Caracterização unicelular de influxo de cálcio e infecção pelo HIV-1 usando uma plataforma optofluidica multiparmétrica

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo no qual células únicas são monitoradas para eventos agudos e infecção produtiva pelo HIV-1 em um dispositivo nanofluido. Os dados de imagem definem interações entre receptores de receptores de vírus e dinâmicas de caminhos de sinalização. Este é o primeiro método para a cultura e imagem longitudinal de alta produtividade para estudar a cinética e as interações moleculares.

Resumo

O HIV-1 causa uma infecção crônica que afeta mais de 37 milhões de pessoas em todo o mundo. Pessoas vivendo com o vírus da imunodeficiência humana (HIV) experimentam comorbidade relacionada à inflamação crônica, apesar da terapia antirretroviral. No entanto, essas sinalizações inflamatórias não foram totalmente caracterizadas. O papel dos eventos de entrada precoce na ativação de eventos de sinalização celular e expressão genética a jusante não foi capturado no nível de célula única. Aqui, os autores descrevem um método que aplica princípios da microscopia de fluorescência de células vivas a uma plataforma automatizada de células únicas que culturas e células de imagens ao longo de cursos de tempo personalizados pelo usuário, permitindo a análise de alto rendimento de processos celulares dinâmicos. Este ensaio pode rastrear a microscopia de fluorescência ao vivo unicelular de eventos precoces que seguem imediatamente a infecção pelo HIV-1, notadamente o fluxo de cálcio que acompanha a exposição ao vírus e o desenvolvimento de infecção produtiva usando um vírus repórter fluorescente. As células MT-4 são carregadas com um corante sensível ao cálcio e cultivadas em canetas isoladas em um dispositivo nanofluido. As células cultivadas estão infectadas com um vírus repórter HIV-1 (HIV-1 NLCI). Um microscópio de fluorescência posicionado acima do dispositivo nanofluido mede o fluxo de cálcio ao longo de um curso de tempo de 8 minutos após a exposição aguda ao HIV-1. A infecção produtiva do HIV-1 é medida nessas mesmas células durante um intervalo de 4 dias. Os dados de imagem desses cursos de tempo são analisados para definir interações receptoras de receptores de vírus e dinâmicas de caminhos de sinalização. Os autores apresentam uma alternativa integrada e escalável aos métodos tradicionais de imagem usando uma nova plataforma optofluidic capaz de classificação unicelular, cultivo, imagem e automação de software. Este ensaio pode medir a cinética dos eventos em várias condições, incluindo tipo de célula, efeito agonista ou antagonista, enquanto mede uma série de parâmetros. Este é o primeiro método estabelecido para a cultura e imagem longitudinal de alta produtividade de alta throughput: Esta técnica pode ser amplamente adaptada para estudar cinética de sinalização celular e interações moleculares dinâmicas.

Introdução

A inflamação crônica é uma das principais causas de morbidades precoces associadas ao HIV e mortalidade^1,2,3. Existem múltiplos mecanismos pelos quais o HIV pode ativar a sinalização inflamatória, e evidências recentes sugerem um papel para os receptores P2X na entrada do HIV que são receptores de adenosina triptosfato de adenosina (ATP) de cálcio^{3,4,5,6,7,8,9,10}. O subtipo P2X de receptores purinérgicos (P2XR) pode ser importante facilitador desta inflamação. No entanto, os mecanismos moleculares das interações HIV-P2XR são amplamente desconhecidos e podem impactar as etapas do ciclo de vida viral do HIV-1. Definir os caminhos e cinéticas que conduzem a inflamação crônica associada ao HIV é fundamental para o avanço das opções de tratamento para pessoas com HIV.

Para avaliar se o HIV-1 agoniza diretamente os receptores P2X, a ativação P2XR e a infecção pelo HIV-1 devem ser medidos em paralelo. Ensaios da atividade P2XR e infecção pelo HIV-1 foram estabelecidos de forma independente: o fluxo de cálcio celular é um indicador da ativação P2XR, e a infecção produtiva pelo HIV-1 pode ser quantificada pela abundância de RNA. A detecção de fluorescência do fluxo de cálcio é possível com o corante sensível ao cálcio Fluo-4, e a infecção pelo HIV-1 pode ser visualizada com o vírus mCherry fluorescente HIV-NLCI^{11,12,13,14,15}.

Como esses indicadores de ativação P2X (fluxo de cálcio celular agudo) e infecção pelo HIV-1 (síntese de RNA HIV-1) ocorrem em diferentes escalas de tempo (minutos versus dias), falta um método de alta produtividade que permita a análise emparelhada da ativação P2XR e da infecção pelo HIV-1. Técnicas experimentais padrão de alto rendimento, como a citometria de fluxo, permitem a análise populacional, mas não podem avaliar a relação entre eventos agudos e longitudinais em células únicas. Alternativamente, a imagem unicelular com microscopia de fluorescência padrão é de baixa produtividade. Essas limitações experimentais apresentam a necessidade de novas técnicas de alta produtividade para medir associações entre eventos celulares agudos e longitudinais diretamente.

