Visualização de nível celular longitudinal estabilizada do pâncreas em um modelo murino com uma janela de imagem intravital pancreática

Resumo

A imagem in vivo de alta resolução do pâncreas foi facilitada com a janela de imagem intravital pancreática.

Resumo

A imagem direta de resolução celular in vivo do pâncreas em um modelo animal pequeno vivo tem sido tecnicamente desafiadora. Um estudo recente de imagem intravital, com uma janela de imagem abdominal, possibilitou a visualização da dinâmica celular em órgãos abdominais in vivo. No entanto, devido à arquitetura macia do pâncreas do mouse que pode ser facilmente influenciada pelo movimento fisiológico (por exemplo, peristalse e respiração), foi difícil realizar imagens longitudinais estabilizadas ao longo de várias semanas no nível celular para identificar, rastrear e quantificar ilhotas ou células cancerígenas no pâncreas do rato. Aqui, descrevemos um método para implantar uma nova base de suporte, uma janela de imagem intravital pancreática integrada, que pode separar espacialmente o pâncreas do intestino para imagens intravitais longitudinal do pâncreas microestrutura. A imagem longitudinal in vivo com a janela de imagem permite a visualização estável, permitindo o rastreamento de ilhotas durante um período de 3 semanas e imagens tridimensionais de alta resolução da microestrutura, como evidenciado aqui em um modelo de câncer pancreático ortotópico. Com nosso método, novos estudos de imagem intravital podem elucidar a fisiopatologia de várias doenças envolvendo o pâncreas a nível celular.

Introdução

O pâncreas é um órgão abdominal com uma função exócrina no trato digestivo e uma função endócrina de secretar hormônios na corrente sanguínea. Imagens celulares de alta resolução do pâncreas podem revelar a fisiopatologia de várias doenças envolvendo o pâncreas, incluindo pancreatite, câncer de pâncreas e diabetes mellitus¹. Ferramentas convencionais de diagnóstico por imagem, como tomografia computadorizada, resolução magnética e ultrassonografia estão amplamente disponíveis no campo clínico^1,2. No entanto, essas modalidades de imagem estão restritas à visualização apenas de alterações estruturais ou anatômicas, enquanto alterações no nível celular ou molecular não podem ser determinadas. Dado que alterações moleculares no diabetes mellitus ou câncer de pâncreas em humanos podem iniciar mais de 10 anos antes do diagnóstico^3,4, a detecção de doenças pancreáticas de sua transição molecular durante o período latente tem o potencial de fornecer um diagnóstico precoce e uma intervenção oportuna. Assim, imagens que superarão as limitações da resolução e fornecerão insights valiosos sobre a função ganharão notavelmente atenção, fornecendo diagnóstico precoce de câncer de pâncreas ou identificação avançada da alteração das ilhotas durante a progressão do diabetes mellitus⁵.

Em particular com as ilhotas, imagens nucleares, imagens de bioluminescência e tomografia de coerência óptica têm sido sugeridas como técnicas de imagem de ilhotas não invasivas⁶. No entanto, a resolução desses métodos é substancialmente baixa, com valores típicos que variam de várias dezenas a centenas de micrômetros, oferecendo uma capacidade limitada para detectar alterações no nível celular nas ilhotas. Por outro lado, foram realizados estudos anteriores de alta resolução de ilhotas sob ex vivo^7,8 (por exemplo, fatiamento ou digestão do pâncreas), não fisiológico⁹ (por exemplo, exteriorização do pâncreas) e condições heterotópicas^10,11,12 (por exemplo, implantação sob a cápsula renal, dentro do fígado, e na câmara anterior do olho), o que restringe sua interpretação e implicações clínicas. Se in vivo,modelo fisiológico e ortotópico de imagem de alta resolução pode ser estabelecido, será uma plataforma crítica para a investigação de ilhotas pancreáticas.

