Avaliação in vitro da reprogramação cardíaca medindo fluxo de cálcio específico cardíaco com um repórter GCaMP3

Resumo

Descrevemos aqui, o estabelecimento e a aplicação de um Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)^{26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J (referido como αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 abaixo) linha de repórteres para avaliação de reprogramação cardíaca. Os fibroblastos cardíacos neonatais (NCFs) isolados da cepa do camundongo são convertidos em cardiomiócitos induzidos (iCMs), permitindo uma avaliação conveniente e eficiente da eficiência de reprogramação e maturação funcional dos ICMs via fluxo de cálcio (^Ca2+).

Resumo

A reprogramação cardíaca tornou-se uma terapia potencialmente promissora para reparar um coração danificado. Ao introduzir múltiplos fatores de transcrição, incluindo Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), os fibroblastos podem ser reprogramados em cardiomiócitos induzidos (iCMs). Esses iCMs, quando gerados in situ em um coração infartado, integram-se eletricamente e mecanicamente com o miocárdio circundante, levando a uma redução no tamanho da cicatriz e uma melhora na função cardíaca. Devido à eficiência, pureza e qualidade relativamente baixa da reprogramação dos iCMs, a caracterização dos ICMs continua sendo um desafio. Os métodos atualmente utilizados neste campo, incluindo citometria de fluxo, imunocytoquímica e qPCR, concentram-se principalmente na expressão genética e proteína específica do coração, mas não na maturação funcional dos ICMs. Desencadeada por potenciais de ação, a abertura de canais de cálcio fechados com tensão em cardiomiócitos leva a um rápido fluxo de cálcio na célula. Portanto, quantificar a taxa de influxo de cálcio é um método promissor para avaliar a função cardiomiócito. Aqui, o protocolo introduz um método para avaliar a função do ICMS por fluxo de cálcio (^Ca2+). Uma cepa de rato αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 foi estabelecida cruzando Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (referido como Myh6-Cre abaixo) com gt(ROSA)^{26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J (referido como Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 abaixo). Os fibroblastos cardíacos neonatais (NCFs) de camundongos neonatais P0-P2 foram isolados e cultivados in vitro, e uma construção policistrônica de MGT foi introduzida aos NCFs, o que levou à sua reprogramação para iCMs. Como somente os iCMs reprogramados com sucesso expressarão o repórter GCaMP3, a maturação funcional dos iCMs pode ser avaliada visualmente pelo fluxo ^Ca2+ com microscopia de fluorescência. Em comparação com os NCFs não reprogramados, os NCF-iCMs apresentaram fluxo transitório de cálcio significativo e contração espontânea, semelhante aos CMs. Este protocolo descreve em detalhes o estabelecimento da cepa do camundongo, isolamento e seleção de corações de camundongos neonatais, isolamento de NCF, produção de retrovírus para reprogramação cardíaca, indução de ICMS, avaliação do fluxo de ICMS ^Ca2+ utilizando nossa linha de repórteres, e análise estatística relacionada e apresentação de dados. Espera-se que os métodos aqui descritos forneçam uma plataforma valiosa para avaliar o amadurecimento funcional dos ICMs para estudos de reprogramação cardíaca.

Introdução

O infarto do miocárdio (MI) é uma doença grave em todo o mundo. As doenças cardiovasculares (DCV) são a principal causa de morte no mundo e respondem por aproximadamente 18,6 milhões de mortes em 20191,2. A mortalidade total de DCV diminuiu ao longo do último meio século. No entanto, essa tendência tem sido desacelerada ou até mesmo revertida em alguns países não ^{desenvolvidos1}, o que exige tratamentos mais eficazes dos DCV. Como uma das manifestações fatais da DCV, o MI é responsável por cerca de metade de todas as mortes atribuídas aos DCV nos Estados ^Unidos2. Durante a isquemia, com o bloqueio das artérias coronárias e o fornecimento limitado de nutrientes e oxigênio, o miocárdio sofre alterações metabólicas graves, prejudica a função sistólica dos cardiomiócitos (CMs), e leva à morte de ^CM3. Inúmeras abordagens na pesquisa cardiovascular têm sido exploradas para reparar lesões cardíacas e restaurar a função do coração ^ferido4. A reprogramação cardíaca direta surgiu como uma estratégia promissora para reparar o coração danificado e restaurar sua ^função5,6. Ao introduzir Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), os fibroblastos podem ser reprogramados para iCMs in vitro e in vivo, e esses iCMs podem reduzir a área da cicatriz e melhorar a função ^cardíaca7,8.

