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Resumo

Protocolos passo a passo detalhados são descritos aqui para o estudo de sinais mecânicos in vitro usando células de crista neural O9-1 multipotentes e hidrânis de poliacrilamida de rigidez variada.

Resumo

As células de crista neural (NCCs) são células multipotentes embrionárias vertebrada que podem migrar e se diferenciar em uma ampla gama de tipos celulares que dão origem a vários órgãos e tecidos. A rigidez tecidual produz força mecânica, uma sugestão física que desempenha um papel crítico na diferenciação do NCC; no entanto, o mecanismo permanece incerto. O método descrito aqui fornece informações detalhadas para a geração otimizada de hidrânis de poliacrilamida de rigidez variada, a medição precisa de tal rigidez e a avaliação do impacto dos sinais mecânicos em células O9-1, uma linha NCC que imita NCCs in vivo.

A rigidez do hidrogel foi medida por meio da microscopia de força atômica (AFM) e indicou diferentes níveis de rigidez em conformidade. Os NCCs O9-1 cultivados em hidrogéis de rigidez variada mostraram diferentes morfologia celular e expressão genética de fibras de estresse, o que indicou efeitos biológicos variados causados por alterações mecânicas de sinal. Além disso, isso estabeleceu que a variação da rigidez do hidrogel resultou em um sistema in vitro eficiente para manipular a sinalização mecânica alterando a rigidez do gel e analisando a regulação molecular e genética em NCCs. Os NCCs O9-1 podem se diferenciar em uma ampla gama de tipos celulares sob a influência dos meios de diferenciação correspondentes, e é conveniente manipular sinais químicos in vitro. Portanto, este sistema in vitro é uma poderosa ferramenta para estudar o papel da sinalização mecânica em NCCs e sua interação com sinais químicos, o que ajudará os pesquisadores a entender melhor os mecanismos moleculares e genéticos do desenvolvimento de crista neural e doenças.

Introdução

As células de crista neural (NCCs) são um grupo de células-tronco durante a embriogênese vertebrada com uma notável capacidade de migrar e contribuir para o desenvolvimento de vários órgãos e tecidos. Os NCCs podem se diferenciar em diferentes tipos celulares, incluindo neurônios sensoriais, cartilagem, osso, melanócitos e células musculares lisas, dependendo da localização de origem axial e da orientação ambiental local da NCC1,2. Com a capacidade de se diferenciar em uma ampla gama de tipos celulares, anormalidades genéticas que causam a desregulação em qualquer estágio do desenvolvimento da crista neural (NC) podem levar a inúmeras doenças congênitas2. Por exemplo, perturbações durante a formação, migração e desenvolvimento de DCNT levam a distúrbios do desenvolvimento conhecidos coletivamente como neurocristopatias1,3. Essas doenças vão desde defeitos craniofaciais devido à falha na formação do CCN, como a síndrome de Treacher Collins, até o desenvolvimento de vários cânceres devido à capacidade migratória metastática do CCN, como visto no melanoma3,4,5,6. Ao longo das últimas décadas, pesquisadores fizeram descobertas notáveis sobre os papéis e mecanismos das DCNT no desenvolvimento e nas doenças, com a maioria dos achados sendo focados em sinais químicos7,8. Mais recentemente, os sinais mecânicos foram indicados para desempenhar um papel crítico, mas mal compreendido no desenvolvimento do NCC9,10.

As sugestões ambientais das DCNT desempenham um papel crítico durante o seu desenvolvimento, incluindo a regulação da diferenciação do NCC em vários tipos de células. As sugestões ambientais, por exemplo, as pistas físicas, influenciam comportamentos fundamentais e respostas celulares, como a diversificação funcional. A mecanotransdução permite que as células osenceram e respondam a essas pistas para manter vários processos biológicos2. As NCCs são cercadas por células vizinhas e substratos diferentes, como a matriz extracelular (ECM), que pode dar origem a estímulos mecânicos para manter a homeostase e se adaptar às mudanças através da determinação do destino, proliferação e apoptose11. A mecanotransdução começa na membrana plasmática onde ocorre o componente sensorial dos estímulos extracelulares mecânicos, resultando na regulação intracelular da célula12. Integrinos, aderências focais e junções da membrana plasmática retransmitem sinais mecânicos, como forças de corte, estresse e rigidez de substratos circundantes, em sinais químicos para produzir respostas celulares12. O retransmissamento de sinais químicos da membrana plasmática para a regulação celular final é realizado através de diferentes vias de sinalização para finalizar processos vitais para o organismo, como a diferenciação.

