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Resumo

Este protocolo visa descrever uma nova metodologia para medir a taxa de disparo cardíaco intrínseco usando o registro de matriz de microeletrínda de todo o tecido do nódulo sinoatrial para identificar defeitos de marcação de ritmo em camundongos. Agentes farmacológicos também podem ser introduzidos neste método para estudar seus efeitos no ritmo intrínseco.

Resumo

O nódulo sinoatrial (SAN), localizado no átrio direito, contém as células marcapasso do coração, e a disfunção desta região pode causar taquicardia ou bradicardia. A identificação confiável de defeitos cardíacos de pacemaking requer a medição de frequências cardíacas intrínsecas, impedindo em grande parte a influência do sistema nervoso autônomo, que pode mascarar déficits de taxas. Os métodos tradicionais para analisar a função de marca-passo cardíaco intrínseco incluem bloqueio autônomo induzido por drogas para medir as frequências cardíacas in vivo, registros cardíacos isolados para medir as frequências cardíacas intrínsecas e registros sinoatrial de células-chave de remendo de células-passo sinoatrial para medir as taxas de disparo potenciais de ação espontânea. No entanto, essas técnicas mais tradicionais podem ser tecnicamente desafiadoras e difíceis de executar. Aqui, apresentamos uma nova metodologia para medir a taxa de disparo cardíaco intrínseco realizando gravações de matriz de microeletrínda (MEA) de preparações de nós sinoatrial de conjunto inteiro de camundongos. Os MEAs são compostos de múltiplos microeletrodos dispostos em um padrão semelhante à grade para gravação de potenciais de campo extracelular in vitro. O método descrito aqui tem a vantagem combinada de ser relativamente mais rápido, simples e mais preciso do que abordagens anteriores para registrar frequências cardíacas intrínsecas, ao mesmo tempo em que permite um interrogatório farmacológico fácil.

Introdução

O coração é um órgão complexo governado por influências cardíacas-intrínsecas e extrínsecas, como as que se originam no cérebro. O nódulo sinoatrial (SAN) é uma região definida no coração que abriga as células marcapasso (também conhecidas como células sinoatrial, ou células SA) responsáveis pela iniciação e perpetuação dos batimentos cardíacos mamíferos1,2. A frequência cardíaca intrínseca é a taxa impulsionada pelas células marcapasso sem influência por outras influências cardíacas ou neuro-humorais, mas medidas tradicionais de frequência cardíaca em humanos e animais vivos, como eletrocardiogramas, refletem tanto o marca-passo quanto as influências neurais no coração. A influência neural mais notável nas células SA é do sistema nervoso autônomo, que modula constantemente padrões de disparo para atender aos requisitos fisiológicos do corpo3. Apoiando essa ideia, projeções simpáticas e parassimpáticas podem ser encontradas perto da SAN4. O sistema nervoso cardíaco intrínseco (ICNS) é outra importante influência neural onde plexi ganglioado, especificamente na ária direita, inerva e regula a atividade da SAN5,6.

Entender os déficits de pacemaking é clinicamente importante, pois a disfunção pode fundamentar muitos distúrbios cardíacos, bem como contribuir para o risco de outras complicações. A síndrome do seio doente (SSS) é uma categoria de doenças caracterizadas pela disfunção do nódulo sinoatrial que impede o bom funcionamento do ritmo7,8. SSS pode apresentar sinus bradycardia, pausas sinusas, parada sinusal, bloco de saída sinoatrial, e bradidinathmias alternadas e taquiarritmias9 e pode levar a complicações, incluindo aumento do risco de derrame embólico e morte súbita8,10. Aqueles com síndrome de Brugada, uma doença cardíaca marcada pela fibrilação ventricular com risco aumentado de morte cardíaca súbita, correm maior risco de eventos arrhitogênicos se também tiverem disfunção comorbóide de SAN11,12. A disfunção sinoatrial também pode ter consequências fisiológicas além do coração. Por exemplo, a SSS tem sido observada para desencadear convulsões em um paciente devido à hipoperfusão cerebral13.

