Fabricação de uma nanocelulose cristalina incorporada tinta biomaterial agarose para cultura de célula de mastro derivada da medula óssea

Resumo

Este protocolo destaca um método para avaliar rapidamente a biocompatibilidade de uma nanocelulose cristalina (CNC)/agarose tinta biomaterial de hidrogel composto com células de mastro derivadas da medula óssea em termos de viabilidade celular e expressão fenotípica dos receptores de superfície celular, Kit (CD117) e receptor IgE de alta afinidade (FcεRI).

Resumo

A bioimpressão tridimensional (3D) utiliza compósitos à base de hidrogel (ou tintas biomateriais) que são depositados em um padrão, formando um substrato sobre o qual as células são depositadas. Como muitas tintas biomateriais podem ser potencialmente citotóxias para células primárias, é necessário determinar a biocompatibilidade desses compósitos de hidrogel antes de sua utilização em processos dispendiosos de engenharia de tecidos 3D. Alguns métodos de cultura 3D, incluindo a bioimpressão, exigem que as células sejam incorporadas em uma matriz 3D, dificultando a extração e análise das células para mudanças na viabilidade e expressão biomarcadora sem provocar danos mecânicos. Este protocolo descreve como prova de conceito, um método para avaliar a biocompatibilidade de um composto de agarose incorporado de nanocelulose cristalina (CNC), fabricado em um sistema de cultura de 24 poços, com células de mastro derivadas da medula óssea (BMMCs) usando assins de fluxo citométrico para viabilidade celular e expressão biomarcadora.

Após 18 h de exposição à matriz CNC/agarose/D-mannitol, a viabilidade do BMMC foi inalterada medida pela permeabilidade do iodeto de propídio (PI). No entanto, os BMMCs cultivados no substrato CNC/agarose/D-mannitol pareciam aumentar ligeiramente sua expressão do receptor IgE de alta afinidade (FcεRI) e do receptor de fator de células-tronco (Kit; CD117), embora isso não pareça depender da quantidade de CNC no composto bioink. A viabilidade dos BMMCs também foi avaliada após uma exposição de curso temporal a andaimes de hidrogel que foram fabricados a partir de uma tinta biomaterial comercial composta de nanocelulose fibrilar (FNC) e alginato de sódio utilizando uma bioimpressora de extrusão 3D. Durante um período de 6-48 h, os substratos FNC/alginate não afetaram negativamente a viabilidade dos BMMCs conforme determinado por ensaios de citometria de fluxo e microtiter (XTT e desidrogenase de lactato). Este protocolo descreve um método eficiente para selecionar rapidamente a compatibilidade bioquímica das tintas biomateriais do candidato para sua utilidade como andaimes 3D para semeadura pós-impressão com células de mastro.

Introdução

O recente interesse em sistemas de cultura 3D e bioimpressão 3D tem focado a atenção em hidrogéis e compósitos de hidrogel. Esses compósitos servem como biomimética viscosa, mas porosa, e podem ser compostos de até 99% de teor de água em peso, o que é comparável aos tecidos biológicos1,2,3. Essas características dos compósitos de hidrogel permitem assim o crescimento das células sem afetar sua viabilidade e função. Um desses compostos é a nanocelulose cristalina (CNC), que tem sido usada como material de reforço em compósitos de hidrogel, andaimes celulares no desenvolvimento de implantes biomateriais, e em culturas bidimensionais (2D) e 3D in vitro cell ^culture4,5. Na maioria das vezes, as matrizes compostas de CNC não são abertamente citotóxicas para células epiteliais córneas ^humanas6, células epiteliais intestinais7, células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea ^humana8, ou células semelhantes a ^neurônios9. No entanto, a atividade metabólica e a proliferação de células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea humana diminuem em correlação com o aumento da viscosidade dos compósitos de nanocelulose à base de madeira, sugerindo que a composição da matriz deve ser cuidadosamente testada para seus efeitos deletérios nas funções ^celulares8.

Da mesma forma, a CNC pode induzir respostas inflamatórias em macrófagos após a internalização, o que pode ter sérias consequências nos sistemas de cultura de células imunes ^3D10,11. Na verdade, há muito poucos dados disponíveis sobre como a CNC pode influenciar outras respostas de células imunes, particularmente respostas inflamatórias alérgicas que são iniciadas por células de mastro. As células de mastro são leucócitos granulados que expressam o receptor IgE de alta afinidade, FceRI, responsável por ativar respostas inflamatórias a alérgenos. Sua proliferação e diferenciação são o fator célula-tronco dependente (SCF), que liga o receptor de tyrosina, Kit. As células de mastro são derivadas de células progenitoras de medula óssea que entram na circulação e, posteriormente, migram periféricamente para dispersar-se onipresentemente em todos os tecidos ^humanos12. Como as células de mastro funcionam em um ambiente de tecido 3D, elas são uma célula imune ideal para estudar processos imunológicos em modelos in vitro de tecido 3D. No entanto, até o momento, não há nenhum modelo de tecido 3D in vitro viável contendo células de mastro.

Devido à natureza altamente sensível das células de mastro e sua propensão a obter respostas pró-inflamatórias a estímulos externos, é necessária uma consideração cuidadosa dos constituintes da matriz 3D e o método bioimpressora de introduzir células de mastro no andaime 3D, como discutido mais adiante. Construções teciduais podem ser biofabricadas a partir de duas grandes categorias de biomateriais, ou seja, bioinks e tintas biomateriais. A distinção reside no fato de que os bioinks são compostos de hidrogel carregados de células, enquanto as tintas biomateriais são compósitos de hidrogel que são desprovidos de células, como definido por Groll et ^al.13,14. Assim, construções 3D impressas com bioinks contêm células pré-incorporadas dentro da matriz de hidrogel, enquanto construções 3D impressas com tintas biomateriais precisam ser semeadas com células pós-impressão. A biofabricação de andaimes de cultura de bioinks/tintas biomateriais à base de hidrogel é mais comumente realizada usando bioimpressores 3D de extrusão, que extrusem a tinta bioink/bioma material por meio de um bico de microescala sob pressão através de um pistão pneumaticamente ou mecanicamente ^conduzido14. Bioimpressoras de extrusão fabricam andaimes 3D depositando o bioink em padrões transversais 2D que são sequencialmente empilhados uns sobre os outros em uma abordagem "de baixo para cima".

