Uma plataforma "caseira" acessível e eficiente para estudos comportamentais de Drosophila e um protocolo de acompanhamento para respirometria mitocondrial larval

Resumo

Fornecemos protocolos para qualquer pessoa com uma mente de "cultura maker" começar a construir um flylab para análise quantitativa de uma miríade de parâmetros comportamentais em Drosophila melanogaster, imprimindo em 3D muitos dos equipamentos necessários. Também descrevemos um protocolo de respirometria de alta resolução usando larvas para combinar dados comportamentais e do metabolismo mitocondrial.

Resumo

A utilidade da Drosophila como organismo modelo para o estudo de doenças humanas, comportamentos e biologia básica é inquestionável. Embora prática, a pesquisa de Drosophila carece de popularidade nos países em desenvolvimento, possivelmente devido à ideia mal informada de que estabelecer um laboratório e realizar experimentos relevantes com insetos tão minúsculos é difícil e requer aparelhos especializados e caros. Aqui, descrevemos como construir um flylab acessível para analisar quantitativamente uma miríade de parâmetros comportamentais em D. melanogaster, imprimindo em 3D muitos dos equipamentos necessários. Fornecemos protocolos para construir prateleiras internas para frascos, arenas de cortejo, aparelhos para ensaios locomotores, etc., para serem usados na manutenção geral de moscas e para realizar experimentos comportamentais usando moscas e larvas adultas. Também fornecemos protocolos sobre como usar sistemas mais sofisticados, como um oxígrafo de alta resolução, para medir o consumo de oxigênio mitocondrial em amostras larvais e mostrar sua associação com mudanças comportamentais nas larvas sobre a expressão xenotópica da oxidase alternativa mitocondrial (AOX). AOX aumenta a atividade larval e a respiração de vazamento mitocondrial e acelera o desenvolvimento em baixas temperaturas, o que é consistente com um papel termogênico para a enzima. Esperamos que esses protocolos inspirem pesquisadores, especialmente de países em desenvolvimento, a usar Drosophila para combinar facilmente dados de comportamento e metabolismo mitocondrial, o que pode levar a informações sobre genes e / ou condições ambientais que também podem regular a fisiologia humana e os estados de doença.

Introdução

Drosophila melanogaster foi introduzido na comunidade científica como um organismo modelo potencialmente poderoso há mais de 100 anos. Esse potencial foi firmemente validado em várias áreas das ciências biológicas e biomédicas, como genética, evolução, biologia do desenvolvimento, neurobiologia e biologia molecular e celular. Como resultado, seis Prêmios Nobel de Medicina ou Fisiologia foram concedidos a dez pesquisadores de Drosophila que contribuíram substancialmente para nossa compreensão da hereditariedade, mutagênese, imunidade inata, ritmos circadianos, olfato e desenvolvimento¹. Talvez mais importante, D. melanogaster não deixou de nos fornecer novos modelos de biologia humana e doenças, pois uma rápida pesquisa no PubMed revela quase 600 publicações nos últimos 5 anos, usando o termo de pesquisa "modelo de drosófila" (², em fevereiro de 2021). Nos EUA, onde a Drosophila é um organismo modelo amplamente difundido na comunidade biomédica, cerca de 2,2% de todos os prêmios de pesquisa R01 concedidos pelo NIH em 2015 foram alocados para pesquisadores de Drosophila ³. No Brasil, por outro lado, uma busca por projetos atualmente financiados no site da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), a mais importante agência de fomento à pesquisa em todas as áreas científicas do estado de São Paulo, mostrou apenas 24 auxílios e bolsas com Drosophila como objeto principal do estudo⁴. Considerando todos os 13205 projetos atualmente financiados pela FAPESP (⁵, em fevereiro de 2021), esses 24 projetos de Drosophila representam uma proporção de menos de 0,2% do total de projetos, quase 12 vezes menor do que a do NIH. Se removermos os projetos financiados que visam estudar Drosophila do ponto de vista ecológico e / ou evolutivo, e assumirmos que os projetos restantes usam esse organismo como modelo para entender os processos biológicos humanos na saúde e na doença, essa proporção diminui para chocantes ~ 0,1%.

De fato, uma investigação adequada é necessária para revelar as razões pelas quais a pesquisa de Drosophila no Brasil / São Paulo não parece ser tão significativa em número de projetos financiados. A cultura de Drosophila não é cara ^6,7,8 e é relativamente simples, pois, ao contrário dos vertebrados, nenhuma permissão de um comitê bioético é necessária para a experimentação ^9,10. No entanto, no Brasil é necessária uma aprovação para trabalhar com linhas de mosca geneticamente modificadas¹¹, acrescentando uma camada de burocracia inerente a todo trabalho envolvendo organismos geneticamente modificados. No entanto, isso provavelmente não impediria os pesquisadores interessados de iniciar um flylab. Especulamos que a desinformação sobre o poder do modelo e sobre os altos custos esperados associados à criação de um flylab e à realização de experimentos significativos são fatores importantes nessa decisão. Quanto à maioria dos equipamentos e suprimentos científicos, os aparelhos apropriados para realizar a manutenção geral das moscas e análises comportamentais devem ser importados para o Brasil da América do Norte, Europa e/ou outros lugares, o que é um processo caro e extremamente demorado^12,13.