Para identificar déficits de pacemaking sinoatrial, as frequências cardíacas intrínsecas precisam ser determinadas medindo a atividade da SAN sem a influência do sistema nervoso autônomo ou fatores humorísticos. Clinicamente, isso pode ser aproximado pelo bloqueio autônomo farmacológico14,mas essa mesma técnica também pode ser aplicada em modelos mamíferos para estudar a função cardíaca intrínseca15,16. Embora essa abordagem bloqueie uma grande parte das influências neurais contribuintes e permita o exame cardíaco in vivo, ela não elimina completamente todas as influências extrínsecas no coração. Outra técnica de pesquisa usada para estudar a função cardíaca intrínseca em modelos animais são as gravações cardíacas isoladas usando corações perfumados langendorff, que normalmente envolvem medidas usando eletrogramas, ritmo ou matrizes multieletrínois epicáridas17,18,19,20. Embora essa técnica seja mais específica para a função cardíaca, pois envolve a remoção do coração do corpo, as medidas ainda podem ser influenciadas por mecanismos autoregulatórios mecano-elétricos que podem influenciar as medições intrínsecas da frequência cardíaca21. As gravações cardíacas isoladas também podem ser influenciadas pela regulação autônoma através do ICNS5,6,22,23. Além disso, manter uma temperatura fisiologicamente relevante do coração, que é fundamental para as medidas de função cardíaca, pode ser difícil em abordagens cardíacas isoladas20. Um método mais direto para estudar a função SAN é isolar especificamente o tecido SAN e medir sua atividade. Isso pode ser realizado através de tiras SAN (tecido SAN isolado) ou células-passo isoladas de SAN24,25. Ambos requerem um alto grau de treinamento técnico, já que a SAN é uma região muito pequena e altamente definida, e o isolamento celular representa um desafio ainda maior, pois a dissociação pode prejudicar a saúde geral da célula se não for realizada corretamente. Além disso, essas técnicas requerem habilidades eletrofisiológicas especializadas para registrar com sucesso a partir do tecido ou células usando microeletrodos de gravação individuais.

Neste protocolo, descrevemos uma técnica para registrar o SAN in vitro usando uma matriz de microeletríndia (MEA) para obter medições intrínsecas da frequência cardíaca. Essa abordagem tem a vantagem de tornar registros eletrofisiológicos altamente específicos acessíveis a pesquisadores sem habilidades eletrofisiológicas intensivas. Os MEAs já foram utilizados para estudar a função cardiomiócito nas culturas de cardiomiócito primário26,27,28,29,30,31,32, folhas cardíacas33,34,35,36,37,38,39, e montagems inteiras de tecido40, 41,42,43,44,45,46,47. Trabalhos anteriores também foram feitos para examinar os potenciais de campo no tecidoSAN 41,42. Aqui, fornecemos uma metodologia para usar o MEA para registrar e analisar as taxas de disparo de SAN intrínsecas murinas. Também descrevemos como essa técnica pode ser usada para testar efeitos farmacológicos de drogas em taxas de disparo intrínsecos de SAN, fornecendo um experimento amostral mostrando os efeitos de 4-aminopirridina (4-AP), um bloqueador de canal K+ canal fechado por tensão. Usando marcos anatômicos definidos, podemos registrar com precisão a SAN sem ter que realizar as extensas dissecções teciduais ou isolamentos celulares necessários em outros métodos. Embora o MEA possa ser proibitivo de custos, as gravações fornecem medidas altamente específicas e confiáveis de pacemaking que podem ser usadas em uma vasta gama de aplicações de pesquisa clínica e fisiológica.

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Protocolo

Todos os procedimentos experimentais aqui descritos foram realizados de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH), conforme aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Metodista do Sul.