Um sistema optofluido descrito é uma nova plataforma capaz de triagem e isolamento unicelulares, culminando, imagem e automação de software^16,17,18,19. Este sistema apresenta uma alternativa integrada e de alto rendimento às limitações dos métodos tradicionais de imagem. A plataforma Beacon consiste em um dióxido de carbono (CO₂) e uma incubadora controlada pela temperatura que suporta células contidas em um chip. O chip possui transistores fotosensíveis que geram um gradiente elétrico em resposta à luz direcionada. Esta força dielectrophoretic resultante é usada para mover células individuais através do chip nanofluido para as regiões desejadas. As células são classificadas em canetas no chip, que fornecem uma barreira para isolar células individuais fisicamente. O fluxo contínuo de mídia de crescimento em todo o chip impede a migração celular das canetas, permitindo a difusão de pequenas partículas de nutrientes e reagentes específicos do experimento. Um microscópio de fluorescência fica acima do chip. A automação de software é usada para capturar imagens do chip no ponto de tempo especificado pelo usuário.

Toda a caracterização celular foi realizada utilizando-se um sistema optofluido para seleção e manipulação de células únicas. Este sistema consiste em componentes mecânicos, microfluidos e ópticos integrados que permitem manipulação de células únicas, ensaio, cultura e imagem. As células são carregadas e cultivadas no dispositivo nanofluido descartável composto por 3.500 câmaras individuais (canetas), cada uma capaz de segurar volume sub-nanolílito. As células podem ser posicionadas dentro de canetas usando "gaiolas" dielectrophoretic induzidas pela luz e cultivadas sob condições controladas por temperatura e CO_2. Os microfluidos permitem a perfusão de mídia ou buffers no chip para cultura celular ou tratamento medicamentoso. Uma agulha acionada permite a importação e exportação de células de placas de poços incubadas e fechadas. A área do chip pode ser visualizada em ampliação de 4x ou 10x em canais brightfield e fluorescentes (incluindo DAPI, FITC, TRed ou Cy5) para caracterizar fenótipos celulares ou análise funcional. Todo o sistema é automatizado usando software que pode ser usado para fluxos de trabalho pré-projetados ou experimentos personalizados.

Foram estudadas relações entre a infecção pelo HIV-1 e o P2XR, mas não foi relatado um procedimento de alto rendimento para caracterizar diretamente essas interações em paralelo. Aqui, os autores descrevem uma metodologia para estudar as interações HIV-P2XR através do rastreamento do fluxo agudo de cálcio e da infecção produtiva subsequente do HIV-1 no nível unicelular. Notavelmente, isso estabelece uma nova ferramenta que permite a medição direta, de alto rendimento e longitudinal de múltiplos alvos em células únicas.

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Protocolo

1. Preparação de células para imagem

1. Prepare a solução de carregamento Fluo-4 AM fresca: Adicione 25 μL de solvente concentrado de detergente de 100x e adicione 2,5 μL de Fluo-4 AM 1000x a um tubo de 1,5 mL. Vórtice para misturar.
2. Pipeta 2,5 mL de mídia cultural na solução de carregamento e inverter para misturar. Proteja-se contra a luz.
3. Centrífuga 2 x 10⁶ células MT-4 a 500 x g por 3 min.
4. Remova a mídia e resuspense a pelota em 2 mL da solução de carregamento Fluo-4 AM preparada. Proteja-se contra a luz.
5. Células resuspended pipeta em uma placa de Petri de 35 mm. Incubar a 37 °C por 15-30 min, depois incubar por mais 15-30 min em temperatura ambiente.
6. Transfira a suspensão da célula para um tubo de centrífuga. Centrífugas a 500 x g por 3 min e removam o supernascedor consistindo da solução de carregamento.
7. Resuspengue a pelota celular pipetando em 1 mL do meio de cultura e centrífuga a 500 x g por 3 min para lavar.
8. Resuspend a pelota celular por pipetação no meio de cultura a uma concentração de 2 x 10⁶ células/mL (mínimo 50 μL). Proteja-se contra a luz.