Vários estudos sugerem que a sinalização mecânica da rigidez do substrato desempenha um papel na diferenciação celular13,14. Por exemplo, estudos anteriores mostraram que as células-tronco mesenquimais (MSCs) cultivadas em substratos macios com rigidez semelhante à do tecido cerebral (na faixa de 0,1-1,0 kPa) resultaram na diferenciação celular neuronal15,16. No entanto, mais MSCs se diferenciam em células semelhantes a miócitos quando cultivados em substratos de 8-17 kPa imitando a rigidez do músculo, enquanto a diferenciação semelhante ao osteoblasto foi observada quando os MSCs foram cultivados em substratos rígidos (25-40 kPa)15,16. A significância da mecanotransdução é destacada pelas irregularidades e anormalidades na via de sinalização mecânica que potencialmente levam a graves defeitos e doenças do desenvolvimento, incluindo câncer, doenças cardiovasculares e osteoporose17,18,19. Nos cânceres, o tecido mamário normal é macio, e o risco de câncer de mama aumenta em tecido mamário rígido e denso, um ambiente mais parecido com os tumores mamários15. Com esse conhecimento, os efeitos da sinalização mecânica no desenvolvimento do NCC podem ser estudados através da simples manipulação da rigidez do substrato através de um sistema in vitro, proporcionando mais vantagens e possibilidades na compreensão dos fundamentos da progressão e etiologia da doença relacionada à NC.

Para estudar o impacto dos sinais mecânicos nas NCCs, estabelecemos um sistema in vitro eficiente para NCCs com base na otimização de métodos publicados anteriormente e na avaliação das respostas das NCCs a diferentes sinais mecânicos20,21. Foi fornecido um protocolo detalhado para a preparação e avaliação da rigidez do hidrogel variado e a avaliação do impacto da sinalização mecânica em NCCs. Para isso, os NCCs O9-1 são utilizados como modelo nc para estudar os efeitos e mudanças em resposta a hidrogéis rígidos versus macios. Os NCCs O9-1 são uma linha de células NC estável isolada do embrião do rato (E) no dia 8.5. Os NCCs O9-1 imitam NCCs in vivo porque podem se diferenciar em vários tipos de células derivadas do NC em mídia de diferenciação definida22. Para estudar a sinalização mecânica das NCCs, foi fabricado um substrato matricial com elasticidade tunable a partir de diferentes concentrações de acrilamida e soluções de biscrilamida para alcançar a rigidez desejada, correlacionando-se com a rigidez biológica do substrato20,21,23. Para otimizar as condições do substrato matricial para NCCs, especificamente células O9-1, foram feitas modificações a partir do protocolo20publicado anteriormente. Uma mudança feita neste protocolo foi a incubação de hidrogéis em colágeno I, diluídos em ácido acético de 0,2% em vez de 50 mM HEPES, a 37 °C durante a noite. O baixo pH do ácido acético leva a uma distribuição homogênea e maior incorporação de colágeno I, permitindo assim um apego mais uniforme da proteína ECM24. Além disso, foi utilizada uma combinação de soro de cavalo e soro bovino fetal (FBS) nas concentrações de 10% e 5% em soro tampão de fosfato (PBS), respectivamente, antes de armazenar os hidrogéis na incubadora. O soro de cavalo foi utilizado como suplemento adicional à FBS devido à sua capacidade de promover a proliferação celular e a diferenciação na concentração de 10%25.

Com este método, um ambiente biológico foi imitado pelo revestimento proteico ECM (por exemplo, Colágeno I) para criar um ambiente in vitro preciso para que os NCCs cresçam e sobrevivama 20,21. A rigidez dos hidrogéis preparados foi analisada quantitativamente via microscopia de força atômica (AFM), uma técnica bem conhecida para retratar o módulo elástico26. Para estudar o efeito de diferentes níveis de rigidez em NCCs, as células do tipo selvagem O9-1 foram cultivadas e preparadas em hidrogéis para a coloração de imunofluorescência (IF) contra a actina filamentosa (F-actin) para mostrar as diferenças na adesão celular e morfologias em resposta às mudanças na rigidez substrato. Utilizando esse sistema in vitro, os pesquisadores poderão estudar os papéis da sinalização mecânica em NCCs e sua interação com outros sinais químicos para obter uma compreensão mais profunda da relação entre NCCs e sinalização mecânica.