1. Revestindo a matriz multieletrísda (MEA) para gravação

  1. Faça um buffer de borate de 25 mM.
    1. Dissolver 0,953 g de Na2B4O7·10 H2O em 80 mL de água destilada.
    2. Ajuste o pH para 8,4 com HCl e, em seguida, adicione água destilada a um volume final de 100 mL.
  2. Faça uma solução de estoque de 0,1% de polietileneimina (PEI).
    1. Adicione 100 μL de 50% (w/v) PEI a 4,9 mL de água destilada para fazer uma solução PEI de 1%.
    2. Diluir a solução PEI de 1% para 0,1% no buffer de borate adicionando 1 mL da solução PEI de 1% para 9 mL do buffer de 25 mM borate.
  3. Pipeta ~1 mL da solução PEI de 0,1% no prato de matriz de microeletrísmo (MEA) para que os eletrodos estejam completamente cobertos(Figura 1A e 1B).
    NOTA: Os microelerodes do MEA são tipicamente compostos de nanotubo preto ou carbono platinado e isolados com poliimida (ou acrílico); ambos os materiais são hidrofóbicos. Ao revestir o MEA com um polímero cônico como o PEI, a superfície meofóbica mefóbica torna-se mais hidrofílica, permitindo que amostras de tecido façam melhor contato com a superfície MEA(Figura 1A1).
  4. Cubra o prato MEA com película termoplástica para reduzir a evaporação e deixe o MEA durante a noite em temperatura ambiente(Figura 1C).
  5. Aspire a solução PEI do prato MEA usando uma pipeta, tomando cuidado para não tocar na grade de eletrodos que pode danificar os eletrodos e, em seguida, enxágüe ≥4 vezes com água destilada(Figura 1D).
  6. Armazene o MEA revestido de PEI sob 1-2 mL de água ultrapura e selado com película termoplástica a 4 °C até que seja necessário. Alternativamente, armazene o MEA revestido submergindo-o em um béquer cheio de água ultrapura(Figura 1E).
    NOTA: O processo de revestimento PEI só precisa ser realizado uma vez para o MEA antes de seu primeiro uso, e após cada sessão de gravação, o MEA deve ser armazenado submerso em água ultrapura.

2. Preparando a solução completa de Tyrode para dissecção tecidual

  1. Faça 1.000 mL de solução completa da Tyrode para dissecção; primeiro, adicione 8,1816 g de NaCl a 800 mL de água ultrapura.
  2. Adicionar a seguinte quantidade de produtos químicos à solução: 0,4025 g de KCl; 0,1633 g de KH2PO4; 1.1915 g de HEPES; 0,9999 g de glicose; 0,0952 g de MgCl2; 0,2646 g de CaCl2·2H2O.
  3. Ajuste o pH para 7.4 com NaOH e, em seguida, adicione água ultrauso até que o volume total seja de 1.000 mL.
    NOTA: A composição final da solução completa de Tyrode será a seguinte (em mM): 140 NaCl, 5.4 KCl, 1.2 KH2PO4, 5 HEPES, 5,55 glicose, 1 MgCl2, 1.8 CaCl2.

3. Preparar a solução oxigenada de Tyrode para gravação

  1. Fazer 500 mL da solução de Tyrode; adicionar 4.003 g de NaCl a 400 mL de água ultrapura.
  2. Adicione as seguintes quantidades de produtos químicos à solução: 0,651 g de NaHCO3; 0,042 g de NaH2PO4; 0,132 g de CaCl2·2H2O; 0,149 g de KCL; 0,0476 g de MgCl2; 0,999 g de glicose.
  3. Ajuste o pH para 7,4 com HCl e, em seguida, adicione água ultrauso até que o volume total seja de 500 mL.
  4. Oxigene a solução com carbogen por pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente antes de iniciar a gravação.
    NOTA: A composição final da solução de Tyrode será a seguinte (em mM): 137 NaCl, 15,5 NaHCO3, 0,7 NaH2PO4, 1.8 CaCl2, 4 KCl, 1 MgCl2, 11,1 glicose. Esta solução da Tyrode tem uma composição ligeiramente diferente da solução Completa Tyrode usada para dissecção.

4. Preparando a solução de 4-aminopirdina (4-AP) para modulação farmacológica

  1. Faça uma solução de trabalho de 1 mM de 4-AP; adicionar 18,82 mg de 4-AP a 200 mL da solução tyrode a partir do passo 3.
  2. Oxigene a solução 4-AP por pelo menos 30 minutos antes do experimento.

5. Preparando a placa de Petri para dissecção

  1. Misture os componentes do elastômero de silicone em uma proporção de 10:1 (por peso) da base ao agente de cura.
  2. Despeje ~15 mL de mistura de elastômero de silicone em uma placa de Petri de 60 mm de diâmetro.
  3. Deixe que o elastômero cure à temperatura ambiente por 48 h antes de usar.
    NOTA: A placa de Petri siliconada pode ser reutilizada para futuras dissecções.