Para ser compatível com a bioimpressão de extrusão, a tinta bioink/biomaterial à base de hidrogel deve possuir propriedades tioxrópicas (desbastação), pelas quais os polímeros de hidrogel constituinte do fluxo de tinta bioink/biomaterial como um fluido através de um bocal de microcanal quando submetido a estresse de cisalhamento, mas revertam para um estado viscoso, semelhante a gel, após a remoção do estresse da ^tesoura15 . Devido ao seu alto teor de água, os polímeros de bioinks/tintas biomateriais à base de hidrogel devem ser interligados, física ou covalentemente, para manter a arquitetura e a integridade estrutural da estrutura bioimpressora 3D. No caso de bioinks carregados de células, as células são diretamente submetidas a tensões químicas durante o processo de crosslinking. O processo de extrusão de células encapsuladas dentro da matriz de hidrogel bioink também submete as células ao estresse de tesoura, o que pode levar à redução da viabilidade e/ou morte celular. Uma vez que o modelo de tecido 3D tenha sido bioimpresso, é difícil discriminar entre os níveis de citotoxicidade provocados pela própria matriz de hidrogel e os processos de extrusão e crosslinking, respectivamente. Isso é particularmente desafiador no contexto dos andaimes 3D onde as células são pré-incorporadas dentro da matriz de hidrogel, dificultando a remoção das células para análises subsequentes, o que seria prejudicial à viabilidade das células de mastro.

Uma abordagem mais suave para gerar construções de tecido 3D contendo células de mastro envolve a semeadura das células em andaimes de tinta biomaterial porosa pré-impressos a partir de uma suspensão de cultura celular, o que aproveita a capacidade inata das células de mastro de migrar da circulação para tecidos periféricos. Os benefícios dessa abordagem de semeadura celular são duas vezes: (i) as células de mastro não são submetidas a tensões de tesoura e químicas dos processos de extrusão e crosslinking, respectivamente, e (ii) as células podem ser facilmente removidas do andaime 3D após a exposição por lavagem suave para análise sem afetar negativamente sua viabilidade. O benefício adicional de semear e analisar a viabilidade celular das células de mastro em andaimes de hidrogel bioimpresso 3D, em oposição aos discos de hidrogel 2D é que os andaimes hidrogel bioimpressores 3D recapitulam características topográficas microescalas de tecidos in vivo , que não estão presentes em discos hidrogel 2D a granel. Esta abordagem é uma abordagem adequada, rápida e econômica para determinar os efeitos citotóxicos potencialmente catastróficos das matrizes de hidrogel bioink candidatas em células de mastro, bem como outras células imunológicas, antes do investimento em experimentos dispendiosos de engenharia de tecidos 3D.

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Protocolo

NOTA: Este protocolo é composto por cinco seções: (1) isolamento da medula óssea do rato e diferenciação de células de mastro derivadas da medula óssea do rato (BMMCs), (2) fabricação de cnc/agarose/d-mannitol hidrogel em um sistema de 24 poços e cultura de BMMCs nos substratos, (3) remoção de BMMCs dos substratos de hidrogel CNC/Agarose/D-mannitol e análise da viabilidade e expressão biomarcadora utilizando citometria de fluxo, (4) Bioimpressão 3D de andaimes de hidrogel a partir de uma nanocelulose fibrilar comercialmente disponível (FNC)/tinta biomaterial composto alginato de sódio, e (5) cultura de BMMCs em andaimes de hidrogel de alginato FNC/sódio e análise da viabilidade usando citometria de fluxo, XTT e desidrogenase de lactato (LDH) de microtirogenase (LDH) microtirogenase.

1. Geração da cultura BMMC

NOTA: Os camundongos foram eutanizados por asfixia por _CO2 após anestesia isoflurane. A tíbia e o fêmur foram isolados, e toda a medula óssea foi colhida. Todos os estudos em animais foram realizados de acordo com o Conselho Canadense de Diretrizes e Políticas de Cuidados com Animais com aprovação do Comitê de Cuidados e Uso animal da Ciência da Saúde para a Universidade de Alberta.