Recentemente, surgiu uma alternativa à importação de aparelhos especializados à medida que as impressoras 3D se tornaram mais acessíveis e acessíveis a qualquer pessoa, incluindo pesquisadores de Drosophila em países em desenvolvimento. A tecnologia de impressão 3D tem sido amplamente utilizada nos últimos 10 anos por membros da "cultura maker", que se baseia na ideia de autossuficiência em vez de depender exclusivamente de produtos fabricados pela empresa¹⁴. Tal ideia sempre esteve presente em laboratórios de pesquisa acadêmica em todo o mundo, por isso não é surpreendente que as impressoras 3D tenham se tornado equipamentos de laboratório padrão em muitos lugares ^15,16. Por vários anos, imprimimos em 3D racks de frascos de mosca, arenas de acasalamento, aparelhos de escalada, entre outros dispositivos, por uma fração do custo de equivalentes de marca. Os custos reduzidos de impressão e montagem de equipamentos de laboratório caseiros são classicamente representados pelo FlyPi, que pode ser construído por menos de € 100,00 e serve como um microscópio de luz e fluorescência capaz de usar estimulação optogenética e termogenética sofisticada do peixe-zebra, Drosophila e nematóides geneticamente tratáveis¹⁵. Aqui, fornecemos uma série de protocolos para qualquer pessoa interessada em se tornar um pesquisador de Drosophila (ou em expandir seu próprio flylab existente) para imprimir em 3D muitos dos materiais necessários. Investindo tempo e desenvolvendo um pouco de experiência, o leitor poderá até otimizar os protocolos aqui apresentados para imprimir aparelhos mais adaptados às suas próprias necessidades de pesquisa.

No entanto, um flylab não é um lugar apenas para equipamentos "baratos", especialmente quando se pretende associar análises comportamentais a fenômenos metabólicos subjacentes. Também nos interessamos pelos papéis das mitocôndrias na modulação dos padrões comportamentais de Drosophila, pois essas organelas são responsáveis pela produção em massa de ATP na maioria dos tecidos por meio de várias vias metabólicas cujos produtos convergem para a fosforilação oxidativa (OXPHOS). Analisar o consumo de oxigênio mitocondrial como uma forma de entender o metabolismo mitocondrial requer um oxígrafo, que é um equipamento mais sofisticado que infelizmente ainda não pode ser impresso em 3D. Como o OXPHOS afeta praticamente todos os processos celulares, uma vez que depende de uma série de reações redox exergônicas que ocorrem na célula^17,18, as taxas de consumo de oxigênio baseadas no substrato oxidável fornecido às mitocôndrias podem ajudar a revelar se o funcionamento da organela é causa ou consequência de um determinado comportamento. Portanto, também fornecemos aqui um protocolo para medir o consumo de oxigênio mitocondrial em amostras de larvas, pois percebemos que a grande maioria dos protocolos publicados está focada na análise de amostras de adultos. Mostramos que alterações na respiração mitocondrial, induzidas pela expressão transgênica da Ciona intestinalis alternative oxidase (AOX), levam ao aumento da mobilidade larval sob estresse pelo frio. Isso provavelmente se deve à termogênese, uma vez que a AOX é uma oxidase terminal não bombeadora de prótons que pode contornar a atividade dos complexos OXPHOS III E IV (CIII e CIV), sem contribuir para o potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) e produção de ATP 19,20,21. Nenhum inseto, incluindo Drosophila, ou vertebrado possui naturalmente AOX 21,22,23, mas sua expressão em uma miríade de sistemas modelo 24,25,26,27,28,29 tem sido bem-sucedida em mostrar seu potencial terapêutico para condições de estresse respiratório mitocondrial geral, especialmente quando causado por CIII e/ou CIV sobrecarga. A AOX confere resistência a níveis tóxicos de antimicina A²⁴ e cianeto^24,25 e atenua diversos fenótipos relacionados à disfunção mitocondrial 24,25,30,31,32. O fato de a expressão de AOX alterar o comportamento larval e a função mitocondrial justifica estudos mais aprofundados sobre os papéis dessa enzima no metabolismo e fisiologia de células e tecidos metazoários^33,34.

Esperamos que, com este artigo, possamos ajudar a conscientizar a comunidade científica de países em desenvolvimento, como o Brasil, de que o uso do excelente conjunto de ferramentas genéticas que D. melanogaster apresenta, em combinação com aparelhos caseiros eficientes e acessíveis para análises comportamentais, pode gerar dados de pesquisa básica relativamente rápidos sobre processos biológicos interessantes com impacto translacional significativo. apoiando futuros estudos terapêuticos em pesquisa clínica. O desenvolvimento de tais ideais comunais beneficiaria muito os drosófilos, pesquisadores médicos e as ciências biológicas e biomédicas. Mais importante ainda, beneficiaria a sociedade em geral, pois o financiamento público poderia ser aplicado de forma mais translacional para entender e tratar doenças humanas.

Os protocolos que fornecemos aqui para impressão 3D dos aparelhos para um flylab foram projetados para uso com a impressora 3D RepRap, baseada no modelo Prusa I3 DIY disponível em³⁵. Usamos o filamento branco de ácido polilático (PLA) de 1,75 mm (SUNLU) como matéria-prima para impressão, a plataforma Tinkercad³⁶ para design de modelo e o software Repetier-Host³⁷ para conversão de STL para G-Code, uma etapa necessária para fornecer coordenadas à impressora. É necessária uma otimização adicional dos protocolos caso o leitor queira usar equipamentos, materiais e softwares alternativos.