6. Dissecando o nó sinoatrial (SAN)

  1. Prepare a solução heparinizada completa da Tyrode para dissecção de SAN.
    1. Adicione 400 μL de heparina (1.000 USP/mL) a 40 mL de solução completa de Tyrode e morque em um banho de água de 37 °C.
  2. Injete o rato intraperitonealmente com 200-300 μL de heparina (1000 USP/mL) e permita que o animal se sente por 10 minutos.
  3. Eutanize o rato heparinizado por overdose de isoflurane.
    1. Coloque o mouse em uma pequena câmara de vidro que contenha vapores de isoflurano gerados adicionando 200-300 μL de isoflurane líquido a um papel filtro dentro de um tubo de plástico perfurado.
      NOTA: Como o isoflurano pode causar irritação na pele e também pode ser absorvido pela pele, o líquido não deve entrar em contato diretamente com o camundongo. Portanto, o lenço encharcado de isofrano é colocado em um tubo perfurado para administração.
    2. Verifique a morte por cessação do esforço de movimento e respiração e pela ausência de um reflexo de beliscão do dedo do dedo. A morte geralmente leva cerca de 1-2 minutos após a colocação na câmara.
      NOTA: A morte é geralmente acompanhada de urinação.
  4. Coloque o mouse em uma posição supina em uma placa de dissecção com as patas estendidas e fixe as patas na placa usando agulhas de seringa de 1 polegada de comprimento e calibre 23. Em seguida, remova a pele nas proximidades da parte inferior da caixa torácica usando uma tesoura cirúrgica e cortando a pele nas raízes.
    NOTA: Para uma placa de dissecção, podem ser usadas tampas de refrigerador de poliestireno.
  5. Enquanto segura a pele com um hemostat, use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão transversal na pele logo abaixo do fundo da caixa torácica de cerca do arco costal esquerdo para o arco costal direito(Figura 3A).
  6. Corte o peritônio com uma tesoura cirúrgica e separe cuidadosamente o fígado do diafragma, tomando cuidado para não cortar o fígado, o que causará sangramento excessivo(Figura 3B). Incisar o diafragma ao longo do tórax para expor a cavidade torácica (Figura 3C-D).
  7. Utilizando uma tesoura cirúrgica, corte as paredes laterais da caixa torácica das bordas dos arcos costais até as clavículas para expor o coração, tomando cuidado para evitar danificar o coração(Figura 3D). Em seguida, use uma agulha de seringa calibre 23 para fixar a caixa torácica sobre o ombro, segurando-a no lugar e fora do caminho do campo cirúrgico.
  8. Use uma pipeta de transferência para gotejar quente (37 °C) heparinizado solução completa tyrode para o coração para mantê-lo úmido.
    NOTA: Não deixe o coração secar.
  9. Remova os pulmões segurando-os com fórceps graefe extra finos e cortando a traqueia com uma tesoura cirúrgica(Figura 3E).
  10. Segure o ápice do coração com fórceps graefe extra finos e remova-o cortando a aorta e a cava de venae com uma tesoura cirúrgica. Transfira o coração para uma placa de Petri contendo elastômero de silicone curado(Figura 4A) e use uma pipeta de transferência para banhar o coração com 2-3 mL de solução de Tyrode heparinizada heparinizada.
    NOTA: Tenha cuidado para não danificar a delicada parede posterior da ária direita, que contém a SAN, e as veias atrial direita conectadas. Banhar o coração com a solução completa de Tyrode impede que o coração seque, mas não submerga totalmente o coração em solução, pois prejudicará a visibilidade durante a dissecção.
  11. Oriente o coração com o átrio direito à direita do experimentador e o átrio esquerdo à esquerda do experimentador.
    NOTA: A dissecação do tecido san deve ser feita rapidamente para evitar lesões relacionadas à isquemia.
  12. Coloque o ápice do coração no prato com um pino de dissecção. Em seguida, ao segurar a veia cava inferior com Dumont #2 fórceps de laminectomia, insira uma agulha de seringa de 22 G através da cava vena inferior e superior para localizar sua posição no átrio direito, que também identifica a posição aproximada da SAN (localizada no patch de tecido entre a veia cava inferior e superior(Figura 4B).
  13. Usando pequenos pinos de dissecção, fixar os apêndices atrial esquerdo e direito ao prato.
    1. Enquanto segurava o apêndice atrial esquerdo com Dumont #2 fórceps de laminectomia, coloque um pino de dissecção através do apêndice atrial esquerdo para mantê-lo no lugar.
    2. Enquanto segurava o apêndice atrial direito com Dumont #55 fórceps, coloque um pino de dissecção através do apêndice atrial direito para mantê-lo no lugar.
      NOTA: O mesmo tipo de fórceps pode ser usado para segurar os apêndices atrial esquerdo e direito, se desejar.
  14. Remova a agulha de seringa que abrange a cava de venae.
  15. Para liberar sangue do coração, use a tesoura Castroviejo para remover o ápice do coração (ou seja, a metade inferior) fazendo uma incisão transversal através dos ventrículos(Figura 4C). Em seguida, lave o coração adicionando a solução de Tyrode completa heparinizada com uma pipeta de transferência.
  16. Use a tesoura Castroviejo para cortar ao longo do septo atrioventricular mantendo a incisão mais perto do ventrículo do que a atria. Continue cortando ao longo do septo atrioventricular até que a ária seja separada dos ventrículos.
  17. Corte ao longo do septo interarial para remover o átrio esquerdo.
  18. Coloque pinos de dissecção na periferia do átrio direito para deixá-lo liso(Figura 4D). Remova qualquer gordura, vasos ou tecido restantes do átrio usando a tesoura Castroviejo.
  19. Localize o SAN no átrio direito, que nesta orientação é aproximadamente bordado pela veia cava superior (na parte superior), veia cava inferior (na parte inferior) e cristae terminalis (à esquerda) (Figura 4D).
    NOTA: O terminal crista aparece como uma crista muscular escura entre o apêndice atrial direito e o SAN. Muitas vezes a artéria SAN também pode ser vista correndo através da SAN (Figura 4D).