1. Prepare o meio de cultura RPMI-1640 completo adicionando os suplementos listados na Tabela 1 às concentrações finais indicadas. Ajuste o pH do médio para 7,4-7,6 usando NaOH, esterilize o filtro usando um filtro de garrafa de uso único (tamanho de poros de 0,2 μm) e armazene a 4 °C no escuro por até 2 meses.
2. Obtenha fêmures de camundongos de acordo com os protocolos e procedimentos do Comitê de Cuidados com Animais da Universidade local.
   NOTA: Neste estudo, os fêmures foram isolados de camundongos C57BL/6, mas qualquer cepa pode ser usada se for relevante para o estudo.
3. Usando uma tesoura, remova a pele e o músculo da articulação do quadril e, em seguida, puxe suavemente o fêmur torcendo ligeiramente para fora do soquete do quadril (Figura 1). Cuidado para não quebrar a cabeça femoral. Corte a tíbia do fêmur na fabella medial usando uma tesoura. Retire a pata cortando um pouco acima do calcâneo e descarte.
4. Usando um bisturi, remova a pele e a cartilagem dos pedaços do fêmur e da tíbia. Usando uma tesoura, faça um corte limpo em cada extremidade do fêmur e tíbia, expondo a medula óssea vermelha dentro. Se necessário, remova a fíbula neste momento, mas note que ela pode ajudar na manipulação da tíbia durante a lavagem da medula óssea.
5. Prepare uma agulha de 26 G com uma seringa luer-lock de 5 mL e preencha com aproximadamente 5 mL de mídia completa preparada como descrito acima.
   NOTA: Neste ponto, o RPMI incompleto sem os aditivos também pode ser usado para economizar em reagentes.
6. Segurando o fêmur ou tíbia com fórceps, insira a agulha em uma extremidade do osso e pressione suavemente a seringa. Segure o osso sobre um tubo cônico estéril de 50 mL e injete suavemente aproximadamente 5 mL de meio no osso, aplicando alguma pressão. Observe pedaços de medula óssea cair do outro lado do osso como fitas vermelhas finas e no tubo cônico.
7. Gire os aspirados e resuspend em meio completo, ou transfira diretamente para um frasco de cultura de tecido estéril T175 ^cm2 contendo 50 mL de meio RPMI-1640 completo. Mantenha os aspirados em meio RPMI-1640 completo com interleucina recombinante do mouse 30 ng/mL (IL)-3.
8. Depois de 1 dia, observe as culturas sob um microscópio leve. A cultura será composta por uma população heterogênea de células de diferentes formas e tamanhos e pedaços ainda maiores de medula óssea. Alimentar culturas celulares adicionando 15 mL de meio fresco a cada 3-5 dias usando o meio RPMI-1640 completo como descrito acima, e garantir que a densidade celular nunca exceda 1 × ¹⁰⁶ células/mL. Uma vez por semana, gire as células a 200 × g por 5 min à temperatura ambiente, resuspenque em meio RPMI-1640 completo fresco e divida 1,4 em 50 mL de média em frascos T175 frescos.
9. Após 4 semanas, determine a pureza celular medindo a expressão superficial dos receptores CD117 (Kit) e FceRI por citometria de fluxo como descrito abaixo (seção 3.2).
   NOTA: Após 4 semanas, 99% das células devem ser duplamente positivas para CD117 (Kit) e FcεRI.
10. Com 4 semanas e em diante, mantenha os BMMCs com 20 ng/mL de IL-3 em meio RPMI-1640 completo. Com aproximadamente 6 semanas, as células pararão de se dividir e não precisarão mais de divisão. Alimente as culturas a cada 3-5 dias, pelota as células por centrifugação uma vez por semana, e resuspend em meio RPMI-1640 completo fresco.

2. Fabricação dos substratos de hidrogel CNC/agarose/D-mannitol e cultura BMMC

1. Em uma garrafa de vidro, adicione 0,2 g de pó de agarose ao soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) (2% c/v) a um volume final de 10 mL, e ferva por 1 min a 100 °C para dissolver.
2. Dissolva 2,5 g de pó CNC em PBS a um volume final de 10 mL para preparar uma mistura de 25% c/v.
3. Dissolva 2 g de pó CNC em PBS a um volume final de 10 mL para preparar uma mistura de 20% w/v, e diluir serialmente a mistura de 20% w/v para preparar misturas CNC de 10, 5 e 2% de w/v.
4. Aqueça as misturas de 25, 20, 10, 5 e 2% w/v CNC a 37 °C por 10 min (Figura 2A).
5. Adicione 0,46 g de D-mannitol à solução agarose quente (4,6% c/v) e dissolva.
6. Misture as misturas pré-aquecidas de 25, 20, 10, 5 e 2% w/v CNC-PBS com a solução agarose/D-mannitol em tubos cônicos separados a uma proporção de 1:1 para produzir concentrações finais de CNC de 12,5, 10, 5, 2,5 e 1% w/v nas misturas de hidrogel.
7. Trabalhando rapidamente, adicione 500 μL/bem das soluções acima preparadas na etapa 2.6 em quadruplicar a uma placa de cultura de 24 poços, e deixe ficar 30 minutos à temperatura ambiente para facilitar a polimerização (Figura 2B).
8. Cuidadosamente camada 1000 μL da suspensão BMMC a uma densidade de 1,1 × ¹⁰⁶ células/mL em cima dos substratos de hidrogel com um micropipettor, e evite tocar o gel com a ponta da pipeta, pois isso danificará a superfície do gel e gerará partículas.
9. Incubar os BMMCs nos substratos de hidrogel em uma incubadora estéril (5% de _CO2, atmosfera umidificada) a 37 °C por 18 h.