Protocolo

1. Preparação de hidrogel

NOTA: Todas as etapas devem ser executadas em uma capa de cultura celular que tenha sido desinfetada com etanol e ultravioleta (UV) esterilizada antes de usar para manter a esterilidade. Ferramentas, como pinças e pipetas, devem ser pulverizadas com etanol. As soluções tampão também devem ser filtradas estéreis.

  1. Preparação de tampas de vidro revestidas de aminosilano
    1. Coloque o número desejado de tampas de vidro em um pedaço de limpeza de laboratório.
      NOTA: Prepare um adicional de 3-4 tampas para garantir suprimentos de backup suficientes à medida que quebram facilmente. Diferentes materiais de tampas de vidro produzirão diferentes compatibilidades de semeadura e fixação celular. É melhor determinar qual tipo se adequa melhor ao experimento antes de iniciar os experimentos (veja a Tabela de Materiais).
    2. Use um queimador de álcool ou bico de Bunsen para esterilizar cada deslizamento de cobertura passando-o para frente e para trás através da chama (30 s para experimentos de ensaio de proteína). Coloque cada mancha de vidro em um lenço de laboratório para esfriar.
    3. Uma vez que as tampas de vidro sejam resfriadas, transfira-as para uma placa de Petri forrada com parafilme para evitar escorregar.
      NOTA: Se as tampas não estiverem frias o suficiente, o calor residual derreterá o parafilme nos deslizamentos, tornando-os inutilizáveis.
    4. Cubra as tampas com aproximadamente 200 μL e 800 μL de 0,1 M NaOH para um deslizamento de 12 mm e um deslizamento de cobertura de 25 mm, respectivamente, e deixe-os sentar por 5 min. Em seguida, aspire o NaOH 0,1 M e deixe as tampas secarem por mais 5 minutos para formar um filme uniforme.
    5. Uma vez que as manchas são secas, pipeta aproximadamente 80 μL e 150 μL de trietoxisilano de 3 aminopropílico (APTS) para tampas de 12 mm e 25 mm, respectivamente. Tenha cuidado para evitar derramar a solução no parafilme. Deixe a solução sentar por 5 minutos.
    6. Aspire o máximo de APTS em excesso possível e permita que o APTS residual seque por 5 minutos. Enxágüe bem as tampas submergindo-as em estéreis, desionizados (DI) H 2 O trêsvezespor 5 min cada vez.
      NOTA: Se as tampas de vidro não forem bem lavadas, o APTS residual causa reações indesejadas com glutaraldeído, causando a formação de um precipitado branco e resultando em deslizamentos inutilizáveis.
    7. Mova as tampas para uma nova placa de Petri com o lado reativo voltado para cima. Adicione 0,5% de glutaraldeído suficiente à placa de Petri para cobrir totalmente as tampas e permitir que as tampas se sentem por 30 minutos.
    8. Aspire o glutaraldeído de 0,5% e enxágue as tampas novamente em DI H2O uma vez por 3 min. Coloque as tampas do lado reativo em um lenço de laboratório ou uma placa de Petri limpa para secar completamente o ar antes de usar.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui; as tampas devem ser colocadas em DI H2O estérei até o uso.
  2. Preparação de tampas siliconadas
    1. Coloque o mesmo número de tampas que as tampas revestidas de aminosilano (passo 1.1.1) em uma placa de Petri forrada com parafilm.
    2. Pipeta 40 μL ou 150 μL para tampas de 12 mm e 25 mm, respectivamente, de dichlorometilsilano (DCMS) para um lado da tampa e permitem que a solução se sente por 5 min.
    3. Aspire qualquer solução restante do deslizamento de cobertura, lave em DI H2O estéril uma vez por 1 min, e coloque as tampas reativas de frente para cima em um limpador de laboratório para secar completamente o ar antes de passar para o próximo passo.
  3. Preparando hidrogéis
    1. Misture acrilamida, bis-acrilamida e DI H2O em um tubo de centrífuga de 1,5 mL para preparar 500 μL de soluções com rigidezs variadas (ver Tabela 1). Vórtice a solução para 30 s para misturá-lo completamente.
    2. Trabalhando rapidamente, adicione a solução de persulfato de amônio de 10% (APS) e tetrametileenodiamina (TEMED) ao tubo e vórtice as soluções novamente para misturar as soluções.
      NOTA: Prepare o APS fresco de 10% e deixe-o no gelo ou congele em alíquotas de uso único devido ao seu ciclo sensível de congelamento/degelo.