A imagem intravital, que revela a fisiopatologia em um nível de resolução microscópica em um animal vivo, recebeu recentemente grande atenção¹³. Dos métodos de imagem in vivo, o desenvolvimento de uma janela de imagem abdominal¹⁴, que implanta uma janela no abdômen de um camundongo, permitiu a descoberta de novos achados (ou seja, um estágio pré-micrometastase da metástase hepática precoce¹⁵ e mecanismo de manutenção de células-tronco no epitélio intestinal¹⁶). Embora a janela de imagem abdominal forneça resultados valiosos, as aplicações desta janela para o pâncreas e a pesquisa de imagem intravital resultante baseada em doenças envolvendo pâncreas, não foram amplamente investigadas.

Ao contrário das características bem definidas do órgão sólido do pâncreas humano, o pâncreas de um camundongo é uma estrutura difusamente distribuída de tecido mole¹⁷. Portanto, é incessantemente afetada por movimentos fisiológicos, incluindo peristalse e respiração. Um estudo anterior sobre a aplicação de uma janela de imagem abdominal para o pâncreas demonstrou que a erração ocorreu devido a artefatos de movimento induzidos pelos movimentos intestinais¹⁸. A desfoca severa foi observada na imagem média resultante, o que impediu a visualização e identificação das estruturas de microescala.

Aqui, descrevemos o uso de uma nova base de apoio integrada janela de imagem intravital pancreática combinada com microscopia intravital^19,20 para investigar os eventos longitudinais de nível celular em doenças envolvendo o pâncreas. Além de uma descrição detalhada da metodologia no estudo anterior^18,a aplicação estendida da janela de imagem pancreática para diversas doenças envolvendo o pâncreas será abordada neste artigo. Neste protocolo, um sistema de microscopia confocal de varredura a laser de velocidade de vídeo personalizado foi utilizado como um sistema de microscopia intravital. Quatro módulos laser (comprimentos de onda em 405, 488, 561 e 640 nm) foram utilizados como fonte de excitação, e quatro canais de sinais de emissão foram detectados por tubos fotomultiplier (PMT) através de filtros de bandpass (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). A varredura a laser consistia em um espelho poligonal rotativo (eixo X) e um espelho de varredura galvanômetro (eixo Y) que permitia a digitalização da taxa de vídeo (30 quadros por segundo). Informações detalhadas sobre microscopia intravital foram descritas nos estudos anteriores^{10,18,19,20,21,22,23}.

Em nosso estudo anterior^{de ilhotas 18,}nós com sucesso e imagem as ilhotas em camundongos vivos usando um modelo de rato transgênico (MIP-GFP)²⁴ em que as ilhotas foram marcadas com GFP. O método possibilitou a visualização de alta resolução das alterações nas ilhotas durante um período de 1 semana. Também facilitou a imagem das mesmas ilhotas por até 3 semanas, o que sugere a viabilidade de estudos de longo prazo das ilhotas pancreáticas para o rastreamento ou monitoramento funcional durante a patogênese do diabetes mellitus¹⁸. Além disso, desenvolvemos um modelo ortotópico de câncer de pâncreas no qual células cancerígenas pancreáticas fluorescentes (PANC-1 NucLight Red)²⁵ foram implantadas diretamente no pâncreas do camundongo. Com a aplicação da janela de imagem intravital pancreática, este modelo poderia ser utilizado como uma plataforma para investigar a fisiopatologia celular e molecular no microambiente tumoral do câncer de pâncreas e para o monitoramento terapêutico de novos candidatos a medicamentos.

Protocolo

Todos os procedimentos descritos neste artigo foram realizados de acordo com a^8ª edição do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (2011)²⁶ e aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Avançado de Ciência e Tecnologia da Coreia (KAIST) e do Hospital Bundang da Universidade Nacional de Seul (SNUBH).

