Transformação germline hiperativa da Transposase mediada pela Transposase no Verme do Exército de Outono, Spodoptera frugiperda

Resumo

A transformação germinal bem sucedida no verme do exército de outono, Spodoptera frugiperda,foi alcançada usando mRNA de transposase hiperativo piggyBac.

Resumo

A inserção estável da carga genética em genomas de insetos usando elementos transposáveis é uma poderosa ferramenta para estudos genômicos funcionais e desenvolvimento de estratégias genéticas de manejo de pragas. O elemento transposável mais usado na transformação de insetos é o piggyBac, e a transformação germinal baseada em piggyBactem sido conduzida com sucesso em insetos modelo. No entanto, ainda é desafiador empregar essa tecnologia em insetos não-modelo que incluem pragas agrícolas. Este artigo relata a transformação germinal de uma praga agrícola global, a minhoca de outono (FAW), Spodoptera frugiperda,usando a transposase hiperativa piggyBac (hyPBase).

Neste trabalho, o mRNA hyPBase foi produzido e utilizado no lugar de plasmídeo de ajudante em microinjeções de embriões. Essa mudança levou à geração bem sucedida de FAW transgênico. Além disso, também são descritos os métodos de triagem de animais transgênicos, a detecção rápida da inserção transgênica baseada em PCR e a determinação assimétrica do local de integração. Assim, este artigo apresenta um protocolo para produzir FAW transgênico, o que facilitará a transgênese baseada em piggyBacna FAW e outros insetos lepidopteranos.

Introdução

O verme do exército de outono (FAW), Spodoptera frugiperda,é nativo de regiões tropicais e subtropicais da América. Atualmente, este é um herbívoro de insetos devastador em mais de 100 países em todo o mundo¹. As larvas faw se alimentam de mais de 350 plantas hospedeiras, incluindo algumas importantes culturas alimentares^{básicas 2}. A forte capacidade migratória dos adultos da FAW contribui para sua recente rápida disseminação das Américas para outros lugares^1,2. Como resultado, este inseto está ameaçando a segurança alimentar internacionalmente. A aplicação de novas tecnologias pode facilitar estudos avançados na FAW e fornecer novas estratégias para gerenciar essa praga.

A transformação da germinação de insetos tem sido usada para estudar a função genética e gerar insetos transgênicos para uso no controle genético^3,4. Entre os vários métodos utilizados para alcançar a transformação genética em insetos, o método baseado em elementos piggyBac é o método mais utilizado⁵. No entanto, devido à baixa taxa de transposição, ainda é desafiador realizar transgênese em insetos não modelo. Recentemente, uma versão hiperativa de piggyBac transposase (hyPBase) foi desenvolvida^6,7. A transformação germinal foi alcançada na FAW recentemente⁸, que é o primeiro relatório que utilizou o hyPBase em insetos lepidopteranos. Neste relatório, são descritas informações detalhadas sobre a contratação de mRNA hipPBase na geração de FAW transgênicos. O método aqui descrito poderia ser aplicado para alcançar a transformação de outros insetos lepidopteranos.

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Protocolo

1. Síntese in vitro de hipPBase mRNA

NOTA: A sequência completa de codificação da sequência hyPBase foi sintetizada e inserida em um vetor pTD1-Cas9 (ver a Tabela de Materiais) para produzir a construção pTD1-hyPBase, que contém um expresso em hyPBase, promotor T7: polyhedrin-5' UTR: hyPBase: polyhedrin-3' UTR: poly (A). A sequência completa da construção pTD1-hyPBase está prevista no Material Suplementar.