Embora a reprogramação cardíaca seja uma estratégia promissora para o tratamento de MI, ainda há uma série de desafios. Em primeiro lugar, a eficiência, pureza e qualidade da reprogramação nem sempre são tão altas quanto o esperado. O indução MGT só pode atingir 8,4% (cTnT+) ou 24,7% (αMHC-GFP+) do total de CFs a serem reprogramados para iCMs in vitro7, ou até 35% in ^vivo8, o que limita sua aplicação. Mesmo com mais fatores induzidos no sistema, como ^Hand29 ou Akt1/PKB10, a eficiência de reprogramação ainda é pouco satisfatória para ser usada em um ambiente clínico. Assim, mais estudos focados na melhoria da eficiência de reprogramação são necessários neste campo. Em segundo lugar, as características de integridade elétrica e contração dos ICMs são importantes para a melhoria eficiente da função cardíaca, mas estas são desafiadoras de avaliar. Atualmente, métodos de avaliação amplamente utilizados no campo, incluindo citometria de fluxo, imunocitoquímica e qPCR de algumas expressões fundamentais de genes de CMs, estão todos focados na similaridade de iCMs e CMs, mas não diretamente relacionados com as características funcionais dos ICMs. Além disso, esses métodos têm procedimentos relativamente complicados e são demorados. Enquanto os estudos de reprogramação geralmente envolvem uma triagem de potenciais fatores de reprogramação que promove a maturação do ICMs11, a reprogramação cardíaca exige um método rápido e conveniente baseado na função iCMs.

Os CMs abrem os canais de íons de cálcio fechados de tensão no citomembano durante cada ciclo de contração, o que leva a um fluxo transitório de íon de cálcio (^Ca2+) do fluido intercelular ao citoplasma para participar da contração do miofilamento. Tal fluxo ^ca2+ e ciclo outflux é o traço fundamental da contração do miocárdio e constitui a função normal dos CMs12. Assim, um método que detecta o fluxo de ^Ca2+ pode ser uma maneira potencial de medir a função de CMs e células semelhantes a CM, incluindo iCMs. Além disso, para os ICMs, tal método fornece outra forma de avaliar a eficiência da reprogramação.

Indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECIs) têm sido desenvolvidos e amplamente utilizados para indicar atividades celulares, especialmente potenciais de ação. Geralmente, os GECIs consistem em um domínio de ligação ^Ca2+ , como calmodulin, e um domínio fluorescente como o GFP, e o GCaMP3 é um com alta afinidade e intensidade de fluorescência. O domínio de fluorescência do GCaMP3 será ativado quando a concentração local de cálcio for ^alterada13. Neste artigo, uma cepa de rato que expressa especificamente um repórter GCaMP3 em células Myh6+ é descrita. Ao introduzir o MGT nos NCFs isolados dos recém-nascidos desta cepa, a reprogramação pode ser monitorada por fluorescência, que irá exibir com sucesso iCMs reprogramados. Tal cepa e método do rato fornecerá uma plataforma valiosa para investigar a reprogramação cardíaca.

Protocolo

Todos os procedimentos e práticas experimentais envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Michigan. Todos os procedimentos experimentais e práticas envolvendo a cultura celular devem ser realizados no Gabinete de Segurança Biológica BSL2 em condições estéreis. Para os procedimentos e práticas envolvendo vírus, seguiu-se a diretriz do descarte adequado de células transfeinadas, pontas de pipeta e tubos para evitar o risco de riscos ambientais e à saúde.

1. Estabelecimento de um Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38^{(CAG-GCaMP3)Hze} /J (referido como Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) cepa de rato (Figura 1)

1. Prepare a estirpe do rato Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (009074 de estoque de laboratório jackson, referido como Myh6-Cre) e Gt(ROSA)^{26Sortm38(CAG-GCaMP3)Cepa de rato Hze}/J (014538 de estoque de laboratório jackson, referido como Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3), respectivamente.
2. Crie cada cepa até 8 semanas de idade para obter camundongos Myh6-Cre adultos e Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3, respectivamente.
3. Crossbreed o adulto Myh6-Cre e os ratos Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3.
   NOTA: Configure Myh6-Cre masculino/ Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 feminino ou vice-versa. Não há diferença significativa entre seus descendentes. Normalmente, os camundongos fêmeas darão à luz 8-10 filhotes 19-21 dias após a cruzamento.