    3. Pipeta aproximadamente 33 μL ou 100 μL da solução sobre as tampas secas revestidas de aminosilano (seção 1.1), respectivamente.
    4. Utilizando pinças curvas, coloque imediatamente o deslizamento de cobertura tratado com DCMS em cima da solução de gel com o lado tratado tocando a solução de gel, sanduíchendo assim a solução de gel entre o deslizamento de cobertura tratado com DCMS e o deslizamento revestido de aminosilano.
    5. Deixe a solução de gel polimerizar por 5-15 min, enquanto monitora ativamente para polimerização de gel da solução restante no tubo.
    6. Uma vez que o gel seja polimerizado, separe o deslizamento de cobertura tratado com DCMS com pinças curvas ou uma lâmina de barbear, deixando o gel preso ao talão original revestido de aminosilano.
    7. Coloque imediatamente o talo de cobertura com o hidrogel anexado em uma placa pré-determinada de 4-bem/24-bem e 6-bem coberta com 500 μL e 2 mL de PBS estéril ou DI H2O para tampas de 12 mm e 25 mm, respectivamente, para evitar que o gel seque.
    8. Repetir as etapas 1.3.4-1.3.7 para todas as tampas.
    9. Submergir os hidrogéis em PBS estéreis ou DI H2O por 30 minutos para remover o excesso de solução de acrilamida. Armazene os hidrogéis em PBS estéreis ou DI H2O a 4 °C para uma parada processual aqui.
    10. Em uma sala escura, prepare a mistura de sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoato (sulfo-SANPAH) misturando 2,5 mL de 50 mM 2-[4 -(2-hidroxietila) piperazin-1-yl] ácido esfilfônico (HEPES) (pH=8,5) com 25 μL do sulfo-SANPAH de 50 μg/mL em um tubo cônico, embrulhado em papel alumínio para proteger da luz. Use uma pipeta para misturar bem a solução antes de usar.
      NOTA: Um volume de 2,5 mL de solução sulfo-SANPAH é suficiente para aproximadamente 25 hidrogéis de 12 mm ou cinco hidrogéis de 25 mm.
    11. Aspirar PBS ou DI H2O da placa do poço. Adicione aproximadamente 100 μL ou 500 μL para tampas de 12 mm e 25 mm, respectivamente, da solução sulfo-SANPAH (etapa 1.3.10) para cobrir o gel. Certifique-se de que a solução cobre o gel inteiramente.
      NOTA: Ajuste a força de sucção do vácuo para evitar que a força forte rasge ou perturda os hidrogéis.
    12. Coloque os géis com a solução sob uma luz UV de 15 W, 365 nm por 10 minutos, descobertos para minimizar qualquer interferência da luz UV reagindo com o sulfo-SANPAH.
    13. Aspire o excesso de sulfo-SANPAH inclinando a placa para coletar o máximo possível da solução. Lave o gel com 50 mM HEPES duas a três vezes.
    14. Adicione 500 μL e 2 mL para géis de 12 mm e 25 mm, respectivamente, de 50 mg/mL de colágeno que diluí em ácido acético de 0,2% a cada poço contendo o hidrogel. Deixe os géis incubarem durante a noite em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2.
      NOTA: Diluir o colágeno I em ácido acético de 0,2% em vez de 50 mM HEPES para promover distribuição homogênea e fixação de colágeno I.
    15. Aspire o colágeno I e lave os géis com PBS estéril três vezes para remover o excesso de colágeno I por 5 min cada lavagem. Incubar os hidrogéis em PBS com soro de 10%, 5% FBS por 2h na incubadora de 37 °C, 5% CO2.
      NOTA: A adição de 10% de soro de cavalo promove maior proliferação em relação apenas ao uso de FBS como feito na publicação anterior.
    16. Aspire o meio. Adicione 500 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) com 10% de FBS e 1% penicilina-estreptomicina (P/S) a cada poço. Armazene os géis na incubadora de 37 °C, 5% de CO2 até ficar pronto para a cultura celular.
    17. Uma vez pronto, prato aproximadamente 1,5 × 104 células O9-1/cm2 em meio basal nos pratos de cultura. Incubar as células por 2 dias em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO2. Verifique se as células estão em busca de confluência para garantir que as células estejam suficientemente ligadas aos géis, e que o número de células é suficiente antes de coletar para análise.
      NOTA: Veja o protocolo publicado anteriormente para as etapas de recuperação, passagem e coleta de células O9-120.
    18. Prossiga para as seções 2, 3 ou 4 para análise posterior dos hidrogéis.

