Extração do Cofactor F420 para Análise do Comprimento da Cauda poliglutama de culturas puras e amostras ambientais

Resumo

Um método para a extração do cofato _F420 de culturas puras foi otimizado para a separação e análise cromatográfica líquida do comprimento da cauda _F420 em cultura pura e amostras ambientais.

Resumo

O cofator _F420 desempenha um papel central como portador de hidreto no metabolismo primário e secundário de muitas taxas bacterianas e arqueais. O cofator é mais conhecido por seu papel na methanogênese, onde facilita reações termodinamicamente difíceis. Como a cauda de poliglutamate varia de comprimento entre diferentes organismos, as análises de perfil de comprimento podem ser uma ferramenta poderosa para distinguir e caracterizar diferentes grupos e caminhos em vários habitats. Aqui, o protocolo descreve a extração e otimização da detecção do cofato _F420 aplicando extração em fase sólida combinada com análise de cromatografia líquida de alto desempenho independente de abordagens biológicas culturais ou moleculares. O método foi aplicado para obter informações adicionais sobre a expressão do cofator _F420 de comunidades microbianas em solos, lodo anaeróbico e culturas puras e foi avaliado por experimentos de espiadura. Assim, o estudo conseguiu gerar diferentes perfis de comprimento da cauda _F420 para methanogênios hidroeotróficos e acetoclásticos em culturas puras metogênicas controladas, bem como de amostras ambientais, como lodo digestor anaeróbico e solos.

Introdução

_F420 é um cofator generalizado, mas muitas vezes negligenciado, que funciona como um portador obrigatório de hidreto de dois elétrons em processos metabólicos primários e secundários tanto da Archaea quanto das ^{Bactérias1,2}. _F420 é um 5-deazaflavin e estruturalmente semelhante aos flavins, pelo qual suas propriedades químicas e biológicas são mais comparáveis com as de NAD⁺ ou NADP⁺. Devido à substituição de nitrogênio por carbono na posição 5 do anel isoalloxazine, é um forte redutivo, apresentando assim um baixo potencial de redox padrão de -340 ^mV1,3. _F420 compreende um anel 5-deazaflavin e um linker 2-fospho-L-lactato (_F420-0). Uma cauda oligoglutamate contendo monômeros de glutamato n+1 pode ser anexada à molécula (_F420-n+1)⁴.

Por muito tempo, o cofator _F420 tem sido associado exclusivamente com Archaea e Actinobacteria. Isso foi em grande parte anulado. Análises recentes revelaram que o _F420 está distribuído entre diversos organismos anaeróbicos e aeróbicos da filo Proteobacteria, Cloroflexi, e potencialmente firmicutes que habitam uma miríade de habitats como solos, lagos e intestino ^humano1,5. Em 2019, Braga et ^al.6, mostraram que o proteobacterium Paraburkholderia rizoxinica produz um derivado _F420 único, contendo um 3-fosfoglicerate em vez de uma cauda de 2 fosfolactato, que pode ser difundida em vários habitats. Dentro do domínio Archaea, _f420 foi encontrado em várias linhagenias, incluindo methanogenic7, methanotrófico8,9, e ordens redutoras de sulfato10, e deve ser produzido em Thaumarchaeota11. _F420 é mais conhecido como uma coenzima redox essencial em methanogênese metilotrófica e metilotrófica. A forma reduzida de _F420 (_F420H2) funciona como um doador de elétrons para a redução de metilenotetrahidromedromedetina (metileno-H4MPT, Mer) e mehenyl-H4MPT12,13. Também pode ser usado como um porta-elétrons em vias de transporte de elétrons independentes de _H2 de methanogênios contendo citocromes12,14. Além disso, a forma oxidada de _F420 tem uma fluorescência azul-esverdeada característica após a excitação a 420 nm, o que facilita a detecção de methanogênios microscopicamente (Figura 1). Devido ao seu baixo potencial de redox, _f420 facilita (i) a redução exógena de um amplo espectro de compostos orgânicos recalcitrantes ou tóxicos, (ii) síntese de antibióticos tetracítricos e lincosamidas ou fitotoxinas em estreptomices (filo Actinobacteria), e (iii) resistência ao estresse oxidativo ou nitrosativo ou outras condições desfavoráveis em micobactérias (filo Actinobacteria)^1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Consequentemente, os oxidoreductases dependentes de _F420 são biocatalysts promissores para fins industriais e farmacêuticos, bem como para a bioremediação de ambientes ^{contaminados1,23}. Apesar dessas descobertas recentes, os papéis exatos do cofator _F420 ainda são marginalmente conhecidos em Actinobacteria ou outras bactérias.