Protocolo

1. 3D design do modelo

NOTA: O fluxo de trabalho para impressão 3D tem três etapas básicas: (1) modelagem 3D; (2) importar o modelo para o software de fatiamento; e (3) selecionar o filamento correto, configurar a impressora e, finalmente, imprimir. Um protocolo básico para modelar um pequeno porta-frascos/bandeja de frascos para moscas é mostrado abaixo; Este rack deve ser usado com frascos de mosca padrão, que têm aproximadamente 2,5 cm de diâmetro e 9,8 cm de altura. Para novos projetos de modelos, as ferramentas fornecidas pelo software Tinkercad permitem o fácil manuseio de estruturas tridimensionais, criando peças de diferentes formas, tamanhos e espessuras, de acordo com as próprias necessidades. Para os drosolistas que se aventuram pela primeira vez no reino da impressão 3D, seguir os protocolos abaixo, mesmo com todos os seus detalhes, ainda pode ser um desafio, por isso recomendamos fortemente que você se familiarize com o software para obter melhores resultados.

1. Faça login no Tinkercad online³⁸ (Figura 1A). É necessário o cadastro prévio com informações pessoais para acessar a plataforma, gratuitamente.
2. Clique em Criar um novo projeto para iniciar um novo design e renomeie o projeto de acordo com o canto superior direito da janela. Pressione Enter para ser direcionado para o plano de trabalho do projeto (Figura 1B).
3. Verifique se o plano de trabalho tem as dimensões corretas de 200 mm x 200 mm, clicando com o botão esquerdo do mouse em Editar grade no canto inferior direito (quadrado vermelho na Figura 1B). Na janela pop-up (Figura 1C), certifique-se de que as "Unidades" sejam milímetros e as "Predefinições" sejam padrão. Digite 200,00 nos campos "Largura" e "Comprimento" e clique em Atualizar grade para salvar as alterações.
4. Verifique se a grade de snap está definida como 1,0 mm (quadrado vermelho na Figura 1B). Se não estiver, clique no menu suspenso e selecione 1,0 mm.
5. No menu Basic Shapes à direita (quadrado azul 2 na Figura 1B), selecione uma caixa sólida e arraste-a para o centro do plano de trabalho.
6. Clique em qualquer lugar na caixa no plano de trabalho com o botão esquerdo do mouse para ver suas arestas e vértices. Clique em qualquer vértice (que ficará vermelho) para mostrar as dimensões da caixa (quadrados vermelhos na Figura 1D). Clique com o botão esquerdo do mouse em cada dimensão e digite 130 mm para comprimento (L), 130 mm para largura (L) e 40 mm para altura (A). Recentralize a caixa arrastando-a para o meio do plano de trabalho.
7. Clique na ferramenta Régua no canto superior direito da tela (quadrado vermelho 1 na Figura 1E). Clique imediatamente no vértice inferior esquerdo da caixa, conforme indicado na Figura 1E (quadrado vermelho 2), para definir o ponto inicial (x = 0, y = 0, z = 0) de um sistema de coordenadas cartesianas tridimensional. Observe que a distância entre o vértice selecionado e o ponto inicial da coordenada agora será exibida (quadrados vermelhos na Figura 1F), onde "A", "B" e "C" representam a distância até os eixos x, y e z (que deve ser zero neste caso), respectivamente.
8. Em seguida, selecione uma caixa vazia (furo) no menu Formas básicas à direita (quadrado azul 2 na Figura 1B) e arraste-a para o plano de trabalho. Defina suas dimensões para 30 (C) x 30 (L) x 40 (A) mm e eleve-o 2 mm do plano de trabalho, digitando "2,00" na caixa de texto ao lado da ponta de seta verde no canto inferior direito da caixa vazia (quadrado vermelho na Figura 1G). Posicione a caixa vazia dentro da caixa sólida a 2 mm de distância do ponto inicial da coordenada x,y, digitando "2.00" nas caixas de texto ao lado das setas verdes no canto inferior esquerdo da caixa (quadrados vermelhos na Figura 1H; compare com a Figura 1G).
9. Com a caixa vazia ainda selecionada, pressione as teclas CtrL+D no teclado para implantar o comando "duplicar" e criar uma nova caixa vazia com exatamente as mesmas dimensões. Posicione a nova caixa vazia dentro da caixa sólida, ao lado da primeira caixa vazia, digitando "34.00" na caixa de texto ao lado da seta verde ao longo do eixo y e "2.00" nas caixas de texto ao lado das duas setas verdes restantes (quadrados vermelhos na Figura 1I).
10. Repita esta etapa, ajustando para as distâncias corretas do ponto inicial da coordenada, até que toda a caixa sólida seja preenchida com caixas vazias espaçadas de 2 mm umas das outras (Figura 1J).
11. Selecione todas as caixas (sólidas e vazias) clicando com o botão esquerdo do mouse e arrastando para toda a área. Pressione as teclas CtrL+G no teclado para implantar o comando "group" e criar uma única caixa com 16 espaços vazios para frascos de mosca (Figura 1K). Este é o design final do rack de frascos.
12. Clique em Exportar no canto superior direito da janela do Tinkercad. Na caixa da janela exibida (Figura 1L), selecione Tudo no design ao lado de Incluir e . STL em Para impressão 3D como o tipo de arquivo. Escolha um nome próprio para o arquivo de design e salve-o em um local apropriado no computador.

2. 3D impressão

NOTA: Nesta seção, fornecemos instruções sobre como usar o arquivo STL criado na Etapa 1 e convertê-lo no arquivo G-Code que contém as instruções de impressão na impressora 3D. Este é o processo de fatiamento, para o qual usamos o software Repetier-Host.