3. Análises citométricas de fluxo

1. Análise citométrica de fluxo de viabilidade do BMMC via exclusão de PI
   1. Remova cuidadosamente o meio de cultura contendo BMMCs da parte superior do CNC/agarose/D-mannitol, evitando o gel, e transfira as células para um tubo de microfuça de 1,5 mL.
   2. Lave os BMMCs duas vezes com PBS (pH 7.4) contendo 0,5% w/v de g de soro bovino albumina a 300 × g por 5 min em temperatura ambiente, e resuspenque em 180 μL de PBS-0,5% w/v BSA a uma densidade final de 1,5 × ¹⁰⁶ células/mL. Transfira as células para uma placa de fundo redondo 96.
      NOTA: Esterilize todas as soluções PBS-0,5% w/v BSA duas vezes usando um filtro de seringa do tamanho de um poro de 0,2 μm e armazene a 4 °C.
   3. Adicione 20 μL de PBS-0,5% w/v BSA, ou 10x PI (100 μg/mL) preparado em PBS-0,5% w/v BSA, às células a uma concentração final de 10 μg/mL, e incubar para 1 h a 4 °C ou 15 min em temperatura ambiente no escuro. Adquira dados de fluorescência usando um citômetro de fluxo equipado com um laser de íon argono (488-514 nm) e filtro de bandpass para permitir a detecção de emissão de fluorescência a 578 nm. Adquira 20.000 eventos por amostra a uma taxa de fluxo de 30 μL/min à temperatura ambiente. Analise os dados descritos abaixo (seções 3.2.7-3.2.10).
2. Análise citométrica de fluxo de BMMCs para Kit (CD117) e expressão do receptor de superfície FcεRI
   1. Remova cuidadosamente o meio de cultura contendo BMMCs da parte superior do CNC/agarose/D-mannitol, evitando o gel, e transfira as células para um tubo de microfuça de 1,5 mL.
   2. Lave bmmcs duas vezes com PBS filtrado-0,5% BSA a 300 × g para 5 min em temperatura ambiente, e resuspend em 180 μL de PBS contendo 0,5% w/v BSA (1,5 × ¹⁰⁶ células/mL). Transfira as células resuspended para uma placa de fundo redondo de 96 poços.
   3. Adicione 20 μL de soluções de trabalho de anticorpos de 10x às células para alcançar uma concentração final de 0,06 μg/mL de CD117 (c-Kit)-phycoerythrin (PE) e 0,06 μg/mL de FcεRIα-alophycocyanin (APC), respectivamente.
      NOTA: As soluções de trabalho de anticorpos de 10x devem ser preparadas em PBS esterilizado por filtro-0,5% w/v BSA.
   4. Adicione 20 μL de soluções de trabalho de controle de isótipo de 10x contendo qualquer um dos conjugados isótipo de rato IgG2b κ-PE ou hamster armênio IgG isótipo-APC para separar poços contendo células que não foram manchadas com nenhum dos conjugados anticorpo-fluorohore na etapa 3.2.3.
      NOTA: Os controles isótipos, o isótipo de rato IgG2b κ isótipo-PE e o controle do isótipo IgG do hamster armênio-APC servem para controlar a fixação não específica de anticorpos ao BMMC. Como os BMMCs não expressam altos níveis de RFC, raramente há fluorescência de fundo elevada detectada com anticorpos de controle de isótipo. Prepare as soluções de trabalho de controle de isótipo 10x em PBS esterilizado por filtro-0,5% w/v BSA.
   5. Incubar a placa de fundo redondo de 96 poços por 1h a 4 °C no escuro.
   6. Lave as células adicionando 200 μL de pbs fresco-0,5% w/v BSA buffer para cada poço, e centrífuga a 300 × g por 5 min à temperatura ambiente. Repita o passo de lavagem mais uma vez. Remova cuidadosamente o supernatante sem tocar na pelota celular; deixar para trás algum supernatante para garantir que a pelota celular permanece imperturbável.
   7. Após a lavagem, resuspend células em 100 μL de 0,5% w/v BSA, 0,05% w/v azida de sódio em PBS (pH 7.4) que foi filtrada duas vezes com um filtro de seringa tamanho poros de 0,2 μm. Adquira dados de fluorescência nos canais do detector PE e APC utilizando um citômetro de fluxo, conforme descrito acima na etapa 3.1.3.
   8. Analise dados usando software capaz de visualizar e analisar arquivos de dados citométricos de fluxo com a extensão ".fcs".
   9. Inicie a análise plotando a dispersão para a frente (FSC) ao longo do eixo x e dispersão lateral (SSC) ao longo do eixo y, e portão para a população celular conservada com uma faixa FSC de _log10 1.5-5.0 e uma faixa SSC de _log10 0.75-3.25 nas células não tratadas e não manchadas, como mostrado na Figura 3A(i),(ii).
      NOTA: Isso serve para garantir que detritos celulares com baixos valores FSC e SSC sejam eliminados da análise. As células de mastro são normalmente células muito granulares (SSC) e grandes (altas FSC) quando comparadas a outros tipos de células imunológicas, como monócitos e linfócitos.
   10. Em seguida, gere os perfis de pontos FSC vs. SSC e perfis de histogramas de amostras não tratadas que foram manchadas com os controles de corante, anticorpos ou isótipo, e obtenha intensidade média de fluorescência (MFI) nos canais PE ou APC de acordo com o espectro de emissão do conjugado ou corante específico de anticorpos fluoróforo utilizado. Aplique o mesmo conjunto de portões e parâmetros a todas as amostras de BMMC incubadas com diferentes substratos CNC/Agarose/D-mannitol e manchadas com os controles, anticorpos ou corantes correspondentes; obter MFIs.
       NOTA: Essencialmente, os lotes de pontos FSC vs SSC das amostras manchadas não tratadas devem ser indistinguíveis de amostras não tratadas/não manchadas, obtidas na etapa 3.2.9, para garantir que o procedimento de coloração não altere o tamanho da célula (medido pelo FSC) ou a granularidade (medida pelo SSC) (Figura 3A(i)).
   11. Calcular MFIs médios e erro de média (SEM) para cada amostra de 4 experimentos independentes seguidos pela geração de gráficos usando um pacote de software de análise estatística.
   12. Prepare sobreposições de histograma no software de análise de dados citométricos de fluxo (Figura 3B, 4A(ii),B(ii)).

4.3D Bioimpressão dos substratos de hidrogel de alginato FNC/sódio

NOTA: A bioimpressora 3D utilizada neste estudo é um sistema pneumático-extrusão equipado com dois cabeçotes de impressão independentes controlados pela temperatura. A tinta biomaterial usada para bioimpressão 3D dos andaimes de hidrogel é formulada de (a) nanocelulose fibrilar altamente hidratada (FNC), que é morfologicamente semelhante ao colágeno, (b) alginato de sódio e (c) D-mannitol. É fornecida como uma suspensão de hidrogel estéril em cartuchos de 3 mL aos quais os bocais de bioimpressão estéreis de bioimpressão (22, 25 ou 27 G) podem ser anexados.