Há pelo menos três caminhos para a biosíntese _F4202,6,24. No início, a via da biossíntese é dividida em uma biosíntese de 5 deazaflavinas e um ramo metabolismo de 2 fosfolactato. A parte reativa da molécula _F420 é sintetizada via _FO-synthase usando os substratos tyrosine e 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinadiona. O resultado é o nível de riboflavina cromohore _FO. Dentro do ramo de metabolismo de lactato atualmente aceito, o L-lactato é fosfoilado a 2-phospho-L-lactato por um L-lactato kinase (CofB); 2-phospho-L-lactato, por sua vez, é guanylated para L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine por 2-phospho-L-lactate guanylyltransferase (CofC). No próximo passo, L-lactil-2-diphospho-5'-guanosine é ligado à _FO por um 2-phospho-L-lactato transferase (CofD) para formar _F420-02. Finalmente, a enzima _F420-0:ɣ-glutamyl liga os monômeros glutamato para _F420-0, formando o cofator ^final6 em números variados23,25. Diferentes organismos apresentam padrões diferentes no número de resíduos de glutamato anexados, com caudas mais curtas encontradas para methanogênios do que em micobactérias2,25,26. Geralmente, os metanogens mostram comprimentos de cauda de dois a três, com até cinco no metanogena actolástico, methanosarcina sp., enquanto os comprimentos da cauda encontrados em Mycobacterium sp. variaram de cinco a sete resíduos de glutamato2,25,26,27. No entanto, descobertas recentes mostraram que a _F420 de cadeia longa se liga a oxidoreductases dependentes da _F420 com uma afinidade maior do que a _F420 de cadeia curta; além disso, o _F420 de cadeia longa ligado aumenta a afinidade do substrato, mas diminui a taxa de rotatividade das respectivas ^enzimas23.

A detecção do cofato _F420 é frequentemente baseada em sua fluorescência. Assim, seus derivados de glutamato oligo foram separados por meio de fase inversa (RP)-^HPLC27,28. Recentemente, Ney et al. usaram hidróxido de tetrabutylammonium como um reagente de emparelhamento de íons para a cauda de glutamato carregada negativamente para melhorar a separação em RP-HLPC com ^sucesso5. Aqui, apresentamos um método para a preparação de amostras, posteriormente, extração, purificação, separação e quantificação do cofato _F420 não apenas de culturas puras, mas também de diferentes amostras ambientais (ou seja, solos e lodo digestor).

Protocolo

NOTA: A extração e análise do cofato _F420 é um processo de três etapas, incluindo lise amostral, pré-purificação de cofato por extração em fase sólida (SPE) e detecção de cofatores através de RP-HPLC (IP-RP-HPLC) com detecção de fluorescência. Antes de iniciar, prepare os materiais e reagentes conforme indicado na Tabela 1.

1. Lise amostral

1. Adicione até 5 g de amostra aos tubos apropriados (por exemplo, tubos cônicos de 50 mL).
2. Adicione 5 mL do tampão de lise (solução de estoque 2x, Tabela 1) às amostras.
3. Leve a um volume final de 10 mL com água destilada para atingir uma concentração final de 0,5 g·^mL-1.
4. Vórtice as amostras diluídas para 20 s.
5. Autoclave por 30 min a 121 °C.
6. Para amostras secas como solo florestal, traga para um volume final de 20 mL com água destilada após autoclaving e vórtice a amostra diluída.
   ATENÇÃO: O aumento da temperatura durante a autoclavagem pode causar a explosão dos tubos.