1. Baixe o Arquivo Suplementar 1 e salve-o em um local apropriado no computador. Este é um arquivo .rcp que contém as configurações da impressora a serem usadas abaixo. Para obter mais informações sobre o tipo de arquivo .rcp, visite³⁹.
2. Abra o software Repetier-Host, que já deve estar instalado no computador, seguindo as instruções do³⁷. Pressione as teclas CtrL+O no teclado para abrir o arquivo STL no computador criado no Protocolo 1.
3. Uma vez aberto, clique no rack de frascos projetado e pressione a tecla R no teclado para abrir o menu de edição no lado direito da tela (quadrado vermelho 1 na Figura 2A). Centralize o objeto na mesa de impressão clicando no botão Center Object , indicado com o quadrado vermelho 2 na Figura 2A, na guia Object Placement .
4. Clique na guia Slicer (quadrado vermelho 1 na Figura 2B) ao lado da guia Object Placement e, em seguida, clique no botão Configuration (quadrado vermelho 2 na Figura 2B) abaixo. Observe que uma nova janela à esquerda será aberta onde os parâmetros da impressora, como velocidade, espessura da camada e suportes, podem ser definidos (veja mais detalhes na discussão abaixo).
5. Clique no botão Import (quadrado vermelho 3 na Figura 2E), selecione Supplemental File 1 nos arquivos e pressione Enter. Observe que este arquivo .rcp (baixado na etapa 2.1) fornece os parâmetros para a configuração automática da impressora que otimizamos para este rack de frascos.
6. Para finalizar a configuração dos parâmetros de impressão, selecione Nenhum para Tipo de suporte no menu à direita (quadrado vermelho 4 na Figura 2E), pois a impressão desta peça não requer um suporte para evitar dobras ou outras deformidades. Em Densidade de preenchimento (quadrado vermelho 5 na Figura 2E), escolha 20% para criar uma estrutura sólida (veja mais detalhes sobre esses parâmetros na discussão abaixo).
7. Clique em Fatiar com CuraEngine no canto superior direito da tela para executar o programa de fatiamento e gerar o G-Code, que possui as informações necessárias para que a impressora imprima a peça. Observe que, na guia Visualização de impressão no menu à direita (ao lado da guia Segmentação de dados), as informações sobre o tempo e a quantidade de material necessário para que o trabalho de impressão seja concluído serão exibidas (quadrado vermelho 1 na Figura 2F).
8. Clique em Save for SD Print para salvar o G-Code file em um cartão SD (quadrado vermelho 2 na Figura 2F). Observe que o G-Code contém as coordenadas 3D da peça projetada, cortadas em camadas, para o funcionamento adequado da impressora.
9. Insira o cartão SD na impressora 3D RepRap e siga as informações exibidas na tela da impressora para selecionar a impressão do cartão SD.
10. Selecione o G-Code file do rack do frasco. Observe que a impressora aquecerá automaticamente e começará a imprimir a peça projetada, o que deve levar várias horas. O rack (Figura 3A) deve estar pronto para uso imediatamente após a conclusão do trabalho de impressão.

3. Aparelhos de análise comportamental

NOTA: As etapas descritas nos Protocolos 1 e 2 podem ser repetidas com os ajustes apropriados para imprimir vários dos equipamentos de laboratório necessários. No entanto, percebemos que projetar novas peças pode ser desafiador e demorado para usuários iniciantes do Tinkercad, então, em vez de fornecer protocolos passo a passo sobre como projetar todos os modelos, estamos disponibilizando para download vários modelos de design que criamos como arquivos STL (consulte Arquivos Suplementares 2-11).