1. Use este protocolo com os cabeçoteiros e impressos à temperatura ambiente, onde a temperatura ambiente é de 20-25 °C.
2. Armazene os cartuchos de tinta de biomateriais a 4 °C para manter a estabilidade do composto de hidrogel. Antes de iniciar a bioimpressão 3D, remova um cartucho (3 mL) da geladeira e permita que ele se equilibre à temperatura ambiente.
3. Instalação de um cartucho Bioink na Bioimpressora 3D INKREDIBLE+
   1. Remova as tampas de extremidade azul do cartucho de tinta biomaterial de 3 mL (Figura 5B(i)) e afixe um bocal de bioimpressão cônica estéril de 22 G (azul) na extremidade do frasco de bloqueio de luer do cartucho Bioink.
      NOTA: É essencial fixar o bocal de bioimpressão cônica desejado ao cartucho de bioink antes de instalar o cartucho e realizar as etapas subsequentes de calibração, pois a falha em fazê-lo resultará em calibração inadequada do eixo z da bioimpressora 3D.
   2. Conecte a tubulação de alimentação de pressão de ar para o cabeçoso de impressão 1 (PH1, à esquerda) à extremidade oposta do cartucho e insira o cartucho com o bocal de bioimpressão cônica anexado no slot vertical de PH1 (Figura 5A(ii)).
   3. A seatir firmemente o cartucho em PH1 com o bocal de bioimpressão cônica estendendo-se abaixo do cabeçoso de impressão. Aperte o parafuso no sentido horário ph1 até que o dedo esteja apertado para travar o cartucho Bioink no lugar. Observe que a bioimpressão 3D pode ser realizada com PH2 deixado vazio.
4. Calibrando os eixos x-y-z da bioimpressora 3D
   1. Ligue a bioimpressora 3D e inicie o software bioimpressora em um PC conectado à bioimpressora 3D através de um cabo USB 2.0.
   2. No software, clique no botão CONNECT para sincronizar o software com a bioimpressora 3D.
      NOTA: A sincronização é bem sucedida quando as luzes de diodo ultravioleta emitindo luz do cabeçotes acendem e desligam, e o ventilador do filtro HEPA é ligado novamente. O software deve ser sincronizado com a bioimpressora 3D antes de colocar os eixos bioimpressoras e a calibração do ponto de partida, conforme descrito nas etapas subsequentes.
   3. Observe quatro opções no menu principal de controle da bioimpressora 3D: (i) PREPARE BIOPRINT, (ii) BIOPRINT, (iii) UTILITIES MENU e (iv) TELA DE STATUS. Selecione a opção PREPARAR BIOPRINT e, em seguida, role para baixo e selecione a opção HOME AXES .
      NOTA: A bioimpressora 3D moverá o conjunto de cabeçote para trás e para a esquerda para calibrar os eixos y e x, respectivamente. Depois disso, com os cabeços de impressão pausados na posição mais à esquerda, o bioimpressora aumentará a impressão até que o interruptor de calibração do eixo z (localizado no bloco impresso) faça contato com o bocal de bioimpressão cônico instalado no cabeçote de impressão 1
   4. Após a calibração bem sucedida dos eixos x-y-z , observe a ligeira redução do impresso e a realocação dos cabeçotas de impressão para acima do ponto central do bloco impresso (Figura 5A(i)).
5. Calibração do ponto de partida da bioimpressora para bioimpressão em placas de 24 poços
   1. Remova uma placa de cultura de 24 poços estéreis de sua embalagem de plástico selada, e marque um ponto do ponto central do poço D1 na parte inferior da placa com um marcador permanente. Retire a tampa da placa e coloque a placa de cultura de 24 poços na impressão com bem D1 localizado no canto esquerdo dianteiro do bloco impresso.
   2. No menu de controle principal, selecione O MENU UTILITÁRIOS e selecione MOVE AXIS. Mova os cabeçotas de impressão em incrementos de 1 mm ao longo dos eixos x e y até que o bocal de bioimpressão cônica do PH1 esteja diretamente sobre o ponto marcado sob bem D1. Se necessário, ajuste a posição do bocal de bioimpressão cônica sobre o ponto, movendo os cabeçotas de impressão em incrementos de 0,1 mm.
   3. Registo as coordenadas x e y do bocal de bioimpressão cônica quando diretamente sobre o centro do poço D1, conforme indicado na tela do painel de controle da bioimpressora 3D.
      NOTA: No caso da bioimpressora INKREDIBLE+ 3D utilizada aqui, as coordenadas x e y são as seguintes: x : -46,5 e y : -27,5. Estas coordenadas servem como ponto de partida no centro do poço D1 para bioimpressão em uma placa de 24 poços.
   4. Em seguida, levante o bloco de impressão em incrementos de 1 mm até que a parte inferior do poço D1 esteja quase tocando o bocal de bioimpressão cônica instalado no cabeçote de impressão 1. Ajuste o movimento do impresso em incrementos de 0,1 mm, se necessário (Figura 5A(ii)." Em seguida, no MENU UTILITÁRIOS, selecione a opção CALIBRAÇÃO DO EIXO Z e selecione e confirme ainda mais a opção CALIBRAÇÃO STORE Z .
   5. Retorne ao menu principal e selecione a opção PREPARAR BIOPRINT . Role para baixo e selecione a opção CALIBRATE Z .
      NOTA: A bioimpressora 3D agora baixará a impressão impressa ao executar com sucesso a calibração do eixo z (Figura 5A(iii)."