2. Pré-purificação do cofator F ₄₂₀ através de extração em fase sólida (SPE)

NOTA: Todas as etapas da SPE são conduzidas à temperatura ambiente

1. Esfrie as amostras em temperatura ambiente.
2. Centrifugar as amostras autoclavadas por 5 min a 11.000 x g.
3. Prepare 5 mL SPE colunas preenchidas com 100 mg de sorbent polimérico de modo misto de ânion fraco.
4. Condiciona o trocador de ânion com 3 mL de metanol (solução de condição, Tabela 1).
5. Equilibre o trocador de ânion com 3 mL de água destilada (solução de equilíbrio, Tabela 1).
6. Carregue até 9,0 mL do supernascido do lysate centrifuso na coluna SPE.
7. Lave as impurezas com 5 mL de acetato de amônio de 25 mM (solução de lavagem spe 1, Tabela 1).
8. Lave as impurezas com 5 mL de metanol (solução de lavagem spe 2, Tabela 1).
9. Elute o cofator _F420 em 1,0 mL de tampão de eluição (Tabela 1).
   NOTA: Prepare o tampão de eluição fresco. Devido ao vácuo aplicado e à alta pressão de vapor do tampão de elução, os volumes de eluição podem diferir de amostra para amostra. Para garantir o mesmo volume final em todas as amostras, recomenda-se pesar os vasos de coleta antes e depois da eluição e calcular o volume de eluição eficaz. Equilibre as diferenças com a adição de tampão de elução.

3. Detecção do cofator _F420

1. Coloque o forno a 40 °C e detector de fluorescência a 420 nm de comprimento de onda de extinção e comprimento de onda de emissão de 470 nm. Obter separação via modo gradiente utilizando as fases móveis A e B (Tabela 1): 0-3 min: 26% B; 3-24 min: 26%-50% B; 24-25 min: 50% B; 25-27 min: 50%-26% B; 27-35 min: 26% B a uma vazão de 0,75 mL·^min-1.
   NOTA: Garantia de equilíbrio das condições da coluna antes da injeção de amostras, lavando a coluna pelo menos com volumes de 3 colunas de 74% de fase móvel A e 26% de fase B móvel (Tabela 1).
   1. Filtre as amostras elucidadas da SPE em frascos HPLC usando um filtro PTFE com um tamanho de poro de 0,22 μm.
      NOTA: Recomenda-se os filtros PTFE com um tamanho de poros de 0,22 μm.
   2. Injete 50 μL da amostra elucida no sistema HPLC para analisar a composição e concentração do cofato _F420 .
      NOTA: Como nenhum padrão quantitativo é usado neste protocolo, amostras e variantes devem ser comparadas por área de pico.

Resultados

Culturas puras de termófila de metanosarcina e termofílico de Metanoculleus, ambos termofílicos methanogênicos Archaea, foram cultivadas em mídia adequada, como descrito anteriormente29,30. Para a termófila de metanoosacina, o metanol foi usado como fonte de energia, enquanto o termofílico de Metanoculleus foi cultivado em _H2/_CO2. O crescimento foi verificado pela avaliação microscópica,...

Discussão

Para a avaliação do cofator _F420 a partir de culturas puras metogênicas, pode-se realizar uma avaliação microscópica para visualizar o crescimento e a atividade (microscopia de fluorescência) dos microrganismos envolvidos (Figura 1). Para amostras derivadas de ambientes naturais, o uso de microscopia para detectar ou quantificar _f420 é limitado devido a interferências com outros microrganismos fluorescentes, partículas orgânicas e inorgânicas. Neste contexto...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclave
Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector	Shimadzu		HPLC system
Centrifuge and rotor for 50 mL “Falcon” tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes
HPLC Column: Gemini NX C18, 5 μm, 150 x 3 mm	Phenomenex		HPLC column
PTFE filter (pore size 0.22 µm) to remove particulate matter prior HPLC analysis
Resin for SPE: Strata-X-AW 33 μm as weak anion mixed-mode polymeric sorbent	Phenomenex		weak anion mixed-mode polymeric sorbent
Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes			SPE equipment
Vortex mixer