1. Preparação do modelo para síntese in vitro
   1. Execute uma reação pcr para amplificar o de expressão hyPBase usando um primer para a frente, 5'- atgcggtgtgaaccgcacagatgcg-3', e um primer reverso de 5'- tagaggccccaaggggttatgctag-3', polimerase de alta fidelidade e plasmídeo pTD1-hyPBase como um modelo.
      NOTA: A reação do PCR (volume final de 50 μL) contém 5,0 μL de tampão de reação de 10x, 4,0 μL de triphosfato de desoxicosídeo de 10 mM (dNTP), 1,0 μL de plasmid (50 μg/μL), 1,0 μL de alta fidelidade polmerase, 1,0 μL cada um dos primers dianteiros e invertidos de 10 μM e 33 μL de água sem nuclease. As configurações foram as seguintes: uma incubação inicial de 95 °C para 3 min, seguida por 35 ciclos de 98 °C para 10 s, 60 °C para 15 s e 68 °C para 2 min.
   2. Verifique o produto PCR em um gel de 1% de agarose a 120 V em tampão fresco de ácido tetraacético Tris-acetato-etilenodiamina (TAE) por 30 min e purifique o produto com o kit de extração de gel.
      NOTA: Não utilize o kit de purificação do produto PCR. Mesmo uma quantidade de traço do plasmídeo pTD1-hyPBase diminui significativamente a eficiência da síntese in vitro.
2. Síntese in vitro do hippbase mRNA usando um kit comercial
   1. Descongele completamente os reagentes congelados, mantenha a enzima e a solução NTP/CAP 2x no gelo e deixe o tampão de reação desoçado em temperatura ambiente.
   2. Monte a reação à temperatura ambiente adicionando os seguintes componentes: solução 2x NTP/CAP: 10 μL; 10x Tampão de reação: 2 μL; DNA do modelo: 0.1-0.2 μg; Mistura de enzimas: 2 μL; Água sem nuclease a 20 μL.
   3. Misture bem os reagentes, encanar suavemente a mistura para cima e para baixo e incubar a 37 °C por 2-4 h.
3. Recuperação do mRNA sintetizado por precipitação de cloreto de lítio
   1. Adicione 30 μL de Solução de Precipitação LiCl, misture bem apertando o tubo e, em seguida, mantenha -20 °C por ≥ 30 min.
   2. Centrifugar a 4 °C por 15 min na velocidade máxima e remover cuidadosamente o sobrenatante.
   3. Lave a pelota uma vez com 1 mL de 70% de etanol, reclímfusuga e remova o sobrenante cuidadosamente.
   4. Seque a pelota à temperatura ambiente por 1-2 min e, em seguida, resuspenque a pelota com 20-40 μL de água sem nuclease.
   5. Diluir 1 μL de solução mRNA com 9 μL de água sem nuclease. Tome 2 μL para determinar a concentração de mRNA e use 8 μL para verificar a qualidade do mRNA em um gel de 1% de agarose a 100 V em tampão TAE fresco por 40 minutos.
   6. Aliquot a solução mRNA e armazene congelado a -70 °C por até um ano.
      NOTA: Não seque completamente a pelota de mRNA; pode ser mais difícil dissolvê-lo na água.

2. Microinjeção

1. Coleta de ovos
   1. Coloque 12 pupas machos e 12 pupas fêmeas em uma caixa de 15 cm x 15 cm x 10 cm. Cubra a caixa com uma toalha de papel. Coloque uma solução de sacarose de 10% na caixa para alimentar adultos.
   2. No segundo dia pós-eclosão, exponha os adultos à luz intensa durante a noite.
   3. No dia 3 após a eclosão, transfira os adultos da etapa 2.1.2 para um lugar escuro. Recolher os embriões dentro de 2h após a oviposição.
   4. Adicione gotas de água ao pedaço de uma toalha de papel com ovos frescos mantidos em uma placa de Petri no gelo. Transfira os ovos suavemente para um deslizamento de vidro com uma escova fina e alinhe-os um a um em uma lâmina de vidro. Mantenha os slides de vidro com os ovos alinhados no gelo antes da microinjeção.
2. Configuração de microinjeção
   1. Injete uma mistura de uma proteína fluorescente verde transgênica (EGFP) expressando plasmídeo (200 ng/μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, hipPBase mRNA (200 ng/μL) e água destilada estéril nos ovos, usando a pressão de compensação do microinjetor automatizado (ver a Tabela dos Materiais).
   2. Mantenha os ovos injetados a 27 ± 1 °C, 60 ± umidade relativa até chocar.
   3. Alimente as larvas eclodidas em uma dieta artificial e transfira cada larva para um pequeno copo no estágio^instar 3 no início (~6 mm de comprimento, e a cor do corpo fica preta).

3. Triagem de fluorescência e travessia genética

1. Colete a pupae e coloque ~150 pupas fêmeas e ~150 pupas machos em uma gaiola de 35 cm x 35 cm x 35 cm. Pendure vários pedaços de toalhas de papel (~30 cm x 15 cm) na gaiola para coletar os ovos.
2. Recolhe as toalhas de papel com ovos diariamente e mantenha os ovos a 27 ± 1 °C, 60 ± 10% de umidade relativa até eclodir.
3. Mantenha as larvas de nénato a 4 °C por 5 minutos para imobilizá-las e, em seguida, transfira-as para uma placa gelada.
4. Trie as larvas imobilizadas de recém-nascidos sob um estereóscópio de fluorescência. Selecione os recém-nascidos positivos do EGFP, eleve-os para o estágio pupal em ~2 semanas a 27 ± 1 °C, e separe-os por sexo de acordo com as diferenças de fenótipo nos segmentos do abdômen ventral.
   NOTA: A pupa fêmea tem uma abertura genital semelhante à fenda no oitavo segmento abdominal e as margens cefálicas do nono e décimo segmentos curvados em direção à abertura genital. A abertura genital da pupa masculina tem uma leve elevação no nono segmento abdominal.
5. Coloque a pupae EGFP-positiva e a pupae do tipo selvagem do sexo oposto em um macho: proporção feminina de 1:1 em uma gaiola. Sib-cross os adultos expressos do EGFP para produzir as gerações seguintes.