7. Preparando o sistema MEA para gravação

  1. Adicione a solução de Tyrode (do passo 3) ao frasco de solução de entrada(Figura 5C) e oxigene-o ligando o fluxo de gás carbógeno(Figura 5A) ao sistema.
    NOTA: A solução da Tyrode utilizada para a gravação é ligeiramente diferente na composição da solução completa de Tyrode usada para a dissecção.
  2. Verifique o fluxo de carbogênio observando bolhas no frasco cônico, que é usado para umidificar o gás (Figura 5B), e o frasco de solução de entrada(Figura 5C).
  3. Insira a tubulação de entrada da bomba peristáltica(Figura 5D) na solução de gravação do Tyrode(Figura 5C). Em seguida, insira a tubulação de saída da bomba peristáltica na garrafa de coleta(Figura 5I).
  4. Defina a bomba peristáltica a 25 rpm, o que dá uma vazão de 2 mL/min e inicie a bomba. Verifique se há vazamento ou estouro de buffer no sistema.
  5. Coloque o controlador de temperatura a 37 °C, a temperatura fisiológica dos camundongos(Figura 5E).

8. Colocar o tecido cardíaco na grade MEA

  1. Transfira o tecido de SAN dissecado com a ajuda de uma escova de tinta(Figura 6A) da placa de Petri dissecando para a grade MEA(Figura 1A1).
    1. Ao olhar sob um microscópio invertido, posicione suavemente o tecido com uma escova de tinta macia para que a região de SAN sobreponha a grade de eletrodos.
    2. Reesencular o tecido conforme necessário para garantir que ele esteja plano na grade de eletrodos, fazendo um bom contato com os eletrodos.
      NOTA: É necessário um pincel de tinta macia para mover o tecido para evitar danificar a rede de eletrodos.
  2. Uma vez que o tecido esteja corretamente posicionado, use fórceps ósseos (ou quaisquer fórceps curvos) para colocar a malha sobre o tecido(Figura 6A) . Em seguida, use os fórceps ósseos para colocar a âncora da harpa(Figura 6A) na malha para manter tudo no lugar(Figura 6B).
  3. Tire uma foto do posicionamento do tecido no MEA para que a atividade de eletrodos individuais possa ser correlacionada com sua localização anatômica durante a gravação. Isso pode ser feito segurando um smartphone até o objetivo do microscópio invertido ou usando uma câmera de microscópio anexada.
    NOTA: Se a orientação do MEA não for alterada após a realização da imagem, o eletrodo superior esquerdo aparecerá como o primeiro canal (Ch1) durante a gravação.
  4. Coloque o prato MEA na placa do conector(Figura 5F e 6C) e coloque cuidadosamente a tampa de perfusão(Figura 6C) no prato MEA sem perturbar a âncora da fatia de harpa. A tampa de perfusão pode ser ainda mais fixada usando um pedaço de fita de laboratório(Figura 6C).
    NOTA: Além de ter tubos de entrada e saída de solução ajustáveis, a tampa também possui uma porta para a entrega de gás(Figura 6C). Além disso, o anel de eletrodo de referência atravessa a tampa (Figura 6C).
  5. Deixe que o tecido se recupere do manuseio e aclimata na câmara por 15-20 minutos antes da gravação.