6. Atualizando o arquivo G-code de placa de 24 poços com coordenadas corretas de ponto de partida
   1. Abra o arquivo de código geométrico de placa de 24 poços (G-code) fornecido no software bioimpressora (Arquivo Suplementar 1).
      NOTA: Este arquivo de código G de 24 poços codifica a impressão de construções retilineares de 2 camadas 5 x 5 x 1 mm em cada poço (Figura 5C(i),(iii)). Os arquivos de código G fornecidos podem ser usados com qualquer software de bioimpressão 3D.
   2. Observe que a linha 1 do arquivo de código G lê G0 X-50.0 Y-33.5 ; Posição central de D1 bem. Atualize as coordenadas x e y na Linha 1 com os valores obtidos na etapa 4.5.3, ou seja, a Linha 1 deve agora ler G0 X-46.5 Y-27.5 ; Posição central de D1 bem. Salve o arquivo com um novo nome.
      NOTA: Este procedimento serve para calibrar o arquivo de código G para que a impressão comece no centro do poço D1 com base nas coordenadas x,y da bioimpressora 3D específica que está sendo usada. Esta abordagem pode ser usada para calibrar o arquivo G-code de placa de 24 poços para impressão com qualquer bioimpressora 3D de extrusão. Para efeitos deste estudo, apenas a metade esquerda da placa de 24 poços, ou seja, poços A1-3, B1-3, C1-3 e D1-3 foram impressos. Um arquivo de código G separado que codifica a impressão de construções retilineares de 2 camadas 5 x 5 x 1 mm em uma grade 3 x 4 também é fornecido (Arquivo Suplementar 2, Figura 5C(ii)).
7. Ajuste da pressão de extrusão para Printhead 1 (PH1)
   1. Certifique-se de que a bomba pneumática esteja bem conectada à porta de entrada de ar traseira da bioimpressora 3D INKREDIBLE+ e ligue a bomba pneumática.
   2. Puxe o botão de controle para a frente localizado no lado direito da bioimpressora INKREDIBLE+ 3D.
      NOTA: O botão de controle dianteiro ajusta a pressão para PH1, enquanto o botão de controle traseiro ajusta a pressão para PH2.
   3. Observe os medidores de pressão digital para PH1 e PH2 localizados na frente da bioimpressora cada uma leitura próxima de 0 kPa. Gire lentamente o botão de controle dianteiro no sentido horário até que a pressão indicada no medidor esquerdo para PH1 atinja 12 kPa (Figura 5A(iii)."
   4. Coloque um papel de tecido dobrado ou um pedaço de filme impermeável, selando sob o bocal de impressão do cartucho instalado, tomando cuidado para não tocar no bocal de impressão.
   5. No menu de controle principal da bioimpressora 3D, selecione PREPARAR BIOIMPRESS.
   6. Navegue e selecione ATIVAR O PH1. Note que a tinta biomaterial começa a extrusão do bocal de impressão. Se necessário, aumente a pressão de extrusão girando o botão de controle no sentido horário até que a tinta biomaterial seja extrudada em um filamento contínuo e registe a nova configuração de pressão. Trabalhe rapidamente para evitar o desperdiçondo tinta biomaterial.
   7. Selecione Desligar o PH1 para impedir a extrusão da tinta biomaterial, remova o papel de tecido ou filme contendo a tinta biomaterial extrudada do bloco impresso e feche a porta da bioimpressora.
      NOTA: A bioimpressora 3D ligará automaticamente a fonte de pressão de ar ao PH1 durante a impressão, conforme instruído pelo arquivo de código G.
8. Bioimpressão 3D de substratos de hidrogel retilinear em formato de placa de 24 poços
   1. No menu de controle principal da bioimpressora 3D, selecione UTILITIES MENU. Navegue e selecione DESATIVAR O SD PRINT, que permitirá que o software bioimpressora transmita arquivos de código G para a bioimpressora 3D para impressão.
   2. Clique no botão LOAD no software bioimpressora e selecione o arquivo de código G de placa de 24 poços atualizado salvo na etapa 4.6.2.
   3. No painel de controle à direita no software, selecione a guia PRINT PREVIEW e clique no botão IMPRIMIR para iniciar a bioimpressão em D1.
      NOTA: Se usar o arquivo de código G da placa G de 3 x 4, a bioimpressão terminará em bem A3 da placa de 24 poços (Figura 5C(ii),D, em oposição ao bem A6 se uma placa completa de 24 poços for impressa.
   4. Após a conclusão da bioimpressão dos construtos retilineares, cubra a placa de 24 poços com sua tampa e mova-a para um armário de biossegurança classe II.
   5. Mergulhe cada construção retilítila em duas gotas de solução _cacl2 estéril de 50 mM (Figura 5B(ii)), e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos.
      NOTA: Isso serve para cruzar ionicamente as cadeias de polímeros de alginato com os íons ^Ca2+ e permitir que os construtos retilícleos mantenham sua integridade estrutural.
   6. Aspire cuidadosamente a solução _CaCl2 de cada construção e enxágue uma vez em 1 mL de 1x PBS (pH 7.4) para remover o excesso de _CaCl2 (Figura 5D).
   7. Para evitar a desidratação dos construtos de hidrogel bioimpresso, mantenha os construtos retilinear 3D bioimpressos em PBS 1x fresco até que os BMMCs estejam prontos para serem semeados nas construções (Figura 5D).