2. Análise quantitativa da rigidez via AFM

  1. Inicie o computador do sistema AFM, seguido pelo controlador AFM (consulte a tabela de materiais).
  2. Monte o cantilever AFM no suporte da sonda AFM. Use uma cantilever esférica com uma conta de sílica de 0,5 μm montada no final do cantilever (cantilever com contas esféricas).
    NOTA: Para hidrogéis mais rígidos, como 10 kPa, 20 kPa e 40 kPa, uma sonda mais rígida foi usada com a constante de mola de 0,24 N/m. Uma sonda mais macia foi utilizada para hidrogéis mais macios, como 0,5 kPa e 1 kPa, com uma constante de mola de 0,059 N/m.
  3. Defina o software AFM sob o modo de contato.
  4. Monte o wafer de silício no estágio de amostra AFM para coletar curvas de força clicando em Engatar para que o cantilever toque no substrato de silício, gerando assim as curvas de força.
  5. Use as curvas de força acima (2.4) para calibração, clique em Calibrar no software de controle para obter uma constante média de mola do cantilever em condição de melodia térmica e salve os valores calibrados no software de controle.
  6. Monte as amostras colocando o deslizamento de tampa com o hidrogel anexado em uma placa de Petri de 60 mm no estágio de varredura AFM. Adicione 3 mL de PBS no prato antes de realizar medições para evitar que o gel seque.
  7. Defina o AFM para trabalhar no modo de contato (fluido) para iniciar a medição. Engaje a conta esférica para tocar continuamente e levantar da amostra de gel.
  8. Defina a cantilever para que seu limiar de deflexão permaneça em 10 nm. Mantenha o tamanho de rampa da sonda a 10 μm. Em seguida, registo as curvas de força como no passo 2.4.
  9. Adquira pelo menos 20 curvas de força de pelo menos 3 a 10 pontos diferentes através da superfície do hidrogel.
  10. Calcule o módulo médio de Young de ~20 curvas de força para cada ponto com software de imagem e análise AFM. Use curvas de força de rampa estendidas e um modelo linearizado (esférico). Calcule a média de todos os pontos para cada amostra para produzir a rigidez final.
    NOTA: O módulo de young e os dados relacionados(ou seja, desvios padrão) são automaticamente salvos como uma planilha.
  11. Repita as etapas 2.6-2.10 para todas as amostras.

3. Análise molecular da rigidez via coloração de imunofluorescência

  1. Use pinças para transportar o deslizamento de tampas para uma nova placa para minimizar sinais falsos de células cultivadas diretamente na placa. Lave as células com 500 μL de PBS estéril três vezes para remover células mortas e qualquer meio de cultura restante.
  2. Fixar as células usando 500 μL de 4% de paraformaldeído (PFA) por 10 minutos em temperatura ambiente, sem ser perturbado. Em seguida, relave as células três vezes usando 500 μL de PBS/well por 2 min cada.
    NOTA: Armazene a 4 °C para uma parada processual.
  3. Trate as células com 500 μL de 0,1% Triton X-100 por 15 min a temperatura ambiente. Em seguida, lave as células três vezes com 500 μL de PBS/well.
  4. Bloqueie as células com 250 μL de 10% de soro de burro (diluído em PBS e 0,1% Tween 20) por poço por 30 minutos à temperatura ambiente.
  5. Incubar as células com 250 μL de anticorpos primários por 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C. Em seguida, lave as células três vezes com 500 μL de PBS/bem por 5 min cada.
    NOTA: Anti-Vinculina (Vcl) (1:250) e anti-AP2 alfa (1:250) foram usados neste experimento e foram diluídos em 10% de soro de burro.
  6. Incubar as células com anticorpos secundários correspondentes e/ou faloidina usada para coloração F-actin a uma diluição de 1:400 em 250 μL de soro de burro de 10% para 30 min à temperatura ambiente. Em seguida, lave as células três vezes com PBS por 5 minutos cada.
    NOTA: 568 nm Phalloidin pode ser co-incubado com anticorpos secundários de 488 nm ou 647 nm ou por conta própria.
  7. Incubar as células com 4′,6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI, diluição de 1:1000) em 250 μL de PBS por 10 min seguido de uma última lavagem de PBS por 2 min.
  8. Adicione 3-4 gotas de meio de montagem para cada poço. Armazene as amostras a 4 °C para definir por pelo menos 2 h antes da imagem para garantir que o meio de montagem esteja bem definido.
  9. Capture imagens de pelo menos 3 quadros aleatórios por amostra de hidrogel com um microscópio de fluorescência, produzindo canais individuais e mesclados.

4. PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR)

  1. Transfira os hidrogéis com as células aderentes para a coleta de RNA para uma nova placa para minimizar o RNA indesejado das células ligadas à placa celular. Lave as células com PBS três vezes para remover células mortas e meio de cultura.
  2. Extrair o mRNA total usando um kit de extração de RNA. Realize a transcrição reversa do RNA para o cDNA usando um supermix de transcrição reversa seguindo as instruções do fabricante.
  3. Execute o RT-qPCR com primers para Vcl como o marcador de rigidez de escolha e analise usando o método 2-ΔΔCT.
    NOTA: Sequência de primer de Vcl: Forward 5' GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3'; reverter 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.

Resultados

Avaliação de preparação e rigidez de hidrogel através da AFM e do modelo Hertz
Aqui, um protocolo detalhado é fornecido para gerar hidrágundos de poliacrilamida de rigidez variada, regulando a razão de acrilamida e biscrilamida. No entanto, os hidrânuis de poliacrilamida não estão prontos para a adesão das células devido à falta de proteínas ECM. Assim, o sulfo-SANPAH, atuando como um linker, se liga covalentemente aos hidrogéis e reage com as aminas primárias das proteínas ECM para ...

Discussão

O objetivo do presente estudo é fornecer um sistema in vitro eficaz e eficiente para entender melhor o impacto dos sinais mecânicos nos NCCs. Além de seguir o protocolo passo-a-passo mencionado acima, os pesquisadores precisam ter em mente que a cultura celular dos NCCs O9-1 é afetada pelo tipo de tampas de vidro usadas para preparar hidrogéis. Por exemplo, observou-se que as células semeadas em um tipo específico de mancha de vidro (ver a Tabela dos Materiais) sobreviveram e proliferaram...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos à Dra. Ana-Maria Zaske, operadora da instalação Atomic Force Microscópio-UT Core no Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Texas, pela expertise em AFM neste projeto. Agradecemos também às fontes de financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 e R01HL142704 a J. Wang).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
12 mm #1 Corning 0211 Glass CoverslipChemglass Life SciencesCLS-1763-012
2% Bis-AcrylamideSigma AldrichM1533
24-well plateGreiner Bio-one662165
25 mm #1 Corning 0211 Glass CoverslipChemglass Life SciencesCLS-1763-025
3-aminopropyl triethoxysilane (APTS)Sigma AldrichA3648
4-well cell culture plateThermo Scientific179830
4% ParaformaldehydeSigma AldrichJ61899-AP
40% AcrylamideSigma AldrichA4058
50% glutaraldehydeSigma AldrichG7651
6-well cell culture plateGreiner Bio-one657160
AFM cantilever (spherical bead)Novascan
AFM softwareCatalyst NanoScopeModel: 8.15 SR3R1
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo FisherA12379
Ammonium Persulfate (APS)Sigma Aldrich248614Powder
anti-AP-2α AntibodySanta Cruzsc-12726
anti-Vinculin antibodyAbcamab129002
Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope CatalystBruker Corporation
Collagen type I (100mg)Corning354236
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermo FisherD1306
Dichloromethylsilane (DCMS)Sigma Aldrich440272
Donkey serumSigma AldrichD9663
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Corning10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS)Corning35-010-CV
Fluorescence microscopeLeicaModel DMi8
Fluoromount-G mounting mediumSouthernBiotech0100-35
HEPESSigma AldrichH3375Powder
Horse serumCorning35-030-CI
iScript Reverse Transcription SupermixBio-Rad1708841
Penicillin-Streptomycin antibioticThermo Fisher15140148
RNeasy micro kitQiagen74004
Sterile 1x PBSHycloneSH30256.02
Sterile deionized waterHardy DiagnosticsU284
sulfo-SANPAHThermo Fisher22589
SYBR greenApplied Biosystems4472908
TEMEDSigma AldrichT9281
Triton X-100Sigma AldrichX100
Tween 20Sigma AldrichP9416

Referências

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