1. Faça o download do Arquivo Suplementar 2 para um modelo de um pequeno funil (Figura 3B), usado rotineiramente em flylabs para ajudar a transferir moscas adultas para novos frascos ou garrafas, evitando que as moscas subam pelas paredes internas desses recipientes para escapar.
2. Faça o download do Arquivo Suplementar 3 para obter um suporte de tapete de batida (Figura 3C), que pode conter uma espuma de etileno-acetato de vinila ou um tapete de algodão grosso no qual frascos ou garrafas de vidro podem ser batidos quando se está colocando moscas em novos recipientes com alimentos feitos na hora.
3. Faça o download do Arquivo Suplementar 4 e do Arquivo Suplementar 5 para o modelo de um suporte de câmera que chamamos de Stalker (Figura 3D).
   NOTA: O aparelho permite que qualquer câmera (profissional, webcams, celulares, etc.) seja posicionada em cima de uma base onde uma placa de Petri contendo larvas ou moscas adultas pode ser fotografada ou gravada em vídeo. O Stalker permite a obtenção de imagens do comportamento animal que ocorre horizontalmente, sempre à mesma distância da placa de Petri, o que evita a introdução de variabilidade nas medições experimentais se as gravações precisarem ser feitas em dias diferentes, por exemplo, ou se a câmera precisar ser usada para outra finalidade entre as gravações. O aparelho é convenientemente modular e pode ser facilmente montado após a impressão da base e da parte superior do Arquivo Suplementar 4 e das laterais do Arquivo Suplementar 5. Os quadrados de 1 cm² na base, que podem ser destacados usando um marcador permanente, ajudam a rastrear a distância percorrida por animais individuais. Imprima o aparelho (pelo menos a base) usando filamento branco, para que haja contraste suficiente entre o fundo e os animais para que o software de rastreamento identifique cada mosca.
4. Faça o download do Arquivo Suplementar 6 para o design imprimível do Fly Motel (Figura 3E), que possui dez arenas de namoro e acasalamento (quartos) organizadas de forma a facilitar as gravações de vídeo de dez pares individuais de acasalamento por vez. Observe que o Fly Motel é baseado no dispositivo publicado em⁴⁰, onde se encontra uma explicação detalhada para seu uso em estudos comportamentais. Além das peças impressas em 3D, o aparelho requer 12 parafusos (3 x 8 mm) para fixar a parte superior à inferior para estabilizar o dispositivo montado, uma placa de acrílico (60 x 60 x 3 mm) e um zíper apertado. Como a estrutura do Fly Motel é mais complexa, também fornecemos um vídeo instrutivo (Arquivo Suplementar 7) de como montá-lo corretamente, uma vez que todas as peças necessárias e uma chave de fenda estão disponíveis.
5. Faça o download do Arquivo Suplementar 8 para o modelo de um T-Maze (Figura 3F), que é usado para ensaios de memória usando moscas adultas. Uma explicação detalhada de como o T-Maze é usado para fazer as moscas associarem estímulos de odor repulsivo ao seu comportamento fototrópico é encontrada na publicação original⁴¹. O aparelho também faz uso de dois tubos cônicos translúcidos de 15 mL, que são comumente encontrados em qualquer laboratório e são fixados nas aberturas circulares de 2 cm de largura em cada lado da peça central. Observe que a impressão do T-Maze requer um suporte (veja mais detalhes na legenda da Figura 2). Selecione "Em todos os lugares" para Tipo de suporte (quadrado vermelho 4 na Figura 2E) após seguir as etapas 2.1-2.6 acima.
6. Baixe o Arquivo Suplementar 9 e o Arquivo Suplementar 10 para o projeto das partes imprimíveis de nossa versão do aparelho para ensaios de geotaxia negativa iterativa rápida (RING) (Figura 3G), usados para realizar ensaios de escalada com moscas adultas de vários genótipos ou condições ambientais simultaneamente, gerando resultados de forma mais padronizada e de maior rendimento⁴². O aparelho RING também é modular e, além das peças impressas em 3D, requer outras peças que podem ser facilmente adquiridas online ou em uma loja de ferragens a baixo custo: dois eixos retificados de Φ8 x 300 mm, quatro rolamentos lineares de Φ8 mm, elásticos (ou pedaços de corda), um pedaço de madeira de 240 x 60 x 20 mm para a base, e oito parafusos de madeira (8 mm) para fixar as peças impressas à base de madeira. Baixe o Arquivo Suplementar 11 para obter instruções sobre como montar o dispositivo depois que todas as peças forem impressas ou compradas. Uma explicação detalhada de como usar o aparelho RING é encontrada na publicação original⁴².

4. Ensaio de mobilidade larval

NOTA: Otimizamos este protocolo, originalmente baseado em Nichols et ^al.42, para estudar os efeitos da expressão de AOX no desenvolvimento de Drosophila sob estresse pelo frio. As linhagens 3xtubAOX²⁵ e w¹¹¹⁸, utilizadas como exemplos de larvas que expressam AOX e controle, respectivamente, foram cultivadas em dieta padrão²⁴ a 12 °C, de acordo com Saari et al.34. Recomendamos este protocolo para analisar a mobilidade de amostras larvais de qualquer condição genética, cultivadas sob qualquer condição ambiental de interesse.

1. Prepare placas de ágar 2% fervendo a quantidade equivalente de ágar em água deionizada, despejando em placas de Petri de Φ90 X 15 mm e deixando-as solidificar à temperatura ambiente. Para placas com um volume final de 20 mL cada, use 0,4 g de ágar.
2. Colete cuidadosamente as larvas L3 errantes da lateral dos frascos/frascos de cultura usando uma pinça de ponta redonda ou uma escova e coloque os indivíduos em uma placa de Petri de Φ90 x 15 mm com água deionizada por menos de 10 segundos para enxaguar as partículas de alimentos presas ao corpo.
3. Transfira a larva individual para pratos com agarose e espere 5 minutos para que os animais se aclimatem.
4. Posicione os pratos contendo a larva individual em cima de um papel milimetrado (grade de 0,2 cm² ) e conte o número de linhas cruzadas pelo animal por 1 minuto, enquanto ele se move em cima do ágar. Cada linha cruzada representa uma distância de 2 mm. Repita o procedimento com o mesmo indivíduo 10-15 vezes para obter réplicas técnicas.
5. Repita a etapa 4.4 com pelo menos 8-10 indivíduos de diferentes tubos/frascos, cultivados em momentos diferentes para obter réplicas biológicas da mesma linhagem.
6. Repita as etapas 4.4 e 4.5 para obter dados para a outra linha de voo (ou para quantas linhas se pretende analisar).
7. As mesmas larvas individuais usadas nas etapas 4.4-4.6 podem ser usadas para obter dados adicionais sobre o movimento do corpo, colocando as placas de ágar com uma larva individual sob um estereomicroscópio e contando o número de contrações peristálticas da parede corporal por 1 minuto. Obter réplicas técnicas e biológicas para uma estimativa da mobilidade média entre as linhas de mosca analisadas.
8. Aplicar o teste estatístico para calcular a probabilidade de os valores desses parâmetros de mobilidade larval serem distintos entre as linhas de interesse. Como estamos comparando aqui dados de apenas duas linhas, um teste t de Student pode ser aplicado.

5. Respirometria mitocondrial usando homogeneizados larvais

NOTA: O protocolo a seguir foi otimizado para medir o consumo de oxigênio mitocondrial de homogeneizados larvais da linhagem 3xtubAOX que expressa AOX e do controle w¹¹¹⁸, cultivados a 12°C, mas também recomendamos que seja usado para amostras larvais de quaisquer condições genéticas e ambientais. Percebemos que a realização de tais experimentos não deve ser incluída como uma meta "acessível" para um flylab "caseiro", ao contrário de todos os outros protocolos que fornecemos neste artigo, pois um investimento inicial considerável deve ser feito para um laboratório adquirir um oxígrafo de alta resolução. O protocolo deve ser usado com o Oxygraph-2k (O2k) e o software DatLab da Oroboros Instruments, portanto, é necessária uma otimização adicional caso o leitor queira usar um equipamento alternativo.