9. Definindo o protocolo de aquisição de dados para gravação

NOTA: As seguintes etapas descrevem a abertura do protocolo de software para gravação espontânea de batidas e definição das condições de gravação. As especificidades dessas etapas podem variar dependendo do software específico que está sendo utilizado, mas o contorno geral deve permanecer o mesmo.

  1. Ligue o amplificador (Figura 5G)e configure um fluxo de trabalho para a gravação no software no computador(Figura 5H).
    1. Abra o software e clique no Fluxo de Trabalho.
    2. Selecione Abrir nova pasta.
    3. Abra a pasta De Modelos.
    4. Selecione 64MD1-1920X1080 (dependendo da resolução do seu desktop).
    5. Abra a pasta QT.
    6. Abra a pasta de gravação espontânea.
    7. Selecione Beat_recording.moflo e abra-o(Figura 7A).
  2. Defina os parâmetros de gravação para especificar o número de vestígios, duração do traço, intervalo de rastreamento, tensão de entrada, taxa de amostragem, etc., de acordo com as condições de gravação desejadas(Figura 7B).
    NOTA: Para a frequência de batidas e aquisição de dados interspike, normalmente usam uma tensão de alcance de entrada de 2,9 mV, um filtro de passe alto de 1-Hz, um filtro de passagem baixa de 1000 Hz e uma taxa de amostragem de 20 kHz.
  3. Para marcar diferentes fases ou condições do experimento, como antes e depois da administração de medicamentos, clique na guia Anotações para adicionar as notações desejadas(Figura 7C).
  4. Para especificar o destino do arquivo para que os dados sejam coletados, selecione a caixa Ativar armazenamento e digite o nome do arquivo desejado na caixa modificador de nome de arquivo.

10. Realizar a gravação e coleta de dados

  1. Clique no botão Gravar e Reproduzir na barra de menu mais alta do software de aquisição para iniciar a gravação. Adquira dados para 10 vestígios de 1 min de duração com intervalos de 2 minutos entre os traços.
  2. A partir desses traços iniciais, verifique se as formas de onda registradas são consistentes com uma preparação de tecido saudável e de alta qualidade, confirmando que a maioria dos canais de gravação exibe amplitudes de sinal de ≥ intervalos interpesados de 0,5 mV e idênticos(Figura 8).
    NOTA: Uma avaliação inicial da atividade e das formas de onda dos microeletrodos individuais correspondentes aos seus locais anatômicos pode ser realizada fazendo referência ao quadro adquirido após o posicionamento do tecido no MEA.
  3. Para medir os efeitos das drogas no tecido, pausa a gravação após a aquisição de dados iniciais da linha de base clicando no botão de pausa na barra de menu superior.
    NOTA: A fase de resposta à droga do experimento pode ser notada na gravação clicando na guia Anotações e adicionando a notação desejada conforme descrito acima(Figura 7C).
  4. Pause a bomba e troque a tubulação de entrada da bomba da solução de gravação normal para a solução de Tyrode contendo a droga desejada de escolha.
    NOTA: No experimento de exemplo, a solução de Tyrode foi utilizada com 1 mM 4-aminopirridina (4-AP).
  5. Reinicie a bomba e desemprese a gravação para começar a coletar dados novamente.
  6. Uma vez que a solução de Tyrode infundida com drogas tenha atingido o tecido, registos da mesma maneira que feito anteriormente para as gravações da linha de base.
    NOTA: Os traços levarão algum tempo para estabilizar à medida que a droga se infundi na câmara de gravação. O mecanismo de ação da droga também pode afetar a estabilidade do registro. Para medicamentos que possuem mecanismos reversíveis de ação, também deve ser registrado um período de lavagem para confirmar a restauração da atividade aos níveis de linha de base, que é um indicador de tecido saudável.
  7. Clique em Parar para concluir as gravações.
  8. Tire uma foto final do posicionamento do tecido no MEA sob o microscópio no caso de o tecido ter se deslocado após o procedimento inicial de configuração de gravação.