2. Preparação do sistema optofluídico, carregamento de células e penning de células

1. Prepare um chip com a solução de molhar, que facilita a escrita celular.
   1. Para isso, carregue tubos de centrífugas contendo 2 mL de solução de molhar e 50 mL de água DI no instrumento com um novo chip optofluídico e execute a função Chip Molhado. Esta função inundará automaticamente o chip com a solução de molhar através da fluidez do sistema, incubará o chip a 50, °C e lavará o chip com água 3 vezes.
   2. Uma vez feito o flushing de água, lave o chip com 3 ciclos de 250 μL de mídia cultural.
2. Suplemente a suspensão celular da etapa 1.8 com 1:100 F-127 detergente soluto antes do carregamento para reduzir a probabilidade de as células grudando nos canais do chip.
3. Use a agulha de exportação de instrumentos para importar células de um tubo de centrífuga de 1,5 mL usando a operação de carga e importação de pequeno volume para um volume de embalagem de célula de 5 μL.
4. Células de caneta utilizando uma tensão de posicionamento optoeletrônico otimizada (OEP) de velocidade de gaiola de 4,3 V e 5 μm/s. A penning ocorre usando OEP. Realize a escrita usando a função Autopen, que irá autodetectar células únicas, cercá-las com uma gaiola OEP e movê-las para uma caneta próxima. Se as células de interesse permanecerem após a escrita automática, use a função caneta Manual para selecionar células-alvo (com um clique do mouse) e uma caneta de destino (com um clique subsequente do mouse).
5. Uma vez que a escrita esteja completa (quando a função Autopen for concluída ou quando o número desejado de células escritas tiver sido atingido), lave o chip com 3 ciclos de 250 μL de mídia cultural para limpar qualquer célula não suspensa restante do chip.

3. Infecção de células únicas e imagem funcional

1. Depois de escrever células, obtenha imagens fluorescentes de células nos canais FITC, Texas Red e DAPI para medir a linha de base Fluo-4, mCherry e autofluorescência.
2. Infundir HIV-1 no microchip a uma concentração de 13 ng de HIV-1 NL-CI por 2 x 10⁶ células, canalizar lentamente a suspensão para dentro do chip através da agulha de exportação.
3. Imediatamente após a adição do HIV-1, obtenha repetidamente imagens nos canais FITC e DAPI ao longo de um curso de tempo de 10 minutos.
4. Obtenha imagens nos canais Texas Red e DAPI em 1-, 2,3 e 4 dias pós-infecção (DPI).

4. Análise de dados de imagem funcional unicelulares com software FIJI

1. Em cada momento em cada canal de imagem de interesse, use a ferramenta fiji point selection e a função Measure para medir os sinais fluo-4, mCherry e autofluorescência de cada célula. Meça simultaneamente a fluorescência de fundo calculando a intensidade média de fluorescência (IME) da caneta e do chip contendo cada célula.
2. Controle para a fluorescência de fundo e autofluorescência usando a função Medida para encontrar o MFI em uma Seleção de Região e subtraindo esse valor do valor da fluorescência celular.
3. Normalize a fluorescência de fundo de cada imagem do chip: Meça o MFI do chip em cada campo. Em seguida, subtraia o MFI do chip com a menor fluorescência de fundo de todas as outras medidas de MFI do chip.
4. Normalize a fluorescência de fundo de cada caneta contendo células: meça o IMfi da caneta de cada célula em cada campo de visão. Em seguida, subtraia esse valor do MFI bruto da célula para cada campo.
5. Controle para a autofluorescência celular: Subtraia o dia 0 e o dia 4 DAPI MFI de cada célula do dia 0 e dia 4 mCherry MFIs.

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Resultados

A Figura 1 ilustra o formato do chip e dados de imagem bruta adquiridos através do microscópio de fluorescência. A identificação e agrupamento de células não infectadas e infectadas através da medição mCherry são mostradas na Figura 2. Esses aglomerados são analisados para cinética de influxo de cálcio na Figura 3,o que demonstra o fluxo precoce de cálcio em células infectadas pelo HIV. A Figura ...

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Discussão

A metodologia descrita para estudar a relação entre o fluxo de cálcio e a infecção produtiva pelo HIV-1 em células únicas pode ser adaptada para estudar cinética de cálcio intracelular em resposta a outros agonistas ou antagonistas de interesse. A preparação de células para imagens é simples, minimamente intensiva em tempo, e os reagentes estão disponíveis em kits convenientes de fabricantes amplamente utilizados. A medição de cálcio à base de fluo-4 é bem descrita na literatura, e o HIV-1 pode ser fa...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beacon Optofluidic System	Berkeley Lights
Fetal Bovine Serum	Gibco
FIJI	Open-source software	PMID: 22743772, 22930834
Fluo-4 Calcium Imaging Kit	Thermo Fisher	F10489
HIV-1 NLCINL4-3	Laboratory of Benjamin Chen	PMID: 28148796
Hyclone Pennecillin Streptomycin solution	GE Healthcare Life sciences	SV30010
MT-4 cells	NIH AIDS Reagent		ARP-120
OptoSelect 3500 chip	Berkeley Lights
Pipettor Tips	Denville Scientific	P3020-CPS
Prism 9.0.0	GraphPad
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldrich	R8758
Serological Pipettes	Fisher Brand	13-678-11E
Tissue Culture Hood	Various models
T75 flasks	Corning	3073