1. Ligue o O2k e inicie o software DatLab no computador conectado ao oxígrafo. As barras magnéticas dentro das câmaras de ensaio devem começar a se mexer automaticamente. Remover a solução de armazenamento de etanol das câmaras.
2. Lave as câmaras pelo menos 3 vezes com etanol 100% e 3 vezes com água ultrapura.
3. No DatLab, a janela O2k Control será aberta automaticamente. Em Bloquear temperatura [°C], insira 12 °C (ou a temperatura preferida na faixa de 2-47 °C) e pressione OK.
4. Uma segunda janela, Editar experimento, será aberta automaticamente. Insira os nomes das amostras nos campos Amostra , de acordo com o que será adicionado nas câmaras A e B, e pressione Salvar.
5. Adicione 1800 μL do tampão de ensaio (120 mM KCl, 5 mM KH₂PO₄, 3 mM Hepes, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl₂, 2% BSA, pH 7,4) em cada câmara e feche-as parcialmente, permitindo ainda a troca de oxigênio com o ar externo. Deixe os sinais de concentração de oxigênio e fluxo de oxigênio se estabilizarem, mostrando flutuações mínimas por pelo menos 10 min. Esta etapa fornecerá a calibração do equipamento com o ar externo no dia do experimento (consulte as etapas 6.3 e 6.4 abaixo para obter mais detalhes sobre as calibrações experimentais).
6. Durante a fase de calibração do ar, iniciar a preparação das amostras recolhendo cuidadosamente dos tubos/frascos de cultura 20 larvas errantes do genótipo adequado, utilizando um fórceps ou um pincel pequeno.
7. Enxágue cada larva de forma rápida, mas completa, com água deionizada ou 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na₂HPO₄ e 2 mM KH₂PO₄) e transfira-as para um homogeneizador de vidro de 1 mL em gelo, contendo 500 μL de tampão de isolamento gelado (250 mM de sacarose, 5 mM de Tris HCl, 2 mM EGTA, pH 7,4)
8. Homogeneizar as larvas inteiras com 5 golpes e despejar o homogenato em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL no gelo.
9. Adicione 300 μL de tampão de isolamento ao homogeneizador de vidro, macere os tecidos larvais restantes com 3 golpes e despeje o homogeneizado novamente no mesmo tubo de microcentrífuga no gelo.
10. Adicione 200 μL de tampão de isolamento ao homogeneizador de vidro, macere ainda mais os tecidos larvais residuais com 2 golpes e despeje o homogeneizado novamente no mesmo tubo de microcentrífuga no gelo.
11. Misturar o homogeneizado final (~1 ml) invertendo o tubo duas vezes suavemente e mantê-lo no gelo até que a segunda amostra seja processada.
12. Repita as etapas 5.6-5.11 para obter o homogeneizado larval do outro genótipo.
13. Abra as câmaras do oxígrafo A e B e transfira 200 μL de cada homogeneizado para o tampão de ensaio em cada câmara, que deve estar exatamente a 12 ° C neste ponto. Feche completamente as câmaras e deixe os sinais de concentração de oxigênio e fluxo de oxigênio se estabilizarem por aproximadamente 10 min.
14. Inicie as medições do consumo de oxigênio adicionando a cada câmara 5 μL de uma solução de piruvato 2 M, prolina 2 M (concentração final nas câmaras = 5 mM cada) e 7,5 μL de uma solução de malato 0,4 M (1,5 mM). Aguarde pelo menos 5 minutos para estabilização do sinal. Observe que, neste ponto, as mitocôndrias serão carregadas com substratos oxidáveis para iniciar as reações do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA). Qualquer aumento no sinal de consumo de oxigênio pode ser devido às funções das proteínas de desacoplamento (ou devido a outros fenômenos de desacoplamento) e pode ser usado para calcular a respiração geral desacoplada (também conhecida como respiração de vazamento na ausência de adenilatos, L_N- consulte Resultados representativos para obter detalhes).
15. Adicione a cada câmara 4 μL de uma solução de ADP 0,5 M (1 mM) e aguarde pelo menos 5 minutos para estabilização do sinal. Um aumento significativo no sinal de consumo de oxigênio é geralmente observado imediatamente, representando a respiração fosforilativa oxidativa (OXPHOS). A grande maioria dessa respiração OXPHOS é impulsionada pelo complexo I (CI).
16. Adicione a cada câmara 2 μL de uma solução de antimicina A 0,05 M (0,05 mM) para inibir o CIII e aguarde pelo menos 5 minutos para estabilização do sinal. Deve observar-se uma diminuição do sinal de consumo de oxigénio até aos níveis basais observados antes da adição de piruvato, prolina e malato para a amostra de controlo w¹¹¹⁸ . A respiração mitocondrial das larvas que expressam AOX será parcialmente resistente à antimicina-A, pois os elétrons agora podem ser direcionados para AOX. Cerca de 40% da respiração total do OXPHOS deve permanecer após a inibição do CIII, que deve ser suportada exclusivamente pela AOX.
17. Adicione a cada câmara 4 μL de uma solução de galato de propila 0,1 M (0,2 mM) para inibir o AOX e aguarde pelo menos 15 minutos para estabilização do sinal. Os níveis de consumo de oxigênio nas amostras de larvas que expressam AOX devem agora diminuir para os níveis basais observados antes da adição de piruvato, prolina e malato. Essa diminuição prova que a respiração resistente à antimicina-A observada é devida à função AOX.
18. Adicione a cada câmara 1 μL de rotenona 0,01 M (0,005 mM) para inibir o IC e aguarde pelo menos 5 minutos para a estabilização do sinal para obter o sinal de consumo de oxigênio da amostra independente da respiração mitocondrial. Este sinal é geralmente tão baixo quanto o observado antes da adição de piruvato, prolina e malato.
19. Salve o experimento e feche o software DatLab.