11. Limpeza da configuração após a gravação

  1. Limpe o MEA.
    1. Após terminar a gravação, remova suavemente a solução de gravação do prato MEA usando uma micropipette de 1 mL.
      NOTA: Tenha cuidado para não entrar em contato com os eletrodos MEA que podem danificá-los.
    2. Remova a âncora de malha e harpa com fórceps ósseos (ou quaisquer fórceps curvos). Em seguida, use uma escova de tinta para desalojar o tecido da superfície MEA sempre tendo cuidado para não tocar nos microeletrodos individuais.
    3. Usando uma garrafa de lavagem, enxágue suavemente o prato MEA com água ultrapurada cerca de 3 a 4 vezes.
    4. Armazene o MEA limpo imerso em água ultrauso a 4 °C.
  2. Enxágüe a tubulação do sistema executando água ultrauso através dele por pelo menos 5 minutos usando a configuração de velocidade máxima na bomba peristáltica.
    NOTA: Para evitar o crescimento fúngico, nenhuma solução de água ou tampão deve ser deixada dentro da tubulação após a limpeza.

12. Analisando as gravações de MEA para medir a frequência de batidas de SAN

  1. Abra o arquivo de dados gravado salvo no modelo "Beat_frequency_analysis" do software de análise (Figura 9).
  2. Clique no botão Reproduzir e permitir que toda a gravação seja executada para visualizar o conjunto de dados e atribuir parâmetros de análise apropriados.
    1. Selecione a janela binning para o formato de exibição desejado dos dados, se ele é exibido como uma média por traço ou média por tempo(Figura 10A).
    2. Selecione os canais a serem incluídos na análise e defina os valores de limiar de amplitude maxima ou amplitude necessários para identificação automatizada de pico de forma de onda(Figura 10B).
      NOTA: Um canal individual, uma combinação de canais ou todos os 64 canais podem ser selecionados para análise nesta etapa (Figura 9). Se os valores de limiar selecionados estiverem muito próximos dos valores máximos e minimas da forma de onda, alguns picos de forma de onda podem não ser identificados pelo software de análise.
    3. Defina a quantidade de tempo pré-pico e pós-pico a ser incluído na análise.
      NOTA: Configurações de 50 ms pré-pico e 100 ms pós-pico geralmente funcionam bem (Figura 10B).
  3. Depois de definir as condições de análise, clique no botão Reproduzir novamente para refazer o conjunto de dados e confirmar que os parâmetros de análise são apropriados para extração de pico.
  4. Para análise, identifique os três traços consecutivos mais estáveis que apresentam taxa de espancamento estável para cada traço na maioria dos canais, tanto durante o período de base do experimento quanto outros três traços estáveis consecutivos durante o período de exposição à droga (Figura 10A).
  5. Especifique os traços de início e término para análise e digite a duração do tempo de cada traço a ser analisado(Figura 9).
  6. Antes de iniciar a análise, selecione as caixas habilitadoras tanto para salvar batida por minuto quanto para salvar o intervalo interspike (Figura 10B).
  7. Digite o nome do arquivo desejado na caixa modificadora de nome do arquivo (Figura 10B). Os dados analisados para frequência de batida e intervalo de interspike serão salvos na forma do formato ASCII (texto).
    NOTA: Para analisar diferentes condições (como linha de base e resposta a medicamentos), a análise deve ser executada separadamente para cada condição.
  8. Clique no botão Reproduzir e Gravar na barra superior da guia para iniciar a análise.
  9. Para exportar os dados para outros aplicativos, selecione as caixas para salvar batida por minuto e Salvar intervalo interspike (Figura 10B). Digite o nome do arquivo desejado na caixa modificador de nome do arquivo (Figura 10B) e clique em Salvar os dados analisados no formato de texto ASCII na pasta selecionada.