1. Preparação da janela e outros materiais

1. Design personalizado a janela de imagem intravital pancreática para isolar o pâncreas do intestino na cavidade abdominal¹⁸ (Figura 1A, B). Um projeto detalhado da janela é descrito em uma figura suplementar de um estudo anterior¹⁸.
2. Use camundongos C57BL/6N, machos de 8 a 12 semanas, para imagens pancreáticas intravitais. Injete anticorpo anti-CD31 conjugado com um fluoróforo Alexa 647, 2 h antes da imagem, com o propósito de rotular o vaso¹⁸.
3. Para o estudo das ilhotas, prepare um modelo de camundongo transgênico no qual as ilhotas são marcadas com uma proteína repórter fluorescente. Aqui, utilizamos o MIP-GFP, onde a proteína fluorescente verde foi expressa sob o controle do promotor genético de insulina do camundongo 1, que está ativo nas células beta de todas as ilhotas do mouse²⁴.
4. Para o estudo do câncer de pâncreas, prepare células cancerígenas transgênicas marcadas com uma proteína repórter fluorescente e ratos nus BALB/C. Neste estudo, foram utilizadas as células VERMELHAS PANC-1 NucLight. As células cancerígenas PANC-1²⁵ foram rotuladas com a sonda fluorescente NucLight Red.
5. Esterilize todas as ferramentas cirúrgicas, cubra vidros (com PEG ou não) e janelas de imagem usando uma autoclave.
6. Aplique revestimento PEG no vidro de cobertura para evitar resposta inflamatória e aumentar a biocompatibilidade, que é adequada para imagens de longo prazo.

2. Cirurgia

1. Prepare uma plataforma cirúrgica estéril e esterilize as superfícies com 70% de etanol.
   NOTA: Para sessões de imagem longitudinal, a técnica asséptica é essencial.
2. Anesthetize camundongos com uma mistura de tiletamina/zolazepam (30 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).
   NOTA: Recomenda-se o uso de tiletamina/zolazepam em vez de cetamina devido ao seu efeito adverso da hiperglicemia. A anestesia ideal deve ser selecionada para efeitos do experimento^9,27.
3. Monitore a temperatura do corpo usando uma sonda retal com uma almofada de aquecimento controlada homeotermica.
4. Raspe o flanco esquerdo do mouse e aplique três rodadas de álcool alternado e esfoliante à base de iodo.
   NOTA: Se for usado creme depilatório, não deixe mais de 1 minuto para evitar queimaduras químicas.
5. Faça uma incisão de 1,5 cm no flanco esquerdo do mouse e disseque a pele e o músculo.
6. Realize uma sutura de corda de bolsa com uma sutura preta ou de nylon 4-0 na margem de incisão.
7. Use um micro retrátil na incisão e exponha suavemente o baço.
8. Misture cuidadosamente o baço com fórceps do anel e identifique o pâncreas.
9. Coloque a janela no flanco do mouse e passe o baço e o pâncreas pelo espaço aberto da janela. A manipulação do pâncreas tem que ser muito gentile, pois pode causar sangramento ou pancreatite
10. Coloque suavemente o pâncreas na placa da janela de imagem; o baço será colocado no espaço aberto da janela.
11. Para o estudo de células cancerígenas, injete PANC-1 NucLight Red (1,0 x 10 6 células)^diretamente no pâncreas.
    NOTA: Para a imagem dos xenoenxertos ortotópicos de câncer pancreático humano, a implantação direta de células cancerígenas como o PANC-1 ou outras células cancerígenas pancreáticas humanas poderia ser facilitada²⁸. Para visualizar com microscopia de fluorescência intravital, as células PANC-1 foram transduzidas com proteína fluorescente vermelha usando o reagente lentiviral NucLight Red que rotula o núcleo²⁹. Embora o volume de injeção máxima seja incerto, diminua o volume possível para evitar o efeito de pressão no pâncreas.
12. Aplique gotas de cola de cianoacrilato N-butil na margem da janela de imagem.
    1. Para minimizar a quantidade da cola aplicada, use uma agulha de cateter de 31 G para a aplicação. Se a quantidade da gota for grande, então o tecido irá involuntariamente aderir à janela ou cobrir o vidro.
13. Aplique suavemente um vidro de cobertura redondo de 12 mm na margem da janela de imagem.
14. Puxe o laço de sutura para caber no sulco lateral da janela e amarre-o três vezes.
15. Corte o local proximal máximo do nó para evitar a interrupção de pontos apertados quando esses ratos estiverem acordados.
16. Deixe os camundongos se recuperarem da anestesia (2-3 horas) e injetem cetoprofeno (5 mg/kg, subcutâneo na pele solta na base do pescoço ou quadril do animal) para alívio da dor. Reavaliar para sinais de dor a cada 12 horas e cetoprofeno deve ser considerado a cada 24 horas durante 1-3 dias.
    NOTA: A analgesia influencia a secreção da insulina em resposta à glicose⁹. A escolha e o tempo da analgesia devem ser individualizados para o propósito experimental.
17. Acomodar o rato na gaiola com roupa de cama suficiente para evitar o contato da janela com a gaiola. Evite abrigar a casa com os ratos sem a cirurgia da janela.