2. Isolamento e seleção de corações de camundongos myh6-cre/rosa26A-flox-stop-flox-GCaMP3 neonatantes.

1. Obtenha filhotes P0-P2. Certifique-se de que 8-10 filhotes estão presentes para isolar 10 milhões de NCFs com este protocolo.
2. Anestesiaram profundamente os filhotes por hipotermia. Coloque os filhotes em uma luva de látex e mergulhe até o pescoço em gelo e água esmagados (2°C - 3°C).
3. Higienize brevemente os filhotes com 75% de etanol.
4. Sacrifique os filhotes por decapitação com tesouras estéreis.
5. Faça uma incisão horizontal perto do coração, aperte o coração e, em seguida, isole-o separando-o na raiz da aorta com uma tesoura.
6. Observe o coração batendo sob um microscópio de fluorescência. Certifique-se de que os corações com genótipo Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 mostre fluxo ^Ca2+ indicado por GCaMP3 com batimentos cardíacos. Os outros genótipos não mostram fluorescência (Figura 2, Vídeo 1 e Vídeo 2).

3. Isolamento de fibroblastos cardíacos neonatais (NCFs)

NOTA: Por esta parte, o protocolo do ^{Laboratório14} do Dr. Li Qian foi adotado com pequenas otimizações quando aplicável a este estudo.

1. Após o isolamento dos corações αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3, corte-os em quatro pedaços que estão vagamente conectados. Lave-os em DPBS gelados em uma placa de 6 cm completamente várias vezes para limitar a poluição das células sanguíneas nas células isoladas.
2. Transfira os corações para um tubo cônico de 15 mL.
3. Digerir os corações com 8 mL de aquecimento 0,25% Trypsin-EDTA a 37 °C por 10 min.
4. Descarte o supernatante de trippsina e adicione 5 mL de colagenase tipo II quente (0,5 mg/mL) em HBSS.
5. Vortex a mistura completamente, e incubar a 37 °C por 5 min.
6. Após a incubação, o vórtice completamente e deixe o tecido não digerido se acalmar pela gravidade.
7. Colete o supernatante em um tubo cônico de 15 mL com fibroblasto frio de 5 mL (FB) médio (IMDM com 20% de FBS e 1% penicilina/estreptomicina).
8. Repita as etapas 3.4-3.7 para o tecido não digerido 4-5 vezes.
9. Colete todos os supernaspentes juntos e filtre o supernante com um coador de 40 μm.
10. Centrifugar a 200 x g por 5 min a 4 °C e descartar o supernatante.
11. Resuspengem as células em 10 mL de tampão de classificação celular ativado por magnético (tampão MACS; 1x PBS com 2 mM EDTA e 0,5% BSA).
12. Determine o número de celular viável por coloração azul trypan.
    1. Retire 10 μL de células a partir de 10 mL de suspensão celular na etapa 3.11.
    2. Misture com 10 μL de solução azul trypan de 0,4% e incubar por 5 min a temperatura ambiente.
    3. Adicione a mistura a um hemócito e determine o número viável da célula. As células mortas estão manchadas de azul, enquanto as células viáveis estão sem manutenção.
13. Centrifugar as células a 200 x g por 5 min a 4 °C e descartar o sobrenante.
14. Resuspend as células com 10 μL de microesferas Thy1.2 em 90 μL de tampão MACS refrigerado para menos de 10 milhões de células viáveis. Adicione mais contas proporcionalmente se houver mais de 10 milhões de células viáveis. Pipeta bem a mistura e incuba a 4 °C por 30-60 min.
15. Adicione 10 mL de tampão MACS e misture bem.
16. Centrifugar a 200 x g por 5 min, descarte o supernaspe.
17. Repita as etapas 3.15-3.16 uma vez.
18. Resuspense as células e contas com 2 mL de tampão MACS.
19. Configure um separador MACS no capô. Insira uma coluna LS no separador e equilibre a coluna com 3 mL de tampão MACS.
20. Quando a coluna LS estiver equilibrada, passe as células através da coluna.
21. Lave a coluna LS com 2 mL de tampão MACS três vezes.
22. Tire a coluna do separador, elute-a com 2 mL de tampão MACS três vezes e, em seguida, colete a elução a um tubo de 50 mL.
23. Centrifugar a 200 x g por 5 min e descartar o supernatante.
24. Resuspend as células com 5 mL de mídia FB.
25. Determine o número da célula com um hemócito.
26. Diluir as células com mídia FB e semear as células em pratos ou pratos conforme desejado. Certifique-se de que a densidade de semeadura celular é em torno de 2-2,5 x ¹⁰⁴ células/^cm2 (otimizar a densidade com base em experimentos individuais). Certifique-se de que os fibroblastos conectados tenham uma forma oval a redonda no segundo dia após a semeadura (Figura 3).