6. Processamento de dados de respirometria mitocondrial

NOTA: Os valores de consumo de oxigénio são obtidos como uma média dos sinais de fluxo de oxigénio num determinado período de tempo e são expressos em pmol O₂ consumido por segundo por mg de proteína total na amostra. Os valores são primeiro referenciados em relação à concentração máxima de oxigénio disponível no tampão de ensaio no dia da experiência, com base na temperatura experimental (referida como saturação do ar) e na concentração mínima de oxigénio, que é determinada previamente em cada câmara pela adição de Na₂S₂O₄ ao tampão de ensaio (ver ⁴³ para as diretrizes do fabricante para obter calibração zero de oxigênio). Os valores também são normalizados pela quantidade de proteína total nos homogeneizados larvais adicionados ao tampão de ensaio de cada câmara.

1. Determinar a concentração total de proteínas de cada amostra utilizando o método de Bradford⁴⁴. Reabra o experimento salvo no software DatLab, pressione Experimento no menu superior e, em seguida, Editar. Na janela aberta, selecione mg na seção Unidade e, na seção Quantidade , insira a quantidade de proteína contida nos 200 μL da amostra adicionada em cada câmara. A concentração será calculada automaticamente pelo software, considerando o volume total da câmara de 2 mL. Pressione o botão Salvar .
2. Pressione Gráfico no menu superior e, em seguida, Selecionar gráficos. Na janela aberta, selecione Fluxo por massa para ambos os gráficos (1 e 2, que se referem às câmaras A e B, respectivamente). Pressione Ok. O resultado experimental agora é normalizado pela concentração de proteína das amostras (pmol O₂/s/mg de proteína total).
3. No canto superior direito de cada gráfico (1 e 2) da página principal de resultados experimentais, clique em Concentração de O₂. Ao longo do eixo x, identifique um intervalo de tempo antes da adição das amostras nas câmaras, no qual a concentração de oxigênio e os sinais de fluxo são muito estáveis.
   1. Pressione e segure a tecla Shift no teclado do computador, clique com o botão esquerdo do mouse na hora inicial selecionada, arraste o cursor ao longo do eixo de tempo para selecionar a região desejada e solte o botão do mouse. Faça este procedimento para cada um dos gráficos individualmente.
   2. Clique duas vezes nas barras azuis das áreas selecionadas na parte inferior dos gráficos e digite "ar" para indicar que essas são as regiões selecionadas usadas para calcular a saturação do ar de oxigênio.
4. Clique em Calibração na barra de menu superior e selecione A: Oxigênio, O₂ para calibrar a câmara A. Na janela aberta, verifique se O₂ Calib está selecionado (cor amarela).
   1. Para a calibração zero, clique em Copiar do file e escolha o file com a calibração de oxigênio zero realizada anteriormente (consulte ⁴³ para as diretrizes do fabricante).
   2. Para Calibração de ar, selecione ar na coluna Selecionar marca . Clique em Calibrar e copie para a área de transferência.
5. Clique em Calibração na barra de menu superior, selecione B: Oxigênio, O₂ e repita a etapa 6.4 para calibrar a câmara B.
6. No canto superior direito de cada gráfico (1 e 2) da página principal de resultados experimentais, clique em O₂ fluxo por massa. Selecione as regiões estáveis desejadas do sinal de consumo de oxigênio segurando a tecla Shift no teclado, clicando com o botão esquerdo do mouse e arrastando o cursor ao longo do eixo do tempo. As regiões estáveis selecionadas entre as adições de piruvato/prolina/malato e ADP representam o _{L N}; entre ADP e antimicina A, OXPHOS; entre antimicina A e galato de propila (após inibição de CIII), respiração resistente à antimicina A; entre galato de propila e rotenona (após inibição de CIII + AOX), respiração residual; após rotenona (após inibição de CI+CIII+AOX), respiração não mitocondrial residual. Clique duas vezes nas barras vermelhas das áreas selecionadas na parte inferior dos gráficos e insira os rótulos apropriados.
7. Clique em Marcas na barra de menu superior e, em seguida, em Estatísticas. Na guia Mostrar da janela aberta, desmarque todas as opções, exceto o fluxo de O₂ por massa. Na guia Selecionar da mesma janela, selecione a câmara A para obter os dados de respiração para a primeira amostra. Clique em Copiar para a área de transferência e cole os dados em uma planilha. Repetir o procedimento para obter os dados para a segunda amostra na câmara B.
8. Em uma planilha, subtraia todos os valores de respiração pela respiração residual não mitocondrial (os dados após a adição de rotenona). Calcule as médias de várias réplicas experimentais e plote os dados conforme preferir.