3. Imagem intravital

1. Ligue o microscópio intravital, incluindo a potência laser.
2. Ligue a almofada de aquecimento e coloque o regulamento homeotémico em 37 °C.
   NOTA: Alternativamente, use uma almofada de aquecimento passiva ou lâmpada com controle frequente se não houver regulação homeotérmica.
3. Realize anestesia intramuscular com uma mistura de tiletamina/zolazepam (30 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).
   NOTA: Recomenda-se o uso de tiletamina/zolazepam em vez de cetamina devido ao seu efeito adverso da hiperglicemia. A anestesia ideal deve ser selecionada para fins dos experimentos^9,27.
4. Insira um cateter vascular para a injeção.
   1. Aplique pressão no lado proximal da cauda com o índice e o terceiro dedo como alternativa a uma aplicação de torniquete. Aqueça a cauda com uma lâmpada, se necessário.
   2. Esterilize a veia traseira com um spray de 70% de etanol.
   3. Insira um cateter de 30 G na veia lateral da cauda. A regurgitação de sangue será visualizada no tubo PE10.
   4. Aplique uma fita de seda no cateter para estabilizá-la.
   5. Injete fitc/TMR dextran ou outras sondas fluorescentes (25 μg de anti-CD31 conjugado com Alexa 647), conforme apropriado, de acordo com a combinação de sondas fluorescentes¹⁸.
      NOTA: Para sondas de anticorpos conjugados fluorescentes, injete 2 h antes da sessão de imagem.
5. Transfira o mouse da plataforma cirúrgica para o estágio de imagem.
6. Insira uma sonda retal para controlar automaticamente a temperatura corporal com o sistema de almofada de aquecimento homeotémico.
7. Insira a janela de imagem pancreática no suporte da janela preparado durante a configuração da microscopia intravital(Figura 2). Para um microscópio invertido, um suporte de janela pode não ser necessário.
8. Realize imagens intravitais.
   1. Para a imagem do pâncreas, comece com uma lente objetiva de baixa ampliação (por exemplo, 4x) para digitalizar toda a visão do pâncreas na janela de imagem pancreática (campo de visão recomendado: 2500 x 2500 μm).
   2. Após a determinação da região de interesse, mude para lente objetiva de ampliação mais alta (20x ou 40x) para realizar a imagem de nível celular (campo de visão recomendado: 500 x 500 μm ou 250 x 250 μm). Neste experimento, a resolução lateral e axial foi de aproximadamente 0,5 μm e 3 μm, respectivamente.
   3. Execute imagens de z-stack ou time-lapse para observar a estrutura 3D ou a dinâmica de nível celular, como a migração celular.
      NOTA: Para a imagem da proteína fluorescente que expressa células de animais transgênicos (MIP-GFP), 30 s de exposição intermitente a laser de 488 nm com potência de até 0,43 mW era tolerável sem fotobleaching ou dano tecidual. Para a imagem das proteínas fluorescentes rotuladas com Alexa 647, a potência laser de 640 nm até 0,17 mW era tolerável sem fotobleaching perceptível ou danos teciduais. Exposição prolongada ao laser de excitação com uma potência acima desta configuração pode levar a fotobleaching ou dano tecidual por fototoxicidade. Ajuste o ganho e o poder adequados para imagem adequada da região de interesse. A definição detalhada dos parâmetros na microscopia intravital deve ser individualizada para cada microscopia intravital preparada no instituto.