5. Incubação de BMMCs em andaimes retilineares bioimpressos 3D e testes de viabilidade

1. Incubação de BMMCs em andaimes de hidrogel retilinear bioimpresso 3D
   1. Alíquotas de BMMCs nos andaimes retilícleos bioimpressos 3D bioimpressos em triplicado por quatro durações diferentes, por exemplo, 6, 18, 24 e 48 h, de modo que todos os tratamentos terminem simultaneamente. Use BMMCs semeados em poços vazios em triplicado para as mesmas durações que controles não tratados.
   2. Transfira as BMMCs de um frasco de cultura T175 ^cm2 para um tubo cônico estéril de 50 mL, e pelota os BMMCs a 200 × g por 5 min à temperatura ambiente.
   3. Resuspenque a pelota em 50 mL de meio RPMI completo fresco contendo 20 ng/mL de IL-3, e calcule a densidade celular viva contando uma alíquota de BMMCs manchados de trippan azul usando um hemacytómetro.
   4. Com base na densidade celular calculada na etapa 5.1.3, prepare uma alíquota de 6 mL da suspensão BMMC a uma densidade final de 1 × ¹⁰⁶ células/mL.
   5. Para a configuração de incubação de 48 horas, aspire PBS dos poços A1-3 contendo os andaimes de hidrogel retilíclear 3D bioimpressos e pipeta 1 mL de BMMC (1 × ¹⁰⁶ células/mL) em cada poço. Além disso, a pipeta de 1 mL de BMMC (1 × ¹⁰⁶ células/mL) suspensão em poços A4-6 sem construções bioimpressoras para servir como controle não tratado. Incubar os demais poços contendo andaimes bioimpostos (B1-3, C1-3, D1-3) em RPMI sem aditivos para evitar a desidratação até que o tempo adequado seja alcançado para semeadura com BMMC para as durações de tratamento de 24, 18 e 6 horas. Encha os poços sem andaimes bioimpressos (B4-6, C4-6, D4-6) com 1 mL de PBS até que o tempo apropriado seja alcançado para semeadura com os BMMCs para os pontos de tempo de 24, 18 e 6h.
   6. Incubar a placa de 24 poços a 37 °C em uma atmosfera umidificada de _CO2 de 5%.
   7. Para a configuração de incubação de 24 horas, aspirar a cultura/tampão de cultura pré-existente dos poços B1-6 e a suspensão de 1 mL de BMMC (1 × ¹⁰⁶ células/mL) nesses poços. Devolva a placa para a incubadora.
   8. Para a configuração de incubação de 18 h, aspirar a cultura pré-existente meio/tampão dos poços C1-6 e a suspensão de 1 mL de BMMC (1 × ¹⁰⁶ células/mL) nesses poços. Devolva a placa para a incubadora.
   9. Para a configuração de incubação de 6 h, aspirar a cultura/tampão de cultura pré-existente dos poços D1-6 e a suspensão de 1 mL de BMMC (1 × ¹⁰⁶ células/mL) nesses poços. Devolva a placa para a incubadora.
   10. Para a terminação de incubação, dispense amostras de cada poço da placa de 24 poços para (i) coloração e análise de PI por citometria de fluxo, (ii) ensaio de viabilidade celular XTT e (iii) ensaio de liberação de LDH. Portanto, certifique-se de que uma placa redonda de 96 poços e os tubos de microfugem necessários de 1,5 mL sejam rotulados bem antes do ponto final da incubação.
2. Amostragem celular para ensaio metabólico XTT
   1. Resuspenque minuciosamente os BMMCs no meio de cultura dentro de cada poço, tomando cuidado para não danificar e fragmentar os andaimes de hidrogel bioimpresso 3D.
   2. Transfisticamente transfira 40 μL da suspensão homogênea do BMMC de cada poço para tubos de microfuge de 1,5 mL contendo 760 μL de meio RPMI completo fresco (volume final = 800 μL), e vórtice brevemente para misturar.
   3. Dispense 100 μL das suspensões BMMC diluídas em triplicado em uma placa de microtâmmetro de fundo plano de 96 poços que é adequada para registrar medidas de absorção (ver a Tabela de Materiais) em um espectrômetro de microparbramento.
   4. Dispense 50 μL de solução de trabalho XTT para cada poço contendo a suspensão celular BMMC usando uma micropipette multicanal.
      NOTA: Prepare a solução de trabalho XTT misturando 5 mL de reagente XTT com 100 μL de reagente de acoplamento de elétrons. Descongele estes componentes a partir de -20 °C em um banho de água de 37 °C imediatamente antes de usar.
   5. Incubar a placa de 96 poços a 37 °C em uma atmosfera umidificada de _CO2 de 5% por 24 h.
   6. No final da incubação, retire a placa de 96 poços da incubadora e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Registre valores de absorção em um espectrofotômetro de microplape a 450 nm com subtração de fundo a 650 nm.
3. Amostragem supernatante para ensaio de desidrogenase de lactato (LDH)
   1. Transfira as suspensões restantes do BMMC (960 μL) de cada poço da placa de 24 poços para tubos de microfuge, e pelota as células a 200 × g por 5 min à temperatura ambiente.
   2. Pipeta três alíquotas de 100 μL da cultura celular supernascida de cada tubo de microfuge em uma placa de fundo plana de 96 poços. Descarte as sobras de supernadentes de cada tubo de microfuge e retenha as pelotas BMMC para mais manchas com PI nas seções 5.4.1-5.4.8.
   3. Pipeta 50 μL da solução de trabalho LDH em cada alíquota de 100 μL de supernasce.
      NOTA: Consulte o arquivo suplementar 3 para a preparação dos reagentes de ensaio LDH.
   4. Incubar por 1h no escuro à temperatura ambiente.
   5. Pipeta 50 μL de ácido acético de 1 M para cada poço para parar a reação.
   6. Registre valores de absorção em um espectrofotômetro de microplape a 490 nm com subtração de fundo a 680 nm.
4. Análise citométrica de fluxo da viabilidade do BMMC via exclusão de iodeto de propidium (PI)
   1. Resuspenja as pelotas BMMC no buffer de lavagem de fluxo (PBS [pH 7.4] contendo 0,5% w/v BSA), e pelota as células a 300 × g por 5 min a temperatura ambiente.
   2. Repita o passo de lavagem com o tampão de lavagem de fluxo mais uma vez.
   3. Resuspenda cada pelota BMMC em 400 μL de tampão de lavagem de fluxo.
      NOTA: Serão 24 amostras de BMMC resuspended no total: 12 amostras de BMMC incubadas em substratos de hidrogel bioimpresso (4 pontos de tempo em triplicado) e 12 amostras de BMMC incubadas em poços sem construções bioimpressas (4 pontos de tempo em triplicado).
   4. Em uma placa de microteter de fundo redondo de 96 poços, pipeta 20 μL de tampão de lavagem de fluxo em poços A1-12 e B1-12. Na mesma placa de microtítiter, pipeta 20 μL de solução de coloração pi 10x (100 μg/mL PI no buffer de lavagem de fluxo) em poços C1-12 e D1-12.
   5. Dispense 180 μL das 12 amostras de BMMC incubadas em substratos de hidrogel bioimpresso em poços A1-12 (uma amostra por poço). Dispense 180 μL das 12 amostras de BMMC incubadas sem substratos de hidrogel bioimpresso em poços B1-12 (uma amostra por poço). Utilize as amostras de BMMC distribuídas nos poços A1-12 e B1-12 como controles não localizados para cada condição de tratamento (24 controles no total).
   6. Dispense 180 μL das 12 amostras de BMMC incubadas em construções bioimpressoras em poços C1-12 (uma amostra por poço). Dispense 180 μL das 12 amostras de BMMC incubadas sem construções bioimpressas em poços D1-12 (uma amostra por poço).
      NOTA: As amostras de BMMC nos poços C1-12 e D1-12 serão atingidas em uma concentração de PI eficaz final de 10 μg/mL (24 amostras manchadas no total).
   7. Incubar a placa por 1h a 4 °C ou 15 min em temperatura ambiente no escuro.
   8. Ao final do período de incubação, analise as amostras diretamente da placa de microtâmetro em um citômetro de fluxo, conforme descrito anteriormente na seção 3.1.

