e deixe secar na placa de calor.
3. Monte seções em tampas com uma gota de poli (methacrilato-co-metil metacrilato de butil) meio de montagem e examine sob um microscópio leve.

6. Manchas de metais pesados para observação TEM(Figura 1C)

NOTA: Para o contraste, o lado superior das grades são invertidos em gotas de 100 μL de cada banho sucessivo com um laço. Antes de ser utilizado, cada solução é filtrada por 0,22 μm. Remova o excesso de líquido entre cada banho, entre em contato suavemente com o lado da grade em um papel filtro.

1. Mancha com acetato de 4% de uranyl em água destilada por 5 min.
2. Lave 3 vezes em água destilada por 5 minutos.
3. Mancha com citrato de chumbo por 3 minutos.
4. Lave 3 vezes em água destilada por 5 minutos.
5. Deposite as grades pelo lado inferior em contato com o papel do filtro para deixá-las secar.
   NOTA: Metais pesados reagem na presença de dióxido de carbono. Para minimizar os precipitados, evite o deslocamento do ar durante o contraste, não fale, mantenha o ambiente calmo e desligue o ar-condicionado.

7. TEM (Figura 1E)

NOTA: As seções são introduzidas em um microscópio TEM e examinadas a 120 kV.

1. Primeiro examine as seções em baixa ampliação (< 500x) para apreciar o aspecto geral da preparação (ausência de orifício na resina, dobras/compressão nas seções, precipita devido à coloração).
2. Em seguida, examine as seções em maior ampliação (~ 2000x permitindo distinguir o estágio de maturação). Conte manualmente os megacaiócitos de cada etapa de maturação sobre seções transversais inteiras (consulte Resultados Representativos sobre como identificar visualmente cada estágio).
   NOTA: Cada quadrado das grades é definido como uma área para exame (o que equivale a 16000 μm2 para 200 grades de cobre de malha).
3. Para avaliar o número de megacaiócitos, quantifique apenas os quadrados que estão totalmente cobertos com uma seção. Para isso, use um modelo baseado na triagem de faixas. Observe uma primeira gama de quadrados de uma extremidade da seção para outra, depois outra faixa da mesma forma, etc. Usando este procedimento, tela total e sistematicamente toda a seção transversal da medula quadrada por quadrado.
4. Para cada quadrado, marque o número de megacaiócitos estágio I, II ou III.
   NOTA: Ampliações mais elevadas são necessárias para analisar os grânulos, a organização DMS, o tamanho dos territórios citoplasmáticos e o núcleo polilobulado.

Resultados

Histologia da medula óssea
A observação da histologia azul toluidina da medula óssea sob um microscópio leve é fundamental para analisar rapidamente a arquitetura geral do tecido em termos de, por exemplo, compactação tecidual, continuidade de microvasos e o tamanho e forma de megacaiócitos (Figura 1D). É realizado antes de seções ultrathin para determinar a necessidade de corte mais profundo no bloco de medula óssea. Devido ao seu tamanho gi...

Discussão

O exame direto dos megacaitos em seu ambiente nativo é essencial para entender a megacariopoiese e a formação de plaquetas. Neste manuscrito, fornecemos um método de microscopia eletrônica de transmissão combinando descarga e fixação da medula óssea por imersão, permitindo dissecar in situ as características de morfologia de todo o processo de morfogênese de megacaiócito ocorrendo na medula óssea.

A lavagem da medula óssea é um passo crítico desse método, pois o suce...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30)	Ladd Research Industries, USA	21310
Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar	Electron Microscopy Sciences, USA	1670-B
CaCl2 Calcium chloride hexahydrate	Merck, Germany	2083
Copper grids 200 mesh thin-bar	Oxford Instrument, Agar Scientifics, England	T200-CU
Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate	Merck, Germany	8.20670.0250
Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA)	Ladd Research Industries, USA	21340
Double Edge Stainless Razor blade	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	EM-72000
Ethanol absolut	VWR International, France	20821296
Filter paper, 90 mm diameter	Whatman, England	512-0326
Flat embedding silicone mould	Oxford Instrument, Agar Scientific, England	G3533
Glutaraldehyde 25%	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	16210
Heat plate Leica EMMP	Leica Microsystems GmbH, Austria	705402
Histo Diamond Knife 45°	Diatome, Switzerland	1044797
JEOL 2100 Plus TEM microscope	JEOL, Japan	EM-21001BU
Lead citrate - Ultrostain 2	Leica Microsystems GmbH, Austria	70 55 30 22
LX-112 resin	Ladd Research Industries, USA	21310
MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate	Sigma, France	M2393-100g
Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	15320
Nadic Methyl Anhydride (NMA)	Ladd Research Industries, USA	21350
Osmium tetroxide 2%	Merck, Germany	19172
Propylene oxide (1.2-epoxypropane)	Sigma, France	82320-250ML
Saline injectable solution 0.9% NaCl	C.D.M Lavoisier, France	MA 575 420 6
Scalpel Surgical steel blade	Swann-Morton, England	.0508
Sodium tetraborate - Borax	Sigma, France	B-9876
Sucrose	Merck, Germany	84100-1KG
Syringe filter 0.2µm	Pall Corporation, USA	514-4126
Toluidine blue	Ladd Research Industries, USA	N10-70975
Trimmer EM TRIM2	Leica Microsystems GmbH, Austria	702801
Ultramicrotome Ultracut UCT	Leica Microsystems GmbH, Austria	656201
Uranyl acetate	Ladd Research Industries, USA	23620