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Resultados

Depois de permitir que o tecido se aclimate no prato por 15 minutos, 10 traços de um min são registrados. Nosso protocolo atual registra atividade por mais de uma hora, mas registramos padrões estáveis de disparo por ≥4 h em dados não mostrados aqui. Se uma preparação experimental for boa para a coleta de dados, cada canal de gravação deve exibir formas de onda recorrentes consistentes e espaçadas uniformemente (ou seja, picos) de forma uniforme para um determinado canal(Figura 11D

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Discussão

Praticar e dominar o processo de dissecção de SAN é imprescindível, uma vez que o tecido é frágil e o tecido saudável é necessário para uma gravação bem sucedida. Durante a dissecção da SAN, a orientação correta é essencial para obter a região adequada do tecido. No entanto, a orientação original do coração pode ser facilmente perdida durante o processo de dissecção, o que complica esse esforço. Portanto, para garantir a orientação adequada à esquerda e à direita, o atria deve ser inspecionado...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, números de subvenções R01NS100954 e R01NS099188.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
4-AminopyridineSigmaA78403-25G
22 gauge syringe needleFisher Scientific14-826-5AUsed for dissection
23 gauge syringe needleFisher Scientific14-826-6CUsed for dissection
60mm Petri DishesGenesee Scientific32-105G
500mL Pyrex BottleFisher Scientific06-414-1CUsed to store solutions
1000 mL Pyrex BottleFisher Scientific06-414-1DUsed to store solutions
Bone ForcepsFine Science Tools16060-11
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)Sigma-AldrichC5080-500G
Carbogen (95% O2, 5% CO2)
Castroviejo Scissors, 4"Fine Science Tools15024-10
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7021-1KG
Data Acquisition PCCPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920x1080
Dissection MicroscopeJenco
Dissecting PinsFine Science Tools26002-20
Dumont #2 Laminectomy ForcepsFine Science Tools11223-20
Dumont #55 ForcepsFine Science Tools11295-51
 Extra Fine Graefe ForcepsFine Science Tools11152-10
Glass ChamberGrainger49WF30Used for mouse euthanization
Harp Anchor KitWarner Instruments SHD-22CL/15 WI 64-0247
HClFisher ChemicalsSA48-4Used for pH balancing
HemostatFine Science Tools13013-14
HeparinAurobindo Pharma Limited IDA, PashamylaramNDC 63739-953-25
HEPESSigma-AldrichH3375-250G
Inverted MicroscopeMoticAE2000
IsofluranePatterson Veterinary07-893-1389
Lab TapeFisher Scientific15-950
Light for Dissection MicroscopeDolan-JennerMI150DG 660000391014
Magesium chloride (MgCl2)Sigma-Aldrich208337-100G
MED64 Head AmplifierMED64MED-A64HE1S
MED64 Main AmplifierMED64MED-A64MD1A
MED64 Perfusion CapMED64MED-KCAP01
MED64 Perfusion Pipe Holder KitMED64MED-KPK02
MED64 ThermoConnectorMED64MED-CP04
Mesh Warner Instruments640246
Microelectrode array (MEA)Alpha Med ScientificMED-R515A
Mobius SoftwareWitWerx Inc.Specific software for the MED64
NaOHFisher ChemicalsS320-500Used for pH balancing
Normal SalineUltigieneNDC 50989-885-17
Paint BrushFisher ScientificNC1751733
ParafilmGenesee ScientificPM-996
Peristaltic PumpGilsonF155009
Peristaltic Pump TubingFisher Scientific14-171-2981/8'' Interior Diameter
PolyethyleneimineSigmaP3143
Potassium chloride (KCl)Sigma-AldrichP9333-500G
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655-500G
Sodium BicarbonateSigmaS6297
Sodium chloride (NaCl)Fisher ScientificS671-3
Sylgruard Elastomer KitDow Corning184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Sodium Phosphate MonobasicSigmaS6566
Sodium tetraborateSigmaS9640
Surgical ScissorsFine Science Tools14074-09
Transfer Pipets (3mL graduated)Samco Scientific225

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