Resultados

A microscopia intravital combinada com a janela de imagem intravital pancreática integrada da base de suporte permite imagens longitudinal do nível celular do pâncreas em um rato. Este protocolo com a janela de imagem intravital pancreática fornece estabilidade tecidual de longo prazo que permite a aquisição de imagens de alta resolução para rastrear ilhotas individuais por até 3 semanas. Como resultado, imagens de mosaico para um campo de visão estendido, reconstrução tridimensional (3D) de imagens de pilha ...

Discussão

O protocolo descrito aqui consiste em imagens intravitais do pâncreas usando uma nova base de suporte integrada janela de imagem intravital pancreática modificada de uma janela de imagem abdominal. Entre os protocolos descritos acima, o primeiro passo crítico é a implantação da janela de imagem pancreática intravital no camundongo. Para a aplicação da cola na janela, é importante aplicar a cola entre a margem da janela e o vidro de cobertura, mas não no tecido pancreático, pois pode interromper significativam...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters)	Invitrogen	A20006	Fluorescent probe for conjugate with antibody
BALB/C Nude	OrientBio	BALB/C Nude	BALB/C Nude
BD Intramedic polyethylene tubing	BD Biosciences	427401	PE10 catheter for connection with needle
C57BL/6N	OrientBio	C57BL/6N	C57BL/6N
Cover glasses circular	Marienfeld	0111520	Cover glass for pancreatic imaging window
FITC Dextran 2MDa	Merck (Former Sigma Aldrich)	FD200S	For vessel identification
IMARIS 8.1	Bitplane	IMARIS	Image processing
Intravital Microscopy	IVIM tech	IVM-C	Intravital Microscopy
IRIS Scissor	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	S-1107-10	This product can be replaced with the product from other company
Loctite 401	Henkel	401	N-butyl cyanoacrylate glue
Micro Needle holder	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	H-1126-10	This product can be replaced with the product from other company
Micro rectractor	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	17004-03	This product can be replaced with the product from other company
Microforceps	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	F-1034	This product can be replaced with the product from other company
MIP-GFP	The Jackson Laboratory	006864	B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J
Nylon 4-0	AILEE	NB434	Non-Absorbable Suture
Omnican N 100 30G	B BRAUN	FT9172220S	For Vascular Catheter, Use only Needle part
PANC-1 NucLightRed	Custom-made	Custom-made	Made in laboratory
Pancreatic imaging window	Geumto Engineering	Custom order	Pancreatic imaging window - custom order
Physiosuite	Kent Scientific	PS-02	Homeothermic temperature controller
Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31	BD Biosciences	553708	Antibody for in vivo vessel labeling
Ring Forceps	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	F-1090-3	This product can be replaced with the product from other company
Rompun	Bayer	Rompun	Anesthetic agent
TMR Dextran 65-85kDa	Merck (Former Sigma Aldrich)	T1162	For vessel identification
Window holder	Geumto Engineering	Custom order	Window holder - custom order
Zoletil	Virbac	Zoletil 100	Anesthetic agent