Resultados

Seguindo as etapas dos Protocolos 1 e 2, deve-se ser capaz de projetar um simples suporte para frascos de mosca e executar o arquivo STL do modelo por meio do programa de fatiamento para gerar coordenadas para a impressora 3D. A Figura 3A mostra uma unidade impressa do modelo ao lado de seu design. Também esperamos que a etapa 1 possa fornecer as habilidades básicas para usar as formas básicas disponíveis na plataforma Tinkercad para criar aparelhos úte...

Discussão

Os protocolos de impressão 3D e arquivos STL fornecidos aqui destinam-se a facilitar a configuração de um novo flylab ou aumentar o repertório de aparelhos em uma instalação comportamental de Drosophila existente, usando equipamentos "caseiros". A estratégia de impressão 3D pode ser particularmente útil em países em desenvolvimento como o Brasil, onde a pesquisa usando Drosophila como organismo modelo para estudar biologia humana parece estar sub-representada ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer RapRep			A popular 3D-printer based on the Prusa I3 DIY mode, instructions available in https://www.instructables.com/Building-a-Prusa-I3-3D-Printer-Revisited/
3xtubAOX fly line	Howy Jacobs´s lab, Tampere University		Drosophila line expressing the AOX gene from C. intestinalis under the control of the constitutive α-tubulin promoter. 5 and 6 copies of this construct are present in males and females in homo/hemizigosity, respectively, one in each of the chromosomes X, 2 and 3.
Acrylic plate			60 x 60 x 3 mm
ADP	Sigma-Aldrich	A2754	Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 20398-34-9); ≥95%; molecular weight = 427.20 g/mol; solubility in water at 50 mg/ml
Antimycin-A	Sigma-Aldrich	A8674	Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight ~ 548.63 g/mol; solubility in 95% ethanol at 50 mg/mL
Agar	Kasv	K25-611001	For bacteriologal use; powder; solidifying agent (12-20 g/L)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	Heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free (CAS number 9048-46-8);pH 7; ≥98%; solubility in water 40g/ml
Deionized water
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 67-42-5); ≥97%; molecular weight = 380.35g/mol
Ethanol 99.5%
Ethylene-vinyl acetate foam			Can be replaced with thick pieces of cotton
Graph paper			0.2 cm2 grid
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9), BioPerformance Certified; ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight =238.30g/mol
Homogenizer	Sartorius		Hand glass homogenizer (S), 1 mL; composed of a cylinder made of borosilicate glass plus plunger S; often used for simple sample preparation, e.g. crushing of tissue samples.
KCl	Amresco	0395-2	Potassium chloride (CAS number 7447-40-7); ≥99,0%; molecular weight = 74.55g/mol
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379	Potassium phophate monobasic (CAS number 7778-77-0); ReagentPlus; molecular weight = 136.09g/mol
Linear bearings (LM8UU)			8 mm, any brand
Malate	Sigma-Aldrich	M1000	L-(-)-Malic acid (CAS number 97-67-6); ≥95-100%; molecular weight = 134.09 g/mol), solubility in water: 100 mg/mL. A solution is pH adjusted to approximately 7.0.
MgCl2	Amresco	0288-1KG	Magnesium chloride, hexahydrate (CAS number 7791-18-6); 99%-102%; molecular weight = 203.3g/mol
Microcentrifuge tubes			1.5mL; Graduated every 100µL, autoclavable
Na2HPO4	Amresco	0348-1KG	Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate (CAS number 7782-85-6); 98-102%; molecular weight = 268.07 g/mol
NaCl	Honeywell	31434-1KG	Sodium chloride (CAS number 7647-14-5); ≥99,5%; molecular weight 58,44g/mol. For laboratory use only.
Oxigraph-O2k	Oroboros	10000-02	Series D-G; O2k-Core: includes O2k-Main Unit with stainless steel housing, O2k-Assembly Kit, two OroboPOS (polarographic oxygen sensors) and OroboPOS-Service Kit, DatLab software, the ISS-Integrated Suction System and the O2k-Titration Set.
Permanent marker			Preferably black
Petri dishes			90 X 15 mm dishes; commonly used for bacteriological culture
PLA 3D Printing Filament	Quantum3D Printing	http://quantum3dprinting.com/	High quality polylatic acid filament (PLA), strongly recomended, (1.0 kg Roll), any brand
Proline	Sigma-Aldrich	P0380	L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	P3130	Propyl gallate (CAS number 121-79-9); powder; ≥98%; molecular weight = 212.2 0g/mol; solubility in ethanol at 50 mg/ml
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256	Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol; solubility in water at 100 mg/mL
Rectified shafts			8 x 300 mm, any brand
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/mol
Rubber bands			Can be replaced with pieces of a string
Screwdriver			To assemble some of the 3D-printed apparatuses
Screews			M3 x 8 mm
SD Card			At least 32Mb in size; usually provided with 3D printers
Software Repetier Host	Hot-World GmbH & Co. KG	https://www.repetier.com/	Excellent slicing software, available free of cost
Software Tinkercad	Autodesk	https://www.tinkercad.com	3D model design software, available free of cost
Stereomicroscope	Leica	M-80	Stereomicroscope, zoom 7.5-60X + Leica cls 150 led light source
Sucrose	Merck	107,651,000	Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1);
Tris	Amersham Biosciences	17-1321-01	Tris (hydroxymethyl)-aminomethane (CAS number 77-86-1); 99,8-100.1%; molecular weight 121.14 g/mol
Tweezer/forceps	Stark	ST08710	Histological tweezer, straight, round tip, 12 cm, AISI-410 stainless steel
w1118 fly line	Howy Jacobs´s lab, Tampere University		Drosophila line used as genetic background control for 3XtubAOX
Wood plate			240 x 60 x 20 mm
Zip tights			2 x 210 mm, any brand