4. Detecção de PCR de inserção transgênica

1. Extrair DNA genômico das larvas individuais do tipo selvagem e EGFP positivo usando qualquer kit de extração de DNA genômico comercial seguindo as instruções do fabricante.
2. Realizar uma reação pcr usando o DNA genômico como modelo; um primer avançado, 5'-acgtacgctccccctgtgttccgttc-3' localizado na região promotora ie1; e um primer reverso, 5'-aagcactacccgtaggtcag-3' localizado na região EGFP do vetor de transformação.
3. Configure cada reação pcr (volume final de 40 μL) para conter 20 μL da mistura de polimerase, 1,0 μL de DNA genômico (40 μg/μL), 1,0 μL cada um dos primers dianteiros e reversos de 10 μM e 17 μL de água sem nuclease. Use as seguintes configurações: uma incubação inicial de 95 °C para 3 min, seguida por 35 ciclos de 95 °C para 20 s, 56 °C para 20 s e 68 °C para 40 s.
4. Verifique os produtos PCR em um gel de 1% agarose a 120 V por 30 min.

5. Determinação do local de inserção transgênica

1. Realize tail-PCR de alta eficiência usando DNA genômico como modelo para determinar o local de integração da inserção transgênica nos insetos positivos do EGFP.
   1. Execute as reações do PCR seguindo as etapas descritas em outros lugares⁹.
      1. Use três primers, P1: 5'-atcagtgacacttaccgcattgacacgcc-3', P2: 5'tcacgggagctccaagcggcgactg-3', e P3: 5'-atgtcctaaatgcacagcgacggcgcgct-3', que são específicos para o vetor piggyBac, nas 3 rodadas de reação pcr, respectivamente.
2. Sequencie os produtos pcr finais para determinar o local de integração.

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Resultados

Uma construção para a expressão do promotor T7 contendo hippBase: poliedrin-5'UTR: hyPBase: poliedrin-3'UTR: poly (A) sinal foi gerado(Figura 1A) e amplificado como um fragmento de PCR ~2,2 kb para sintetizar hipPBase mRNA in vitro (Figura 1B). Em seguida, o mRNA hyPBase foi produzido e submetido à eletroforese de gel agarose. O mRNA do tamanho esperado (~1,1 kb de banda) foi detectado em um gel de 1% de agarose(Figura 1C).

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Discussão

A baixa taxa de transposição e a dificuldade de entregar componentes transgênicos em embriões frescos limitam o sucesso da transformação germinal em muitos insetos não-modelo, especialmente aqueles da ordem, Lepidoptera. Para aumentar a taxa de transformação germinal, foi desenvolvida uma versão hiperativa da transposase de piggyBac mais utilizada (hyPBase)^7,10. Até o momento, a transformação germinal bem sucedida em insetos lepidopteranos ?...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5" Dental Cotton Rolls	PlastCare USA	8542025591	REARING
1 oz Souffle Cup Lids	DART	PL1N
1 oz Souffle Cups	DART	P100N	REARING
48 oz Plastic Deli Containers	Genpack	AD48	REARING
Add-on Filter Set (Green)	NightSea LLC	SFA-BLFS-GR	SCREENING
Borosilicate Glass	Sutter Instruments	BF100-50-10	INJECTION
Borosilicate Glass	SUTTER INSTRUMENT	BF-100-50-10
Dissecting Scope	Nikon	SMZ745T	SCREENING
Featherweight Forceps	BioQuip	4750	REARING
Gutter Guard	ThermWell Products	VX620	REARING
Inverted Microscope	Olympus	IX71	INJECTION
Microinjector	Narishige	IM-300	INJECTION
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000	INJECTION
Microscope Slides	VWR	16004-22	INJECTION
NightSea Full System	NightSea LLC	SFA-RB-DIM	SCREENING
Nitrogen Gas	AWG/Scott-Gross	NI 225	INJECTION
Paper Towels	Bounty	43217-45074	REARING
Spodoptera frugiperda Artificial Diet	Southland Products, Inc	N/A [Request Species/Quantity]	REARING
Spodoptera frugiperda Eggs	Benzon Research, Inc	N/A [Request Species/Quantity]	REARING
Taq MasterMix			polymerase mixture