4. Produção de retrovírus codificando vetor MGT policstrônico para reprogramação cardíaca

1. Mantenha Plat-E com mídia de cultura Plat-E (DMEM suplementada com 10% FBS, 1 μg/mL de puromicina e 10 μg/mL de blasticidina) a 37 °C com 5% de _CO2.
2. No primeiro dia, divida o Plat-E para uma placa de 6 poços a aproximadamente 4-5 x ¹⁰⁵ células/densidade do poço.
3. No dia 2, o Plat-E normalmente atinge 80% de confluência. Transfetá as células com os seguintes procedimentos. Ajuste o volume e a quantidade de cada elemento aqui presente com base em cada poço em uma placa de 6 poços.
   1. Diluir 2 μg de pMX-puro-MGT de expressão retrovírus policistrônico vetor plasmídeo (Addgene 111809) a 500 ng/μL com tampão TE.
   2. Prepare a mistura de transfecção misturando 10 μL de Lipofectamina com 150 μL de meio soro reduzido. Pipeta cuidadosamente para misturar bem e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos. Tenha cuidado para evitar bolhas ao pipetar.
   3. Enquanto isso, prepare uma mistura de plasmídeo misturando o plasmídeo com 150 μL de meio soro reduzido. Pipeta cuidadosamente para misturar bem e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos. Tenha cuidado para evitar bolhas ao pipetar.
   4. Misture cuidadosamente as duas misturas e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos. A solução pode parecer nebulosa.
   5. Adicione a mistura gota a gota às células para ser transfeinada.
   6. Incubar as células a 37 °C durante a noite.
4. No dia 3, mude o meio para um meio de cultura celular completo fresco sem puramicina e blasticidina.
5. No dia 4, 48h após a transfecção, recolhe o supernatante que contém retrovírus e armazena-o em 4 °C.
6. No dia 5, 72 h após a transfecção, recolha o supernatante que contém retrovírus.
7. Filtre tanto a supernasce de 48 h quanto 72 h com um filtro de 0,45 μm, precipitar durante a noite a 4 °C adicionando 1/5 volume de 40% de solução poly (etileno glicol) (PEG) para fazer uma concentração final de 8% de PEG.
8. Centrifugar a 4.000 x g por 30 minutos para precipitar o vírus.
   NOTA: O vírus PEG8000 forma uma pequena precipitação branca.
9. Resuspenja o vírus com o meio de ICMS contendo 8 μg/mL de polibrene conforme desejado. Use o retrovírus imediatamente.

5. Reprogramação de NCFs para iCMs com infecção por retrovírus de codificação MGT

1. Crescer ou passar NCFs antes da infecção pelo vírus.
   NOTA: Normalmente, o NCF pode ser passagem duas vezes.
2. No dia 0, sementes NCF para a densidade em torno de 1-2 x ¹⁰⁴ células/^cm2 em meio FB.
3. No primeiro dia, substitua o meio de cultura por um meio contendo vírus para cada um bem como desejado. Use o vírus de um poço Plat-E em uma placa de 6 poços para infectar dois poços em uma placa de 24 poços. Titer o vírus para determinar a concentração ideal do vírus.
   NOTA: Vírus contendo outros fatores de reprogramação de interesse podem ser introduzidos juntamente com o retrovírus MGT.
4. Incubar a 37 °C durante a noite.
5. No dia 2, 24 h após a infecção pelo vírus, substitua o meio contendo vírus para um meio regular de ICMS.
6. Para monitorar a expressão GCaMP3, emplaque-a sob um microscópio de fluorescência invertida. Sob 10x no canal GFP, observe a leve fluorescência basal GCaMP3 de uma porção de células já no dia 5.
7. Substitua o meio a cada 2-3 dias durante a reprogramação. Se necessário, realize uma seleção positiva para células infectadas por retrovírus MGT adicionando 2 μg/mL de puramicina ao meio de cultura por 3 dias e mantendo-a a 1 μg/mL.
   NOTA: Introduzir produtos químicos de interesse (por exemplo, IGF-1, MM589, A83-01 e PTC-209, referido como IMAP como noticiamos ^{anteriormente15}) juntamente com a alteração média.
8. Após 14 dias de infecção, substitua o meio por meio B27 para induzir ainda mais a maturação do ICMS.