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Resultados

Uma das características mais cruciais de um substrato de tinta ou cultura biomaterial bem-sucedido é o da biocompatibilidade. Primeiramente, o substrato não deve induzir a morte celular. Existem vários métodos citométricos à base de microtúteres e fluxo de quantificação da viabilidade celular e necrose; no entanto, esses métodos não são favoráveis à análise de células incorporadas dentro de uma matriz de hidrogel. Neste protocolo, a limitação acima mencionada é contornada pela semeadura dos BMMCs no s...

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Discussão

A fabricação de tecidos biomiméticos 3D requer a amálgama bem sucedida do bioink, que imita componentes da matriz extracelular, com o componente celular para criar análogos fisiológicos de tecidos in vivo . Isso requer o uso de células primárias, e não células transformadas, ao fabricar tecidos biomiméticos fisiológicos. As células imunológicas primárias, como as células de mastro, no entanto, são particularmente suscetíveis a efeitos citotóxicos e alterações fenotípicas que podem ser provo...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
A
Acetic Acid (glacial)	Sigma Aldrich	AX0074-6
Agarose (OmniPur)	EMD Millipore Corporation	2125-500GM
Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm)	Thermo Fisher Scientific	17-4888-82
B
b-Mercaptoethanol	Fisher Scientific	O3446I-100
b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD)	Sigma Aldrich	N0632-5G
BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip)	BD	309646
BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in	BD	305111
BioLite 24 Well Multidish	Thermo Fisher Scientific	930-186
BioLite 96 Well Multidish	Thermo Fisher Scientific	130-188
BioLite 175 cm2 Flask Vented	Thermo Fisher Scientific	130-191
Biosafety Cabinet Class II	Microzone Corp., Canada	BK-2-6-B3
BSA, Fraction V (OmniPur)	EMD Millipore Corporation	2930-100GM
C
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory	000664
CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8)	Thermo Fisher Scientific	12-1171-82
CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge)	CELLINK LLC	IK1020000303
CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mL	CELLINK LLC	CL1010006001
CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps	CELLINK LLC	CSC0103000102
CELLINK HeartWare for PC	CELLINK LLC	Version 2.4.1
CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER	CELLINK LLC	S-10003-001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G	CELLINK LLC	NZ4220005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G	CELLINK LLC	NZ4250005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G	CELLINK LLC	NZ4270005001
Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche)	Sigma Aldrich	11465015001
Centrifuge (Benchtop)	Eppendorf	5804R
Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate	Sigma Aldrich	CLS3370
CO2 Incubator	Binder GmbH, Germany	9040-0113
CytoFLEX Flow Cytometer	Beckman Coulter	A00-1-1102
D
D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem)	Fisher Scientific	44-390-7100GM
F
Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile	Corning	352095
Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile	Corning	352070
FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1)	Thermo Fisher Scientific	17-5898-82
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated	Thermo Fisher Scientific	12484028
FlowJo Software	Becton Dickinson & Co. USA	Version 10.6.2
G
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC	Version 8.4.3
H
Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy)	VWR	15170-208
HEPES Sodium Salt	Fisher Scientific	BP410-500
I
Iodonitrotetrazolium chloride (INT)	Sigma Aldrich	I10406-5G
L
L-Glutamine 200 mM (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	25030-081
Lithium L-lactate	Sigma Aldrich	L2250-100G
M
MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	11140-050
1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS)	Sigma Aldrich	M8640
Microtubes (1.7 mL clear)	Axygen	MCT-175-C
Microtubes (2.0 mL clear)	Axygen	MCT-200-C
MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water)	Millipore	ZMQS60001
N
Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL)	Thermo Fisher Scientific	566-0020
Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm)	Thermo Fisher Scientific	725-2520
P
Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	15140-122
PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	10010-023
Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen)	Thermo Fisher Scientific	P3566
R
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5)	Thermo Fisher Scientific	12-4031-82
Recombinant Murine IL-3	PeproTech, Inc.	213-13
RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone)	GE Healthcare	SH30027.01
S
Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001)	Fisher Scientific	NC9913213
Sodium Azide, 500 g	Fisher Scientific	BP922I-500
Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	11360-070
T
Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)	Sigma Aldrich	252859
Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy)	Sigma Aldrich	93595
V
VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020)	Thermo Fisher Scientific	VLBL00D0