6. Avaliação da maturação funcional do ICMS e eficiência de reprogramação pelo fluxo ^Ca2+

NOTA: Adicione isoproterenol de 1 μM às células a serem avaliadas antes da avaliação, se necessário.

1. Avalie o fluxo ^ca2+ com um microscópio de fluorescência invertida à temperatura ambiente.
2. No canal GFP, observe as células GCaMP3+ abaixo do objetivo de 10x. Certifique-se de que ele mostra uma célula espontânea batendo no canal de campo brilhante.
3. Selecione aleatoriamente três campos abaixo de 20x e regise o fluxo ^ca2+ dos iCMs por 3 minutos para cada campo.
   NOTA: Aqui, o fluxo ^Ca2+ foi sincronizado com a batida celular espontânea (Figura 4, Figura 5 e Vídeo 3, Vídeo 4, Vídeo 5, Vídeo 6, Vídeo 7, Vídeo 8).
4. Quantifique manualmente as células com fluxo ^Ca2 +.

7. Análise estatística e apresentação de dados

1. Analise as diferenças entre os grupos de análise unidirecional de variância (ANOVA) e realize os testes de comparação múltipla Student-Newman-Keuls.
   NOTA: Os resultados são tão médios ± S.E com p < 0,05 considerado estatisticamente significativo. Cada experimento foi realizado pelo menos três vezes.

Resultados

O fluxo de trabalho experimental para gerar a cepa de camundongos Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 e a estrutura genética dos camundongos transgênicos é mostrado na Figura 1. Enquanto a cepa do camundongo é estabelecida, os corações dos filhotes foram isolados e observados sob um microscópio de fluorescência reversa para confirmar o genótipo. Corações com genótipo correto mostram fluxo ^Ca2+ sincronizado com batida, visualizado como fluorescência GCaMP3, enquanto...

Discussão

Avaliar a função iCMs é necessário para o campo de reprogramação cardíaca. Neste manuscrito, o protocolo descreve uma cepa de camundongos Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)^{26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J linhagem de camundongos que foi estabelecida, como usar os NCFs isolados dos camundongos neonatais nesta cepa para a reprogramação para iCMs, e a avaliação da função iCMs por ^ca2+ flux. Trata-se de um método de novo para avaliar o amadurecimento funcional dos ICMs.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	14-959-70C
50mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	14-959-49A
6 Well Cell Culture Plates	Alkali Scientific	TP9006
A83-01	Stemgent	04–0014
All-in-One Fluorescence Microscope	Keyence	BZ-X800E	Inverted fluorescence microscope
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Blasticidin S HCl (10 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	A1113903
Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder	Thermo Fisher Scientific	BP9706100
CD90.2 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec	130-049-101	Thy1.2 microbeads
Collagenase, Type 2	Thermo Fisher Scientific	NC9693955
Counting Chamber	Thermo Fisher Scientific	02-671-51B	Hemocytometer
DMEM, high glucose, no glutamine	Thermo Fisher Scientific	11960069
DPBS, calcium, magnesium	Thermo Fisher Scientific	14-040-133
Ethanol, 200 proof (100%)	Thermo Fisher Scientific	04-355-451
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS)	Thermo Fisher Scientific	E478-500
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	14025092
IMDM media	Thermo Fisher Scientific	12440053
IX73 Inverted Microscope	Olympus	IX73P2F	Inverted fluorescence microscope
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	11-668-019
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
Medium 199, Earle's Salts	Thermo Fisher Scientific	11150059
MidiMACS Separator and Starting Kits	Miltenyi Biotec	130-042-302
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized	Millipore Sigma	SLHV033RB
MM589			Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31-985-070
PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10-010-049
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line	Cell Biolabs	RV-101
pMx-puro-MGT	Addgene	111809
Poly(ethylene glycol)	Millipore Sigma	P5413-1KG	PEG8000
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR-1003-G
PTC-209	Sigma	SML1143–5MG
Puromycin Dihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	A1113803
Recombinant Human IGF-I	Peprotech	100-11
RPMI 1640 Medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
ST 16 Centrifuge Series	Thermo Fisher Scientific	75-004-381
Sterile Cell Strainers	Thermo Fisher Scientific	22-363-547	40 µm strainer
Surface Treated Tissue Culture Dishes	Thermo Fisher Scientific	FB012921
TE Buffer	Thermo Fisher Scientific	12090015
Trypan Blue solution	Millipore Sigma	T8154
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300054
Vortex Mixer	Thermo Fisher Scientific	02215365